Dissociazione di campioni di tessuto tumorale umano e di topo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula
16 agosto 2024
Questo protocollo delinea la procedura per dissociare rapidamente campioni di tumore umano e di topo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
Lo scopo della nostra ricerca è studiare i meccanismi di risposta o resistenza nelle immunoterapie standard di cura. Il nostro laboratorio sta cercando di capire cosa guida una risposta immunitaria di successo contro i tumori e se possiamo identificare questi predittori della terapia per trovare bersagli in grado di superare la resistenza. Il più grande progresso degli ultimi anni è stato lo sviluppo e l'integrazione di tecniche di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
Ci consentono in tempo reale di studiare sistematicamente le caratteristiche molecolari delle singole cellule in modo imparziale, il che è utile nella dissezione di questi ecosistemi tumorali complessi e in evoluzione. Mentre molti modelli preclinici vengono utilizzati per studiare i meccanismi di risposta all'immunoterapia, non conosciamo ancora i determinanti immunologici che sono importanti nell'immunità umana. L'elaborazione e l'analisi dei campioni dei pazienti in tempo reale è fondamentale per la nostra capacità di studiare tutti i compartimenti cellulari all'interno di un determinato tumore.
Utilizzando tecniche genomiche e trascrittomiche imparziali, il nostro laboratorio ha scoperto che i difetti nel meccanismo di presentazione dell'antigene sono associati alla resistenza all'immunoterapia nel melanoma. Più recentemente, utilizzando approcci a singola cellula, abbiamo scoperto stati unici delle cellule T e polarità delle cellule mieloidi associati agli esiti dei pazienti rispettivamente nel melanoma e nel cancro della testa e del collo. Il più grande vantaggio del nostro protocollo risiede nella sua semplicità.
Si tratta di un protocollo universale regolato per la dissociazione di campioni tumorali piccoli e grandi da più tipi di cancro in un breve periodo di tempo, che termina con la generazione di sospensioni unicellulari altamente vitali.
Panoramica
Questo protocollo descrive la procedura per la rapida dissociazione di campioni tumorali umani e murini per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Questa tecnica è fondamentale per comprendere la risposta immunitaria contro i tumori e identificare i predittori della resistenza alle terapie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Analisi a singola cellula
Sfondo
- Comprensione dei meccanismi di risposta o resistenza alle immunoterapie.
- Importanza dell'elaborazione e analisi in tempo reale dei campioni del paziente.
- Sviluppo di tecniche di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
- Necessità di indagare i compartimenti cellulari all'interno dei tumori.
Scopo dello studio
- Studiare la risposta immunitaria contro i tumori.
- Identificare predittori del successo terapeutico.
- Superare la resistenza alle immunoterapie standard.
Metodi Utilizzati
- Sequenziamento dell'RNA a singola cellula
- Dissociazione rapida di campioni tumorali
- Analisi in tempo reale di caratteristiche molecolari
- Indagine sugli ecosistemi tumorali
Risultati principali
- Informazioni sui meccanismi di risposta immunitaria.
- Identificazione dei determinanti immunologici chiave.
- Maggiore comprensione dei microambienti tumorali.
- Target potenziali per superare la resistenza alle terapie.
Conclusioni
- Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è fondamentale per l'analisi dei tumori.
- Il processamento in tempo reale aiuta a comprendere i tumori complessi.
- La ricerca futura può concentrarsi sui predittori identificati della terapia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La dissociazione rapida e universale di tessuti tumorali umani e murini è un fattore abilitante fondamentale per le linee guida di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) nella scoperta in immunooncologia. Sospensioni cellulari singole ad alta vitalità influenzano direttamente la fedeltà del profilo molecolare successivo, favorendo una valida conferma del bersaglio e una riduzione dei rischi meccanicistici. Questo protocollo affronta un punto critico nella ricerca traslazionale garantendo la qualità del campione per analisi ad alta risoluzione del repertorio cellulare e immunitario.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'eterogeneità del microambiente tumorale a risoluzione monocellulare.
- Consente l'identificazione degli stati delle cellule immunitarie e tumorali associati alla risposta o resistenza alla terapia.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici preservando le popolazioni cellulari sensibili e minimizzando gli artefatti indotti da stress.
- Migliora l'affidabilità predittiva nella selezione degli obiettivi grazie a letture cellulari di alta qualità.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce sospensioni cellulari singole valide e vitali per scRNAseq e saggi multi-omici.
- Standardizza la preparazione del campione tra diversi tipi di tumore e dimensioni del campione, inclusi biopsie con basso input.
- Riduce la cross-contaminazione e gli artefatti di RNA ambientale, migliorando la riproducibilità del saggio.
- Consente una preparazione scalabile per lo screening ad alto rendimento di fenotipi di cellule tumorali e immunitarie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli output della dissociazione alla scoperta di biomarcatori traslazionali e al profilo del repertorio immunitario.
- Mantiene la continuità dai campioni derivati dai pazienti alla validazione in modelli preclinici.
- Supporta l' avanzamento basato sulla valutazione del rischio fornendo dati ad alta fedeltà per il confronto interspecie.
- Permette l' identificazione di programmi cellulari clinicamente rilevanti e di meccanismi di resistenza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di dissociazione si colloca all'interfaccia tra l'acquisizione del tessuto e il profilo molecolare a singola cellula, fungendo da ponte tra la fase iniziale della scoperta e i flussi di lavoro della ricerca traslazionale.
- Biologia della Scoperta: Fornisce input di alta qualità per la verifica delle ipotesi e l'analisi dei percorsi nell'immunologia tumorale.
- Screening: Garantisce sospensioni cellulari quantitative e riproducibili a singola cellula per saggi scRNAseq e CITEseq successivi.
- Analisi: Fornisce metriche robuste sulla vitalità e concentrazione cellulare per supportare analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca Translazionale: Permette l'associazione diretta dei dati derivati dai pazienti a sistemi di modelli preclinici per la validazione di biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Offre un protocollo universale e adattabile, adatto a diversi tipi tumorali e contesti di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella scoperta in immunooncologia.
- Valore operativo: Semplifica la preparazione dei campioni con flussi di lavoro standardizzati e rapidi, producendo elevata vitalità cellulare.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti, consentendo la generazione di dati affidabili a singola cellula.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e lo sviluppo di bersagli e biomarcatori per immunoterapia, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nella digestione enzimatica e nella preparazione di saggi a singola cellula.
- Necessita dell'accesso a contatori cellulari, separatori magnetici e infrastrutture di biosicurezza.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per garantire la riproducibilità tra diversi tipi di tumore e dimensioni del campione iniziale.
- Adattabile sia a campioni umani che murini, inclusi piccoli biopsie e resezioni di grandi dimensioni.
- È necessario monitorare la vitalità del campione e la risposta allo stress per assicurare la qualità dei dati.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:40
Rapid Dissociation of Tumor Tissue to Gain Enhanced Single‐Cell Tumor Insights
2:59
Red Blood Cell Lysis in Digested Tumor Samples for Single‐Cell RNA Sequencing
4:03
Dead Cell Removal from Dissociated Tumor for Single‐Cell Sequencing
