Istituzione di un modello di embolia polmonare minimamente invasivo per ratti utilizzando coaguli di sangue autologhi

Lo scopo della nostra ricerca è migliorare l'affidabilità e la riproducibilità di modelli di roditori per embolia polmonare che imitano la fisiopatologia umana. Il nostro obiettivo è quello di rispondere a come le tecniche minimamente invasive vengono utilizzate per indurre modelli di EP, sperando che facilitino lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. I nostri protocolli generano coaguli di sangue autologhi in modo standard e indotte modelli di EP di roditori chirurgici con un'invasività minima, migliorando così l'affidabilità e la riproducibilità degli esperimenti sull'EP sugli animali. Abbiamo rivelato che la risoluzione dei coaguli è veloce nei roditori. Questo spiega perché un modello di ipertensione polmonare tromboembolica cronica è difficile da stabilire. Le tecniche di visualizzazione del coagulo qui riportate guideranno lo sviluppo di un modello animale CTAP affidabile. Siamo un laboratorio congiunto di ingegneria biomedica e team clinici cardiovascolari. Con questo modello, il nostro laboratorio si concentrerà sullo sviluppo di nuove strategie di prevenzione tromboembolica e delle complicanze per l'EP basate su soluzioni avanzate di biomateriali.

[Narratore] Per iniziare, posizionare l'animale anestetizzato sulla piattaforma operatoria in posizione supina. Estendere entrambi i quattro arti orizzontalmente dal corpo ed estendere gli arti posteriori per esporre adeguatamente la zona inguinale. Usando del nastro adesivo, fissare l'animale in questa posizione. Usa un rasoio elettrico per radere i peli intorno allo sterno e all'inguine. Quindi spalmare la crema depilatoria sui peli residui e disinfettare la pelle tre volte con iodio povidone. Inserire verticalmente un ago da 27 gauge collegato a una siringa da un millilitro a una profondità di otto millimetri per perforare la vena cava cranica sinistra o destra. Quindi tenere la siringa e tirare delicatamente indietro lo stantuffo per creare una pressione negativa all'interno del cilindro. Estrarre gradualmente l'ago fino a quando il sangue non entra. Quindi mantenere quella posizione fino a quando non vengono raccolti 0,3 millilitri di sangue. Per la preparazione del coagulo di sangue, spingere il sangue raccolto in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi aspirare il sangue nel tubo di silicone del generatore di trombi autocostruito fino a quando la colonna sanguigno non è lunga 10 centimetri. Attendere 30 minuti per consentire al sangue di coagulare. Quindi sciacquare la colonna di sangue del trombo in una capsula di Petri contenente soluzione fisiologica normale. Successivamente, usando le forbici sottili, tagliare la colonna trombica in coaguli di sangue uniformi, ciascuno lungo quattro millimetri. Aspirare da 15 a 25 coaguli nell'iniettore autocostruito preriempito con due millilitri di soluzione fisiologica normale. Dopo aver disinfettato l'area chirurgica del ratto anestetizzato, praticare un'incisione cutanea di cinque millimetri sopra l'origine dei vasi epigastrici superficiali nella zona inguinale. Utilizzando uno stereomicroscopio con ingrandimento 10x, separare un sottile strato di grasso sottocutaneo per esporre i vasi epigastrici superficiali. Isolare accuratamente la vena epigastrica superficiale dall'arteria, dal nervo e dal tessuto adiposo. Quindi controlla il lato distale con un 8-0 sutura sterile e bloccare la sutura con un micro morsetto. Controlla il lato prossimale con un 8-0 Anello di sutura sterile collegato a un altro micro morsetto. Legare l'ansa distale e sezionare la vena con un cauterizzatore. Successivamente, praticare una piccola incisione trasversale sul lato distale della vena isolata e lavare il sangue rimanente nel lume della vena con soluzione fisiologica. Una volta che la vena è chiara, utilizzare delle micro pinzette per allargare l'incisione venosa. Per l'embolizzazione, inserire delicatamente l'ago dell'iniettore autocostruito nella vena attraverso l'incisione venosa. Fissare l'ago con un terzo morsetto per evitare che scivoli fuori dalla vena. Quindi spingere lentamente lo stantuffo per somministrare una piccola quantità di soluzione fisiologica. Continuare a spingere lo stantuffo per somministrare coaguli nella vena femorale attraverso l'accesso superficiale della vena epigastrica. Legare la vena con la sutura prossimale. Infine, sutura l'incisione. Dopo l'eutanasia del ratto con sovradosaggio di isofluran, tagliare le costole con grandi forbici e aprire il torace evitando danni ai polmoni e ai grandi vasi. Ora inserisci l'ago del dispositivo di infusione nel ventricolo sinistro. Aprire la valvola del dispositivo di infusione per consentire l'infusione di soluzione salina eparinizzata. Usando le forbici, tagliare la vena cava inferiore e l'appendice sinistra per consentire il drenaggio. Controlla la velocità di perfusione a 50 millilitri al minuto. Dopo la perfusione, utilizzando una siringa da 10 millilitri riempita con una soluzione di paraformaldeide al quattro percento, perforare il tronco dell'arteria polmonare attraverso il ventricolo destro. Fissare il tessuto polmonare eseguendo la profusione di paraformaldeide al quattro percento attraverso i polmoni per un volume totale di 30 millilitri. Per la visualizzazione dell'albero arterioso polmonare, aggiungere una quantità uguale di diluente al composto di colata in silicone. Dopo aver frullato la miscela, aggiungere il cinque percento di indurente e frullare nuovamente la miscela. Quindi aspirare un millilitro di miscela in una siringa da un millilitro. Espellere l'aria e inserire l'ago nel tronco dell'arteria polmonare attraverso il ventricolo destro. Premere delicatamente lo stantuffo per consentire alla miscela di colata di silicone di riempire l'albero arterioso polmonare. Metti l'intera massa in una capsula di Petri prima di conservarla in un frigorifero a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire alla miscela di colata di cristallizzare. Immergere i polmoni in sequenza in soluzioni di alcol etilico al 25%, 50%, 75%, 95% e 100% ciascuna per 24 ore. Immergere i polmoni disidratati nel salicilato di metile per 24 ore. Subito dopo l'embolizzazione, i polmoni estratti mostravano coaguli di sangue autologhi e aree con infarto polmonare. Un carico più elevato di emboli ha provocato un'area più ampia di infarto polmonare. Rispetto ai campioni polmonari prelevati immediatamente dopo l'embolizzazione, i campioni polmonari raccolti 24 ore dopo l'embolizzazione hanno mostrato aree infartuate marcatamente ridotte, indicando un forte potenziale intrinseco di fibrinolisi nei ratti. Questa figura mostra l'albero arterioso polmonare dopo il calco e la pulizia dei tessuti per i polmoni normali e per i polmoni di embolia polmonare.