Name: Imaging e quantificazione della vascolarizzazione epatica dei topi mediante ecografia Doppler ultraveloce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Impara a valutare la vascolarizzazione epatica nei topi con ecografia Doppler ultraveloce non invasiva. Questo metodo consente la quantificazione precisa del volume ematico epatico senza agenti di contrasto.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ecografia Doppler ultraveloce per l'analisi della microvascolarizzazione epatica nei topi

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</ol>

<table><tbody><tr><td>(Idrossipropil)metilcellulosa HPMC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509</td><td>0,5% Centrifuga HPMC</td></tr><tr><td>ZentriMix 380 R</td><td>Hettich</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 50 mL coniche Sterili in polipropilene</td><td>Provette CELLSTAR</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Punte in cotone</td><td>Meditip Clean</td><td>G80215</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>nelle vicinanze farmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650-5X5ML</td><td>sterile</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>FRESENIUS KABI</td><td>010-0622-1</td><td></td></tr><tr><td>Ago di alimentazione, riutilizzabile</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>18064-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinze con punta fine Dumont #5 pinze</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Garze 5 x 5 cm</td><td>Klinipress</td><td>175 004</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Versione 9</td><td></td></tr><tr><td>Script di analisi GUI</td><td>Inserm</td><td>gui_analysis.m</td><td>necessita di una scansione Doppler da 10 ms</td></tr><tr><td>Termoforo 17 x 17 cm, 6 W</td><td>ThermoLux</td><td>Acculux 461265</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 mL e 0,5 mL</td><td>BD Microfine + Demi</td><td>25636</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina Anesketina</td><td>Dechra</td><td>REG NL 111764</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Tergicristallo a basso contenuto di lanugine</td><td>KIMTECH ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio 19 mm x 50 m x 0,125 mm</td><td>Software Stokvis</td><td>M451</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Versione R2022b</td><td></td></tr><tr><td>Crema idratante</td><td>nelle vicinanze farmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago giallo 30G 0,3 x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico Oculentum Simplex</td><td>Aggiunto Pharma</td><td>220201</td><td></td></tr><tr><td>Fazzoletti di carta</td><td>in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennarello da laboratorio permanente</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina fisiologica (NaCl 0,9%)</td><td>FRESENIUS KABI</td><td>B102986</td><td></td></tr><tr><td>sterile Contenitore monouso per oggetti taglienti Medical Dispo 2,5 L</td><td>APmedical</td><td>UN3291</td><td></td></tr><tr><td>Provette sterili da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 1 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 20 mL Luer-Lok</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>West Bend</td><td>40053</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Exacta Aesculap</td><td>GT416</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafast piattaforma ecografica</td><td>Iconeus & &nbsp; INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART</td><td>Iconeus Un prototipo</td><td>con una sequenza di 10ms</td></tr><tr><td>Gel di trasmissione degli ultrasuoni Aquasonic 100</td><td>Parker Laboratories INC.</td><td>BT-025-0037N Serbatoio</td><td></td></tr><tr><td>dell'acqua stampato in 3D 10 x 10 x 1,5 cm polimetilpentene (PMP) 0,125 mm</td><td>GoodFellow Cambridge limited</td><td>ME311100/2</td><td>file CAD su richiesta</td></tr><tr><td>Xilazina Sedamun</td><td>Dechra</td><td>REG NL 10084</td><td>20 mg/mL</td></tr></tbody></table>

imaging e quantificazione della vascolarizzazione epatica dei topi mediante ecografia doppler ultraveloce

Imaging and Quantification of the Hepatic Vasculature of Mice Using Ultrafast Doppler Ultrasound

Seguendo il protocollo, l'imaging della vascolarizzazione epatica è facilitato sulla base della standardizzazione delle strutture anatomiche e della terminologia corrispondente (Figura 1). Per proporre una nomenclatura standardizzata per i ricercatori che utilizzano modelli epatici preclinici, abbiamo mostrato schematicamente il posizionamento comune del fegato nella cavità addominale dei topi (Figura 1A), fornito la disposizione strutturale dei diversi lobi epatici (Figura 1B) e specificato la rete vascolare arteriosa (Figura 1C). Dotato di competenze anatomiche, l'imaging UFUS in vivo è stato eseguito utilizzando un serbatoio d'acqua stampato in 3D per ridurre gli artefatti di movimento (Figura 2A). L'impedenza acustica è stata corretta introducendo la sonda nell'acqua e applicando il gel di trasmissione degli ultrasuoni direttamente sulla pelle rasata dell'animale. Adottando questa configurazione, la respirazione e altri artefatti di movimento sono ridotti poiché la sonda non è a diretto contatto con il torace e l'addome in movimento dell'animale. In questo modo, abbiamo visualizzato la struttura vascolare dei lobi destro e sinistro, che sono facilmente accessibili dagli UFUS a causa della loro posizione superficiale (Figura 2B). Altri lobi epatici, come il caudato e il lobo quadrato, sono situati più in profondità nel corpo, rendendo più difficile identificare anatomicamente il sistema vascolare epatico correttamente da parte dell'UFUS.
Avendo dimostrato l'importanza di indicazioni e interpretazioni anatomiche standardizzate e comunemente accettate delle strutture vascolari, abbiamo eseguito più scansioni Doppler su vari piani per fornire una panoramica completa della vascolarizzazione epatica visualizzata da UFUS con mezzo di contrasto nei topi (Figura 3). Abbiamo delineato la rete arteriosa epatica dei singoli lobi epatici, cioè i lobi laterale sinistro (LL), mediale sinistro (LM), laterale destro (RL) e mediale destro (RM). Inoltre, le arterie principali sono etichettate, come l'aorta addominale (AA), l'arteria epatica (HA), l'arteria epatica laterale sinistra (LLHA) e l'arteria epatica mediale destra (RMHA). È importante notare che i lobi del fegato possono essere posizionati in modo leggermente diverso a seconda della posizione e del movimento peristaltico dell'intestino tenue (SM), nonché dello stato di riempimento dello stomaco (S). Questa panoramica con mezzo di contrasto dell'intera vascolarizzazione del fegato di topo fornisce un atlante vascolare completo per l'imaging epatico in vivo mediante UFUS.
Un'accurata selezione dei piani anatomici è fondamentale per ottenere una lettura quantitativa derivata da un lobo epatico. È possibile ottenere misurazioni affidabili del volume sanguigno selezionando manualmente 10 regioni di interesse (ROI) per piano (Figura 4A). Per una quantificazione affidabile del volume sanguigno del microcircolo, è necessaria un'acquisizione stabile con una bassa variazione dell'intensità media dell'immagine. Questo è determinato in base al valore medio dell'immagine (MIV) dell'intera immagine nel tempo (Figura 4B), a differenza di una registrazione suscettibile di artefatti di movimento significativi (Figura 4C). Per gestire gli artefatti da movimento, è stata utilizzata la selezione automatica di un basso MIV per una quantificazione affidabile delle misurazioni del volume ematico epatico (Figura 4D) tracciando la deviazione standard di tutti i bassi MIV temporali di un'intera immagine (Figura 4E). Le scansioni Doppler di più piani per animale mostrano un'accettabile intra e intervariabilità all'interno e tra i topi di 3 diverse coorti dopo il trattamento anomalo su 30 ROI per animale con test ROUT 1% (Figura 4F). Per migliorare la stima del volume sanguigno per animale, si consiglia di registrare piani aggiuntivi o di aumentare il numero di ROI selezionati per aereo. Inoltre, le letture del volume ematico possono essere utilizzate per monitorare il trattamento farmacologico, mirando in particolare alla microvascolarizzazione. Somministrando il veicolo attraverso due vie di somministrazione, abbiamo dimostrato che non vi è alcun effetto sulle misurazioni del volume ematico epatico (Figura 4G). Questi risultati indicano che la delezione genica o la somministrazione del trattamento non sono influenzate dalla somministrazione del veicolo, garantendo un solido disegno sperimentale. Nel complesso, viene fornito un protocollo quantitativo oggettivo e riproducibile per la ricerca futura per esplorare i difetti vascolari epatici in vari modelli murini.
<img alt="Diagrammi anatomici del fegato dei roditori; Include lobi, arterie, vene marcate." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Anatomia del fegato murino. (A) Panoramica schematica del posizionamento del fegato nella cavità addominale sotto il diaframma del topo. (B) Descrizione schematica del fegato murino con quattro lobi epatici, cioè lobo sinistro, quadrato, caudato e destro, e la triade porta costituita dalla vena porta, dall'arteria epatica e dal dotto biliare. (C) Illustrazione schematica della rete arteriosa del sistema vascolare tattile. Identificazione delle arterie epatiche (HA) e dei rami (ramo) con nomenclatura latina fornita. Abbreviazione: HA = Arteria epatica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Configurazione ecografica con mouse, che mostra il diagramma dei lobi della cistifellea e del fegato e i risultati della scansione UFUS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) della vascolarizzazione epatica nei topi. (A) Panoramica schematica del setup sperimentale per l'imaging non invasivo in vivo . (B) Illustrazioni schematiche della direzione dell'imaging e dei rappresentanti associati del lobo mediale destro e sinistro, nonché del lobo laterale sinistro, ripresi da UFUS. Abbreviazione: AA = Addominali dell'aorta, LLL = Lobo laterale sinistro, LML = Lobo mediale sinistro, RML = Lobo mediale destro. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Tomografia ottica; diagramma anatomico; segmenti di fegato, prospettiva craniale e caudale; analisi delle immagini." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) rappresentativa con mezzo di contrasto della vascolarizzazione epatica murina. Una panoramica dell'intera vascolarizzazione epatica di un topo adulto ripreso in 3 posizioni, cioè laterale destra, mediale e laterale sinistra, in 4 piani dal cranio verso la caudale. Il riferimento è situato direttamente sotto il diaframma ripreso in mediale e 1 cm lateralmente a destra e a sinistra, con gli stessi piani in direzione caudale. Abbreviazione: AA = Aorta addominali, HA = Arteria epatica, LLL = Lobo laterale sinistro, LLHA = Arteria epatica laterale sinistra, LML = Lobo mediale sinistro, RLL = Lobo laterale destro, RMHA = Arteria epatica mediale destra, RML = Lobo mediale destro, SI = Intestino tenue, S = Stomaco. Barra graduata 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Immagini al microscopio, grafici di dati; Analisi neurovascolare, confronto della profondità del piano, grafici statistici." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) misurazione quantitativa del volume del sangue epatico. (A) Rappresentanti del lobo mediale (ML) di topi adulti di controllo C57BL/6 wildtype nel piano 1 selezionato sotto il diaframma, corrispondente a 0 mm, piano 2 a -0,3 mm e piano 3 a -0,6 mm con una selezione di 10 regioni di interesse (ROI). Barra scala 1 mm. Illustrazione del Power Doppler di 30 secondi con (B) acquisizione stabile (grigio) e (C) movimento del tessuto (rosso) basato su valori medi dell'immagine in unità arbitrarie (A.U.) dell'intera immagine per la valutazione quantitativa. (D) Riconoscimento automatico di basse intensità (A.U.) per la misurazione quantitativa del volume ematico nel tempo. (E) Deviazione standard (St. Deviation) di basse intensità tracciate per identificare acquisizioni instabili (rosso) causate da artefatti di movimento indicati da un taglio della media complessiva (μ) dal numero (N) di animali da 3 coorti con 2 SD (2σ) valutazione della deviazione standard (SD) di basse intensità (A.U.) in condizioni fisiologiche (grigio) in topi adulti di controllo C57BL/6 wildtype. (F) La quantificazione delle variazioni del volume del sangue misurate in vivo nel tempo in media su 3 piani, ovvero 30 ROI in totale per animale, è rappresentata come intensità di pixel (A.U.). Rilevamento dei valori anomali mediante test ROUT 1%. (G) Non vi è alcuna differenza tra il tipo di veicolo di consegna e il percorso di somministrazione. La coorte 1 (n=6) ha ricevuto un'iniezione intraperitoneale (ip) di soluzione fisiologica, la coorte 2 (n=3) iniezione ip di DMSO e la coorte 3 (n=6) somministrazione orale (po) di cellulosa. ANOVA unidirezionale con test di confronto multiplo di Dunnett, ns P &gt; 0,05. Abbreviazione: A.U. = Unità arbitrarie, DMSO = Dimetilsolfossido, ip = Intraperitoneale, po = Somministrazione orale, ROI = Regione di interesse, St. Deviazione = Deviazione standard, UFUS = Ecografia Doppler ultraveloce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) script quantitativo delle misurazioni del volume del sangue epatico. Script gui_analysis.m fornisce un'interfaccia grafica per il posizionamento automatico della regione di interesse (ROI) per le misurazioni del volume del sangue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/gui_analysis.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Imaging e quantificazione della vascolarizzazione epatica dei topi mediante ecografia Doppler ultraveloce

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the ...

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