Name: Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: Scopri come generare organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali per studiare la tolleranza immunologica e l'autoimmunità. Questo protocollo supporta la maturazione delle cellule epiteliali timiche per la timopoiesi in vitro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ricreare il microambiente timico con organoidi derivati da iPSC

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).</li>
<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
<li>Haddad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus-colonizing+cells+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus-colonizing cells during human development.</a> Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).</li>
<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
<li>Abramson, J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells.</a> Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix%2C+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins.</a> Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).</li>
<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PE Clone: 3D12; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>Clone FITC</td><td>: M5E2; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HIB19; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>Clone: MG38; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HIT3a; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>Clone FITC</td><td>: 8G12; Diluizione: 1: 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: RPA-T4; Diluizione: 1: 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>Clone: L200; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>Clone: HI30; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: B159; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>Clone: DREG-56; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>Clone: FN50; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td>APC</td><td>Clone: M-T701; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td><td>Clone: RPA-T8; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HIT8a; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HEA-125; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>Clone: EBA-1; Diluizione: 1: 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R& D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>Biotechne R& D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per lisi dei globuli rossi</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Il flusso di lavoro del protocollo è riassunto nella Figura 4. Per questo modello 3D di coltura di organoidi, abbiamo adottato un idrogel di trombina e fibrinogeno che era stato precedentemente utilizzato dal nostro team per mantenere gli mTEC primari di topo per un paio di giorni, grazie ai segnali fisici e meccanici che forniva34. Dopo la polimerizzazione, il gel dovrebbe mostrare una struttura a maglie sciolta e spugnosa (Figura 5).
Dopo la fase iniziale di semina e attaccamento, gli organoidi sono progressivamente cresciuti e si sono sviluppati sia in superficie che all'interno degli strati più alti del gel. A seconda delle proprietà del gel, delle condizioni di semina e del numero di organoidi seminati sul gel, gli organoidi formavano strutture da sferiche a oblunghe (Figura 6) e occasionalmente si fondevano per formare strutture più grandi. Due particolari sotto-livelli dell'organizzazione sono stati osservati all'interno degli organoidi dopo la prima settimana di coltura: in primo luogo, abbiamo osservato lunghe strutture simili a proiezioni sulla superficie cellulare formate da grandi cellule che si irradiano dagli organoidi e colonizzano l'idrogel in tutte le direzioni (Figura 6 e Figura 7). In secondo luogo, abbiamo osservato strutture simili a grappoli formate da cellule più piccole che si concentrano attorno a quelle proiezioni cellulari. Sebbene non siamo stati in grado di isolare entrambi i tipi di cellule per confermare l'ipotesi dello studio, questo fenomeno ricorda le disposizioni 3D che si trovano all'interno della corteccia timica, formate dall'interazione di singoli cTEC con un gran numero di cellule T in via di sviluppo molto più piccole, note come complessi di cellule nutrici timomiche11 (Figura 8).
In diversi momenti durante la fase di coltura degli organoidi, abbiamo valutato la composizione cellulare degli organoidi timici mediante citometria a flusso e identificato diversi compartimenti chiave: TEC (caratterizzato come EPCAM+ CD45-), timociti (EPCAM- CD45+ CD3+) (Figura 9), nonché un compartimento EPCAM-CD45+ CD3- comprendente sottogruppi ematopoietici non timociti. Ulteriori dettagli possono essere trovati in Provin et al.23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> Figura 1: Caratterizzazione della differenziazione da iPSC a TEP. (A) Esempio di differenziazione da iPSC a TEP a D13, microscopio a contrasto di fase invertito, 400x. Barra della scala: 500 μm. (B) Esempio di grafico a punti, la proporzione di cellule EPCAM+ tra le cellule DAPI- al giorno 14 di differenziazione, immagine da FlowJo 10.0.7. (C) Immunocolorazione contro DAPI (blu), PAX9 (rosso) e KRT8 (verde), immunofluorescenza e imaging confocale al giorno 16 della differenziazione da iPSC a TEP. Le frecce bianche indicano esempi di colorazione anti-PAX9. Barra della scala: 50 μm (D) Livello di espressione di FOXN1 (da RQ a GAPDH) durante la differenziazione da iPS a TEP. TEC: Riferimento di controllo positivo, TEC umani primari isolati da campioni di timo pediatrico. Grafico da Prism (GraphPad versione 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> Figura 2: Configurazione sperimentale per la formazione di idrogel, la semina degli organoidi e la distribuzione del terreno di coltura. (A) Piastra di coltura con idrogel colati in inserti sospesi posizionati nelle file superiore e inferiore. (B) Semina dell'organoide: il cono della pipetta tagliato contenente 1 organoide viene posizionato sopra l'idrogel senza toccarlo e l'organoide viene delicatamente seminato sulla superficie del gel. (C) Il terreno di coltura viene depositato nel pozzetto di coltura posizionando la punta della pipetta tra i bracci dell'inserto sospeso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> Figura 3: D0 di coltura di organoidi timici prima della semina (giorni 13-15 del protocollo completo). (A) organoide prodotto con TEC derivati dalla linea Lon71.019 iPS. (B) Organoide prodotto con TEC derivati dalla linea MIPS203.003 iPS. Microscopio a contrasto di fase invertito, 1000x. Barre di scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> Figura 4: Rappresentazione riassuntiva di tutti i passaggi del protocollo. I campioni di timo pediatrico sono stati raccolti e dissociati e gli ETP primari Lin-CD34+ CD7+ sono stati ordinati mediante citometria a flusso. La differenziazione delle cellule iPS è stata condotta verso un'identità TEP. Gli ETP e i TEP derivati da iPS sono stati raggruppati e seminati in piastre a 96 pozzetti a basso legame e aggregati in organoidi timici durante la notte. Gli idrogel di fibrina sono stati preparati da aprotinina, fibrinogeno e trombina e fusi in inserti sospesi. Dopo la polimerizzazione, gli organoidi sono stati seminati sopra gli idrogel e il terreno di coltura di fase 1 è stato aggiunto ai pozzetti. Gli organoidi sono stati mantenuti in coltura per un massimo di 6 settimane. Creato in BioRender, licenza di pubblicazione AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> Figura 5: Organizzazione e struttura dell'idrogel. Microscopio a contrasto di fase invertito, 1000x. Barra della scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> Figura 6: Organoidi maturi e struttura tridimensionale. (A) Organoide timico al giorno 24 di coltura 3D, linea MIPS203.003 iPS. (B) Immagine composita di un organoide timico al giorno 32 di coltura 3D, linea Lon71.019 iPS. Microscopio a contrasto di fase invertito. Barre di scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> Figura 7: Dettaglio della struttura degli organoidi timici. (A) Organoide timico al giorno 32 della coltura 3D, linea L71.019 iPS. (B) Organoide timico al giorno 27 della coltura 3D, linea L80.002 iPS. Microscopio a contrasto di fase invertito, 400x. Barre di scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> Figura 8: Dettaglio della struttura di un organoide timico al 32° giorno di coltura 3D. Le frecce bianche indicano gruppi di piccoli timociti che proliferano in prossimità delle cellule TEC. Microscopio a contrasto di fase invertito, 400x. Barra della scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> Figura 9: Proporzione del compartimento delle cellule T all'interno degli organoidi timici. (A) Esempio di dot plot, proporzione di cellule CD45+ CD3+ all'interno delle cellule viventi (DAPI-) negli organoidi timici al giorno 35 della coltura 3D, immagine da FlowJo 10.0.7. La frazione CD45+ CD3- comprende cellule ematopoietiche non timocitarie. (B) La proporzione di cellule CD45+ CD3+ all'interno di cellule viventi negli organoidi timici nei giorni 17, 24/25, 32 e 39/40 di coltura 3D, n=2 in duplicato tecnico o triplicato, grafico da Prism (GraphPad versione 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Unità</td>
			<td>Fase 1 media Dal giorno 14 al giorno 18</td>
			<td>Fase 2 media Dal giorno 19 in poi</td>
		</tr><tr><td>Base</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FEG</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>RANGO L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SCF</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>Glutamax</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Integratori e rispettive concentrazioni.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Aprotinina (μL)</td>
			<td>Trombina (μL)</td>
			<td>Fibrinogeno (μL)</td>
			<td>Fase 1 medio</td>
			<td>Organoidi (unità)</td>
		</tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>da 3 a 5</td>
		</tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>Da 8 a 9</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Rapporti richiesti dei componenti per la preparazione di idrogel e la semina di organoidi in piastre a 6, 12 e 24 pozzetti.

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo video la preparazione di 2-dGuo trattati reaggregate culture timo è dimostrata.

Reaggregate Culture Thymus

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3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

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Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

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