Name: Smussatura a umido degli aghi per microiniezione che utilizza una pressione dellaria costante per un feedback sullapertura dellago (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Impara la tecnica di smussatura pneumatica per aghi di borosilicato utilizzata nella creazione di insetti geneticamente modificati. Questo metodo garantisce controllo preciso dell'apertura dell'ago per microiniezioni di alta qualità.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo per la smussatura a umido degli aghi per microiniezione a pressione d'aria costante

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microcapillari con diametro esterno di 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olio per piedistallo smussato</td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>Clip per parafango per bicicletta</td><td>VeloOrange</td><td>R-clip Confezione da 4</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>Boom Stand Microscopio</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscopio o equivalente</td></tr><tr><td>BV-10 Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Piastra abrasiva diamantata&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>Piastra abrasiva diamantata - extra fine (da 0,2 &micro; a 1,0 &micro; dimensioni della punta)</td></tr><tr><td>Guarnizione, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>Utilizzato per sigillare il collegamento su connettori a T o a L, se non già incluso con questi pezzi</td></tr><tr><td>Tubo Clamp</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Connettore per tubo flessibile</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>Necessita di 5 connettori per tubi flessibili</td></tr><tr><td>Supporto per ago per microiniezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10</td><td>Supporto per aghi per microcapillari con diametro esterno di 1 mm</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Qualsiasi estrattore per aghi</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Solution</td><td>B& H Foto, Video e Audio</td><td>BH #KOPF200P&nbsp; MFR #1464510</td><td>agente bagnante</td></tr><tr><td>Manometro</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>Calibro 0-100 psi</td></tr><tr><td>Stoppino di riferimento</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>Porta stoppino di riferimento</td><td>Sutter Instruments</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td><td>Bisogno di porte #10-32 per i collegamenti</td></tr><tr><td>Foglio di imballaggio in gomma 6 inx 6 in</td><td>Danco</td><td>Modello # 59849</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo a T</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr>Barra <td></td><td></td><td>filettata</td><td>Barra filettata o barra con estremità filettata. I fili devono essere 10-32.</td></tr><tr><td>Tubo in uretano</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

smussatura a umido degli aghi per microiniezione che utilizza una pressione dell'aria costante per un feedback sull'apertura dell'ago

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

La procedura sopra descritta produce aghi per microiniezione costantemente affilati. Gli aghi affilati sono caratterizzati dalla capacità di inserirsi in embrioni di insetti morbidi corion, come gli embrioni di zanzara, con poca o nessuna resistenza da parte della membrana embrionale. Quando gli embrioni di zanzara vengono microiniettati per la modificazione genetica, la membrana embrionale è relativamente elastica. Spingere un ago smussato contro la membrana dell'embrione ne causerà l'indentazione (Figura 4B). Quando l'ago viene tirato indietro, la membrana riacquista la sua forma. Con una pressione sufficiente, l'ago smussato alla fine strapperà la membrana e l'embrioplasma probabilmente fuoriuscirà. Più affilato è l'ago, minore è la rientranza quando l'ago viene premuto contro la membrana dell'embrione (Figura 4E). Invece di strappare la membrana, un ago affilato scivolerà attraverso la membrana, causando danni minimi o nulli all'embrione. Con un ago ideale, non ci sarà quasi nessuna rientranza della membrana embrionale poiché l'ago scivola nell'embrione.
L'Università del Maryland Insect Transformation Facility (UM-ITF) è una struttura di servizi che crea insetti geneticamente modificati per clienti nel mondo accademico e nell'industria. La struttura utilizza aghi smussati per la microiniezione di embrioni di zanzara. Nel periodo compreso tra gennaio 2023 e dicembre 2023, l'UM-ITF ha iniettato 12.795 embrioni di Aedes in 56 progetti clienti (Tabella 1). L'uso di aghi smussati ha aiutato l'UM-ITF a mantenere un portello medio post-iniezione del 31% in tutti i progetti (Tabella 2). Inoltre, l'UM-ITF è stato in grado di mantenere un tasso di successo dell'iniezione del 96%, come determinato dal follow-up post-progetto con i clienti (Tabella 2). Il successo dell'iniezione è una misura del fatto che i materiali di iniezione (guide CRISPR, proteina Cas9, plasmidi vettori di trasposoni, ecc.) iniettati siano stati consegnati negli embrioni del progetto in un modo in cui questi materiali sono stati in grado di creare una modificazione genetica, in pratica, c'erano prove della creazione di CRISPR Indel, dell'inserimento del vettore basato sul trasposone del cliente o dell'inserimento di un vettore di controllo della qualità dell'iniezione (il trasposone termina con un promotore più un marcatore). In altre parole, le iniezioni erano abbastanza buone da produrre modificazioni genetiche, se i componenti iniettati funzionavano correttamente. Ci sono molti fattori che contribuiscono al successo di un progetto di modificazione genetica e le microiniezioni di qualità con aghi affilati sono un fattore chiave di successo. La smussatura degli aghi utilizzando la procedura descritta nel protocollo di cui sopra consente all'UM-ITF di produrre costantemente aghi per microiniezione affilati di qualità, consentendo quindi all'UM-ITF di eseguire iniezioni costantemente efficaci.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma schematico dei componenti del sistema dell'aria e collegamento al microcapillare. L'aria viene erogata all'ago capillare attraverso un sistema di tubi di uretano da un'alimentazione d'aria (aria domestica o bombola d'aria). I tubi in uretano sono collegati al regolatore (R) e al manometro tramite raccordi per tubi flessibili (HC), che sono costituiti da un connettore per tubo flessibile e da una fascetta stringitubo. Il raccordo del tubo si avvita in un raccordo femmina filettato 10-32 sulla base del regolatore (R) e del manometro. Un connettore a T (T) è collegato al regolatore (R) per far fuoriuscire l'aria tra il manometro e il portaspillo (NH). Il tubo in uretano è collegato al portaago tramite un connettore luer (LC) fornito con il portaago (NH). Il collegamento all'alimentazione dell'aria varia a seconda dell'alimentazione dell'aria utilizzata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg"> Figura 2: Parti del manipolatore e configurazione dell'aria. Parti del manipolatore: a. manopola di regolazione grossolana, b. manopola di regolazione fine, c. calibro, d. portaago WPI, e. calibro angolare, f. morsetto di fissaggio e clip per parafango della bicicletta, g. adattatore luer e connettore per tubo luer e h. tubo in uretano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg"> Figura 3: Posizionamento dell'ago in relazione alla rotazione del piatto abrasivo. (A) Posizionamento corretto dell'ago durante la smussatura. L'ago da smussare deve essere posizionato sulla piastra abrasiva rotante orientata da qualche parte tra la perpendicolare alla rotazione e in linea con la rotazione, dove la rotazione si allontana dalla punta dell'ago. (B) Posizionamento errato dell'ago. La rotazione della piastra abrasiva in questo orientamento fa sì che la superficie della piastra abrasiva spinga sulla punta dell'ago piuttosto che sotto e oltre la punta. In questo orientamento, la smussatura potrebbe non avvenire in modo uniforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg"> Figura 4: Confronto tra l'inserimento dell'ago con aghi non affilati e affilati. (A-C) ago non affilato e (D-F) ago affilato. (A) e (D) sono stati catturati prima che l'ago entrasse in contatto con l'embrione; (B) ed (E) si trovano nel punto immediatamente precedente alla perforazione della membrana embrionale da parte dell'ago, mentre (C) e (F) si trovano subito dopo la perforazione dell'ago. La freccia bianca in (B) indica l'indentazione della membrana embrionale perché è necessario applicare una pressione maggiore affinché un ago non affilato possa perforare. La freccia nera in (E) indica la mancanza di rientranza dovuta al piercing dell'ago che si fa facilmente grazie a un ago affilato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Progetti UM-ITF Aedes da gennaio 2023 a dicembre 2023. Elenco dei progetti di microiniezione UM-ITF Aedes con il numero di embrioni iniettati per ciascun progetto, il numero di larve nate da questi embrioni iniettati e la percentuale di larve che si sono schiuse per embrione iniettato totale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: I risultati del progetto Aedes UM-ITF. L'UM-ITF è una struttura di servizi che fornisce servizi di microiniezione per la modificazione genetica degli insetti. La tabella elenca il numero di progetti Aedes iniettati da ITF da gennaio 2023 a dicembre 2023. Il numero di clienti che hanno risposto alle richieste di follow-up del progetto in cui la risposta indicava il successo o il fallimento del progetto di iniezione. Il numero di progetti di successo, in cui un progetto di successo è stato quello in cui i materiali di iniezione sono stati microiniettati in un momento e in un luogo tali da consentire alle iniezioni di produrre una modificazione genetica, e il numero di progetti che sono stati considerati non riusciti a causa della mancanza di modificazione genetica. Il tasso medio di schiusa per i progetti di microiniezione Aedes nel periodo da gennaio 2023 a dicembre 2023. Il tasso di successo del progetto e il tasso di risposta del cliente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Smussatura a umido degli aghi per microiniezione che utilizza una pressione dell'aria costante per un feedback sull'apertura dell'ago

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

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Biologia

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