Name: Isolamento dei mitocondri per lanalisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Impara l'isolamento dei mitocondri per analizzare i supercomplessi respiratori da piccoli campioni di tessuto e colture cellulari. Questo metodo consente di studiare l'organizzazione del sistema OXPHOS e il ruolo dei mitocondri nelle malattie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione numero "PGC2018-095795-B-I00" dal Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) e dalle sovvenzioni "Grupo de Referencia: E35_17R" e dalla sovvenzione numero "LMP220_21" dalla Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) a PF-S e RM-L.

Frazionamento mitocondriale in piccoli campioni di tessuto per l'analisi di supercomplessi

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Gli adattamenti metodologici introdotti nei protocolli qui descritti hanno lo scopo di evitare perdite e aumentare la resa mantenendo le attività del complesso mitocondriale (che è cruciale quando la disponibilità di quantità sufficienti di campioni è compromessa) e riprodurre il modello atteso di SC del tessuto o della linea cellulare (vedi Figura 2C). A questo scopo e poiché non è richiesta un'elevata purezza mitocondriale per rilevare correttamente le SC, il numero di passaggi, tempi e volumi è stato ridotto ogni volta che ciò è stato possibile.
Pertanto, dopo l'omogeneizzazione e la rimozione dei nuclei e delle cellule integre mediante centrifugazione a bassa velocità, i surnatanti contenenti i mitocondri vengono trasferiti in provette di polipropilene da 1,5 mL e le successive centrifugazioni per ottenere le frazioni mitocondriali grezze vengono eseguite in microfuga aumentando la velocità e riducendo i tempi e i volumi rispetto ai protocolli convenzionali. Ciò consente l'elaborazione di diversi campioni in un tempo relativamente breve: una stima precisa è che 10 campioni possono essere processati in ~2-2,5 ore (dall'inizio dell'omogeneizzazione (fase del protocollo 1.6. o equivalente per i tessuti) all'ottenimento della frazione SCs pronta per essere caricata in un gel (fase del protocollo 3.7) e minimizza le perdite pur mantenendo le attività. Un'altra modifica rispetto ai protocolli originali dei gruppi di Schägger consiste nel sostituire, dopo la solubilizzazione della membrana per l'ottenimento della frazione SCs, una fase di ultracentrifugazione con una semplice centrifugazione in microfuga (fase del protocollo 3.4).
Ci sono alcuni passaggi critici nella procedura. In primo luogo, l'efficienza della rottura cellulare, specialmente nel caso di cellule in coltura (vedi nota dopo la fase 1.8 del protocollo) e in particolare nel caso di piccole cellule. I tessuti e le linee cellulari presentano un grado di difficoltà variabile nella rottura cellulare: ad esempio, nel cuore e nel muscolo, questo passaggio è solitamente meno efficiente che nel fegato o nella milza, ma è compensato in resa perché i primi hanno un contenuto mitocondriale più elevato. Un'alternativa per migliorare la resa mitocondriale quando isolati dal muscolo o dal cuore sarebbe il trattamento di campioni con tripsina prima dell'omogeneizzazione. Il cervello è un altro tessuto che presenta una bassa efficienza nella rottura cellulare a causa dell'omogeneizzazione manuale, che è più lieve e meno efficiente, e probabilmente anche a causa della maggiore variazione nei tipi di cellule in questo tessuto, come è stato riportato in precedenza 42. Questo può essere parzialmente compensato da una seconda fase di omogeneizzazione come suggerito nel nostro protocollo (fase 2.7.4). D'altra parte, se la rottura cellulare è eccessiva, il campione finale contenente SC potrebbe essere contaminato da frammenti di DNA nucleare che potrebbero interferire con il funzionamento elettroforetico. Questo problema si manifesta come un aumento della viscosità del campione quando viene aggiunta digitonina per solubilizzare le membrane mitocondriali e può essere risolto mediante trattamento con DNAsi I.
In secondo luogo, se il rapporto detergente/proteina è troppo basso, ciò comporterebbe una solubilizzazione della membrana meno efficiente e la possibilità di formazione di aggregati. Ciò potrebbe manifestarsi nei gel come scarsa risoluzione nelle SC ad alto peso molecolare (vedi Figura 4) o come CIV che fornisce bande multiple corrispondenti agli oligomeri43. Se il rapporto è troppo elevato, potrebbe portare alla disaggregazione delle SC (principalmente CI-SC). In terzo luogo, è importante evitare di riscaldare i campioni durante l'intera procedura (vedere la Figura 4) ed evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento poiché possono influire sullo stato di assemblaggio SC.
Nella Tabella 2, viene presentato un riepilogo delle rese attese per diversi tipi di cellule e campioni di tessuto. I valori sono approssimativi e dipenderanno dall'efficienza di rottura della cella e dalla natura della fonte. Nel caso dei tessuti, se il materiale di partenza è congelato tende a dare una resa maggiore rispetto ai campioni freschi. Viene presentata una stima del numero di corsie (considerando un carico compreso tra 50 e 60 μg di proteina mitocondriale per corsia) che possono essere caricate.
I protocolli qui presentati coprono una varietà di tessuti e tipi di cellule con piccole variazioni, possono essere utilizzati con campioni freschi o congelati e richiedono attrezzature semplici e un costo relativamente basso, non comportando l'uso di costosi kit di purificazione o gradienti. Tuttavia, potrebbero richiedere alcuni adattamenti per essere utilizzati con particolari tipi di cellule o campioni, nonché quando specifiche popolazioni mitocondriali, come i mitocondri sinaptici cerebrali o i mitocondri subsarcolemmali muscolari, ad esempio, sono oggetto di analisi.
Poiché i ruoli fisiologici precisi e il potenziale coinvolgimento delle SC in situazioni patologiche devono ancora essere definiti, è necessaria l'analisi della loro dinamica e dei fattori che ne influenzano l'assemblaggio, la stabilità e la funzione. I nostri protocolli possono rappresentare strumenti preziosi che consentono di ottenere risultati riproducibili su pattern di SC con campioni di piccole dimensioni e da una varietà di tipi cellulari e tessuti, in particolare quando è necessario confrontare più condizioni sperimentali29.

I supercomplessi (SC) sono associazioni supramolecolari tra singoli complessi della catena respiratoria 1,2. Dall'identificazione iniziale delle SC e dalla descrizione della loro composizione da parte del gruppo di Schägger 2,3, successivamente confermata da altri gruppi, è stato stabilito che esse contengono i complessi respiratori I, III e IV (CI, CIII e CIV, rispettivamente) in diverse stechiometrie. Si possono definire due principali popolazioni di SC, quelle contenenti CI (e CIII da solo o CIII e CIV) e con peso molecolare molto elevato (MW, a partire da ~1,5 MDa per le SC più piccole: CI + CIII2) e quelle contenenti CIII e CIV ma non CI, con dimensioni molto più piccole (come CIII2 + CIV con ~680 kDa). Queste SC coesistono nella membrana mitocondriale interna con complessi liberi, anche in proporzioni diverse. Così, mentre l'IC si trova principalmente nelle sue forme associate (cioè nelle SC: ~80% nel cuore bovino e più del 90% in molti tipi di cellule umane)3, l'ICV è molto abbondante nella sua forma libera (più dell'80% nel cuore bovino), con CIII che mostra una distribuzione più equilibrata (~40% nella sua forma libera più abbondante, come un dimero, nel cuore bovino).
Mentre la loro esistenza è ora generalmente accettata, il loro ruolo preciso è ancora oggetto di dibattito 4,5,6,7,8,9,10. Secondo il modello di plasticità, possono esistere diverse proporzioni di SC e singoli complessi a seconda del tipo di cellula o dello stato metabolico 1,7,11. Questa natura dinamica dell'assemblaggio consentirebbe alle celle di regolare l'uso dei combustibili disponibili e l'efficienza del sistema di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) in risposta ai cambiamenti ambientali 4,5,7. Le SC potrebbero anche contribuire a controllare il tasso di generazione delle specie reattive dell'ossigeno e partecipare alla stabilizzazione e al turnover dei singoli complessi 4,12,13,14. Sono state descritte modificazioni dello stato di assemblaggio delle SC in associazione con diverse situazioni fisiologiche e patologiche15,16 e con il processo di invecchiamento17.
Pertanto, sono stati descritti cambiamenti nei pattern SC nel lievito a seconda della fonte di carbonio utilizzata per la crescita2 e nelle cellule di mammifero in coltura quando il glucosio è sostituito dal galattosio4. Sono state riportate anche modifiche nel fegato di topo dopo il digiuno8 e negli astrociti quando l'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali è bloccata18. Inoltre, una diminuzione o alterazioni delle SC e dell'OXPHOS sono state riscontrate nella sindrome di Barth19, nell'insufficienza cardiaca20, in diversi disturbi metabolici21 e neurologici 22,23,24 e in diversi tumori 25,26,27,28. Se queste alterazioni nell'assemblaggio e nei livelli di SC siano una causa primaria o rappresentino effetti secondari in queste situazioni patologiche è ancora oggetto di studio15,16. Diverse metodologie possono fornire informazioni sull'assemblaggio e la funzione delle SC; Questi includono le misurazioni dell'attività 8,29, l'analisi ultrastrutturale30,31 e la proteomica32,33. Un'alternativa utile che viene sempre più impiegata ed è il punto di partenza per alcune delle metodologie precedentemente menzionate è la determinazione diretta dello stato di assemblaggio SC mediante elettroforesi Blue native (BN) sviluppata a questo scopo dal gruppo di Schägger34,35.
Questo approccio richiede procedure riproducibili ed efficienti per ottenere e solubilizzare le membrane mitocondriali e può essere integrato da altre tecniche come l'analisi dell'attività in-gel (IGA), l'elettroforesi di seconda dimensione e il western blot (WB). Un limite negli studi sulla dinamica delle SC mediante elettroforesi BN può essere la quantità di cellule di partenza o campioni di tessuto. Presentiamo una serie di protocolli per l'analisi dell'assemblaggio e della funzione delle SC, adattati dai metodi di gruppo di Schägger, che possono essere applicati a campioni di cellule o tessuti freschi o congelati a partire da un minimo di 20 mg di tessuto.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Acido aminocaproico</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp; benzidina (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Senza acidi grassi BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Pestello in teflon</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Anticorpo monoclonale</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Da 3 a 12% Mini Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Additivo per tampone catodico (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Anticorpo monoclonale</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium sale (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF Membrana</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Fenazina metasolfato (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substrato</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Anticorpo monoclonale</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Succinato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina/penicillina</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Anticorpo monoclonale</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Negli ultimi decenni, le prove accumulate sull'esistenza di supercomplessi respiratori (SC) hanno cambiato la nostra comprensione dell'organizzazione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, dando origine alla proposta del "modello di plasticità". Questo modello postula la coesistenza di diverse proporzioni di SC e complessi a seconda del tessuto o dello stato metabolico cellulare. La natura dinamica dell'assemblaggio nelle SC consentirebbe alle celle di ottimizzare l'uso dei combustibili disponibili e l'efficienza del trasferimento di elettroni, minimizzando la generazione di specie reattive dell'ossigeno e favorendo la capacità delle celle di adattarsi ai cambiamenti ambientali. 
Più recentemente, sono state riportate anomalie nell'assemblaggio SC in diverse malattie come le malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer e Parkinson), la sindrome di Barth, la sindrome di Leigh o il cancro. Il ruolo delle alterazioni dell'assemblaggio SC nella progressione della malattia deve ancora essere confermato. Tuttavia, la disponibilità di quantità sufficienti di campioni per determinare lo stato dell'assemblaggio SC è spesso una sfida. Questo accade con biopsie o campioni di tessuto che sono piccoli o devono essere divisi per analisi multiple, con colture cellulari che hanno una crescita lenta o provengono da dispositivi microfluidici, con alcune colture primarie o cellule rare, o quando si deve analizzare l'effetto di trattamenti particolarmente costosi (con nanoparticelle, composti molto costosi, ecc.). In questi casi, è necessario un metodo efficiente e facile da applicare. Questo articolo presenta un metodo adattato per ottenere frazioni mitocondriali arricchite da piccole quantità di cellule o tessuti per analizzare la struttura e la funzione delle SC mitocondriali mediante elettroforesi nativa seguita da saggi di attività in-gel o western blot.

Le rese dei mitocondri ottenute seguendo i protocolli sopra descritti variano a seconda di diversi fattori come la linea cellulare o il tipo di tessuto, la natura dei campioni (ad esempio, se vengono utilizzati tessuti freschi o congelati) o l'efficienza del processo di omogeneizzazione. Le rese attese di mitocondri da diverse linee cellulari e tessuti sono raccolte nella Tabella 2. Una volta ottenute le frazioni mitocondriali, il passo successivo è l'analisi del pattern delle SC respiratorie, che viene eseguita dopo la solubilizzazione del campione mitocondriale grezzo e la separazione elettroforetica mediante BN-PAGE seguita da analisi IGA o immunorilevazione WB. La Figura 1 mostra l'aspetto delle corsie di gel non colorate subito dopo la corsa e il modello delle bande dopo la colorazione standard di Coomassie di una linea cellulare in coltura e di un campione mitocondriale di fegato di topo.
Nella Figura 2A, B, si possono osservare chiare differenze tra i modelli di assemblaggio SC nelle cellule umane e di topo dopo l'uso dei saggi IGA. Pertanto, il complesso I libero è osservato nelle cellule di topo mentre non è rilevabile nei mitocondri umani. Il pattern IV-IGA complesso è molto simile in entrambe le linee cellulari umane (Figura 2B) mentre presenta differenze tra le due linee cellulari di topo analizzate nella Figura 2A. Queste differenze sono dovute al fatto che le cellule BL6 esprimono una variante mutante di SCAF18.
I pattern SC, ottenuti con il protocollo per l'isolamento mitocondriale qui descritto per lavorare con piccoli campioni, sono mantenuti rispetto ai protocolli "convenzionali" utilizzati per campioni più grandi. Ciò può essere visto nella Figura 2C, confrontando le corsie 1 e 6 (ottenute dopo isolamento mitocondriale utilizzando un protocollo convenzionale da 3 g di fegato e 1,1 g di BAT) con, rispettivamente, le corsie 2 e 5 (ottenute utilizzando i protocolli qui presentati da circa 0,1 g di entrambi i tessuti). Come proposto nel modello di plasticità, la proporzione relativa di complessi respiratori e SC varia a seconda del tipo di cellula e dello stato metabolico. Come mostrato nella Figura 2C, D, i diversi tessuti mostrano diversi modelli di assemblaggio SC. Pertanto, i mitocondri cerebrali mostrano livelli molto bassi di complesso libero I e una percentuale più elevata di SC rispetto agli altri tessuti, e il BAT è caratterizzato da bassi livelli di CV (Figura 2A) e alte quantità di SC III + IV (Figura 2D). I mitocondri cardiaci presentano alti livelli di SC e CV. I modelli di assemblaggio CV sono molto simili tra la linea cellulare in coltura e un campione mitocondriale di fegato di topo (Figura 2E).
L'assemblaggio SC può anche essere analizzato mediante WB come mostrato nella Figura 3 per due campioni ottenuti dal controllo della milza e dalle cellule tumorali. In questo caso, 30-50 μg di proteina mitocondriale sono solitamente sufficienti per rilevare i diversi complessi e SC con gli anticorpi specifici. La Figura 4 mostra alcune delle principali insidie che possono verificarsi durante l'applicazione di questi protocolli. Gradienti di gel errati possono produrre modelli di migrazione anormali e indesiderati come nella Figura 4A, corsia 1, dove le SC rimangono vicine al pozzetto nella parte superiore della corsia a causa di una concentrazione di acrilammide superiore al normale nel gel. L'incubazione dei campioni, anche per tempi relativamente brevi, ad alte temperature (qui 37 °C e 40 °C per 10 min) provoca la degradazione di SC e CI (Figura 4A corsie 2-4). Allo stesso modo, il rapporto detergente/proteine è fondamentale per ottenere buoni risultati e un'adeguata risoluzione del gel. Al di sotto di un rapporto di 2 g di digitonina/g di proteine, la risoluzione della banda si riduce progressivamente e alla concentrazione più bassa (0,5 g/g) è visibile solo uno striscio nell'area corrispondente alle SC (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> Figura 1: Pattern di complessi mitocondriali e supercomplessi dopo la separazione BNGE di mitocondri permeabilizzati con digitonina da una linea cellulare di coltura (L929Balbc) e fegato di topo. Le corsie a sinistra (1 e 2) rappresentano l'aspetto del gel non colorato subito dopo la corsa, dove è rilevabile solo CV, mentre le corsie a destra (3 e 4) mostrano lo schema delle bande dopo la colorazione di Coomassie. Abbreviazioni: BNGE = Elettroforesi su gel nativo blu; CV = complesso V; SC = supercomplessi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> Figura 2: Analisi IGA di mitocondri isolati da diverse linee cellulari e tessuti di topo. (A,B) Attività in gel dei complessi indicati nei mitocondri isolati da (A) linee cellulari di topo o (B) umane. L929Balbc è una linea cellulare trasmettitocondriale generata nel nostro laboratorio trasferendo mitocondri da piastrine di topo Balb/cJ a cellule ρ°L929neo come descritto in precedenza40,41. I fibroblasti BL6 sono una linea cellulare immortalizzata generata nel nostro laboratorio da una biopsia dell'orecchio di un topo BL6. (C) Modelli CI-IGA da mitocondri di topo isolati utilizzando un metodo convenzionale a partire da 3 g di fegato (corsia 1) e con 1,1 g di BAT (corsia 6) o il protocollo qui presentato e iniziando con circa 0,1 g di tessuto in tutti i casi (corsia 2, fegato; corsia 3, cuore; corsia 4, cervello e corsia 5 BAT). (D) Modelli CIV-IGA (eseguiti dopo CI-IGA mostrato nel pannello 2C, corsie 2-5) nel fegato, nel cuore, nel cervello e nei mitocondri BAT di topo. (E) Attività CV-IGA analizzata in cellule di topo in coltura e fegato. Sono stati caricati circa 60-75 μg di proteina mitocondriale per corsia. Abbreviazioni: IGA = attività in-gel; SC = supercomplessi; CI = complesso I; BAT = tessuto adiposo bruno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> Figura 3: Immunorilevazione WB dei diversi complessi mitocondriali e supercomplessi in campioni di milza. Dopo la separazione Blue Native PAGE dei complessi mitocondriali e delle SC ottenuti da campioni di controllo della milza (Milza M9) e del tumore (Tumore M9), questi sono stati trasferiti su una membrana PVDF e ibridati in sequenza con anticorpi che riconoscono le subunità CI, CIII, CIV e CII indicate (pannelli A-D, rispettivamente). Sono stati caricati circa 50 μg di proteina mitocondriale per corsia. Gli asterischi indicano il segnale rimasto da un precedente western blot. Abbreviazioni: SC = supercomplesso; CI = complesso I; CIII = complesso III; CIV = complesso IV; CII = complesso II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> Figura 4: Insidie nell'analisi SC di Blue-Native PAGE. Analisi CI IGA di mitocondri isolati da (A) fegato di topo fresco e (B) fegato di ratto congelato in diverse condizioni di solubilizzazione. (A) Corsia 1, concentrazione del gradiente di gel errata (8-13% invece del normale 3-13%). Corsie 2-4, campioni incubati per 10 minuti su ghiaccio o rispettivamente a 37 °C e 40 °C prima del caricamento. (B) Pattern dopo IGA per IC di mitocondri ottenuti da fegato di ratto congelato utilizzando diversi rapporti digitonina/proteina per la solubilizzazione. Abbreviazioni: SC = supercomplesso; PAGE = elettroforesi su gel di poliacrilammide; CI = complesso I; IGA = attività in gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Medio</td>
			<td colspan="3">Composizione</td>
		</tr><tr><td>Tampone ipotonico</td>
			<td colspan="3">10 mM MOPS, 83 mM saccarosio, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampone ipertonico</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM saccarosio, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampone di omogeneizzazione A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M saccarosio, pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>tampone di omogeneizzazione AT</td>
			<td colspan="3">225 mM di mannitolo, 1 mM di EGTA, 75 mM di saccarosio, 0,01% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>tampone di omogeneizzazione AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM di mannitolo, 1 mM di EGTA, 75 mM di saccarosio, 0,02% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampone di campionamento BN</td>
			<td colspan="3">50 mM di NaCl, 50 mM di imidazolo, 2 mM di acido aminocaproico, 1 mM di EDTA pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di digitonina</td>
			<td colspan="3">10% di digitonina in 50 mM di NaCl, 50 mM di imidazolo, 5 mM di aminocaproico, 4 mM di PMSF</td>
		</tr><tr><td>Buffer di caricamento BN</td>
			<td colspan="3">5% Coomassie Blue G in acido 0,75 M aminocaproico</td>
		</tr><tr><td>tampone catodico BN A</td>
			<td colspan="3">50 mM di tritina, 15 mM di Bis-Tris pH =7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (blu brillante di Coomassie G-250)</td>
		</tr><tr><td>tampone catodico BN B</td>
			<td colspan="3">50 mM di tricina, 15 mM di Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250</td>
		</tr><tr><td>Tampone anodico BN</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris, pH=7,0</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA complesso I</td>
			<td colspan="3">5 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL NADH, 2,5 mg/mL Nitroblue Tetrazolium (NBT)</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA del complesso II</td>
			<td colspan="3">50 mM di tampone fosfato di potassio pH 7,4, 20 mM di sodio succinato, 0,2 mM di fenazina metosolfato (PMS), 2,5 mg/mL di NBT</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA del complesso III</td>
			<td colspan="3">50 mM Tampone fosfato di potassio pH 7,2, 0,05% diaminobenzidina (DAB)</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA del complesso IV</td>
			<td colspan="3">Stessa soluzione di CIII più 50 μM di citocromo c</td>
		</tr><tr><td>Substrato IGA complesso V</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM glicina pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>Soluzione colorante</td>
			<td colspan="3">Colorante Coomassie R-250 allo 0,25% in metanolo al 40% e acido acetico al 10%</td>
		</tr><tr><td>Soluzione decolorante/fissante</td>
			<td colspan="3">40% metanolo, 10% acido acetico</td>
		</tr><tr><td>Buffer di trasferimento</td>
			<td colspan="3">48 mM Tris, 39 mM Glicina, 20% metanolo</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Buffer e composizione dei media.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tipo di cellula/tessuto</td>
			<td>Importo di partenza</td>
			<td>Resa prevista (μg di proteina mitocondriale)</td>
			<td>Numero di corsie (50-60 μg/corsia)</td>
		</tr><tr><td>Cellule in coltura</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>Derivato da 143B</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200-350 μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>Fibroblasti di topo</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150-200 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>Cuore</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>Muscolo scheletrico</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>Fegato</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>Milza</td>
			<td>50 mg</td>
			<td>150-250 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>PIPISTRELLO</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>200-300 μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>Cervello</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>250-300 μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Rese attese di mitocondri da diversi tipi di cellule e tessuti di topo. Le frazioni mitocondriali ottenute dal cuore o dal muscolo scheletrico sono più pure di quelle ottenute da altri tessuti. Pertanto, è possibile caricare quantità minori nei gel (*).

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

La nostra ricerca è focalizzata su una migliore comprensione della biogenesi mitocondriale, in particolare, dell'organizzazione e della regolazione del sistema OXPHOS, e anche sulla definizione del ruolo che i mitocondri svolgono in malattie che vanno dal cancro alle malattie neurodegenerative. I mitocondri svolgono molteplici ed essenziali ruoli nella cellula, condizionandone l'intero metabolismo e la sopravvivenza. Stiamo lentamente aumentando la nostra conoscenza della complessità mitocondriale e del suo contributo ai meccanismi di adattamento cellulare in salute e malattia.Abbiamo contribuito a stabilire un nuovo modello organizzativo per il sistema OXPHOS, il modello di plasticità che integra le proposte precedenti e presuppone la coesistenza di super complessi e complessi liberi in diverse proporzioni per ottimizzarne la funzione e consentire adattamenti cellulari. Il nostro protocollo consente di partire da piccoli tessuti o campioni di colture cellulari per ottenere quantità sufficienti di proteine mitocondriali per analizzare l'assemblaggio, lo stato e la funzione dei super complessi mediante elettroforesi nativa blu o altre tecniche. Possiamo farlo in modo riproducibile in poco tempo con un'attrezzatura semplice e relativamente con costi contenuti.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Questo video descrive la procedura per isolare i mitocondri dai tessuti del cancro ovarico umano utilizzando la centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione a gradiente di densità. I mitocondri isolati possono essere utilizzati per l'analisi proteomica del proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano.

Isolamento mitocondriale: una tecnica per isolare i mitocondri da un campione di tessuto di cancro ovarico umano

Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è &lt;30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Come i mitocondri sono solo una piccola percentuale della cellula vegetale, hanno bisogno di essere purificato per una serie di studi. I mitocondri possono essere isolati da una varietà di organi vegetali di omogeneizzazione, seguita da centrifugazione in gradiente di differenziale e densità per ottenere una frazione altamente purificata mitocondriale.

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

I mitocondri sono specializzati ribosomi che divergevano dalle loro controparti batteriche e citoplasmatici. Qui vi mostriamo come mitoribosomes può essere ottenuta dal loro vano nativo in cellule HEK. Il metodo prevede l'isolamento dei mitocondri da cellule in sospensione e conseguente purificazione di mitoribosomes.

Rapido isolamento dei Mitoribosome da cellule HEK

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Presentiamo un protocollo in due fasi per l'isolamento dei mitocondri di alta qualità che è compatibile con la scoperta e la quantificazione delle proteine su scala proteoma. Il nostro protocollo non richiede ingegneria genetica ed è quindi adatto per studiare i mitocondri da qualsiasi cellula e tessuto primario.

Isolamento dei mitocondri senza tag in due fasi per migliorare la scoperta e la quantificazione delle proteine

Studi bioenergetici e metabolomici sui mitocondri hanno rivelato il loro ruolo multiforme in molte malattie, ma i metodi di isolamento per questi organelli variano. Il metodo qui descritto è in grado di purificare mitocondri di alta qualità da più fonti di tessuto. La qualità è determinata dai rapporti di controllo respiratorio e da altre metriche valutate con la respirometria ad alta risoluzione.

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori 

Impara l'isolamento dei mitocondri per analizzare i supercomplessi respiratori da piccoli campioni di tessuto e colture cellulari. Questo metodo consente di studiare l'organizzazione del sistema OXPHOS e il ruolo dei mitocondri nelle malattie.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari

Esplora altri video