Name: Vitrificazione del tessuto della corteccia ovarica per raggiungere uno stato vetroso di aggregazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Impara la vitrificazione del tessuto della corteccia ovarica per la preservazione della fertilità nelle giovani pazienti oncologiche. Questo metodo offre un'alternativa efficace alla congelazione lenta per proteggere la fertilità.

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<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione della vitalità follicolare nei tessuti della corteccia ovarica umana vitrificata

<table><tbody><tr><td>Fiale da 1,8 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 4 pozzetti</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacillol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calceina AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo 1A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Criosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS CTS</td><td>Gibco Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne pipetta aiuto</td><td>Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda contenitore di sterilizzazione</td><td>euronda</td><td>282021</td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>Metal maglie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum forbici</td><td>mondo strumenti di precisione</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>N-Bath System</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone (PVP)</td><td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>Integratore sostitutivo del siero (SSS)</td><td>Fujifilm Irvine scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>Coppetta</td> <td>sterileSarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>Pinze sterili</td><td>Carl Roth</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrificazione del tessuto della corteccia ovarica per raggiungere uno stato vetroso di aggregazione

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

Questo protocollo presenta le procedure per la preparazione dei terreni di vetrificazione, i dispositivi di caricamento, la vetrificazione, la preparazione dei terreni di riscaldamento rapido, il riscaldamento rapido e la determinazione della vitalità follicolare. Un confronto diretto della vitalità follicolare e dei fattori angiogenici tra congelamento lento e vitrificazione è stato convalidato e pubblicato31,32.
Il successo complessivo del protocollo di vitrificazione descritto è stato valutato confrontando la conta dei follicoli vitali prima e dopo la vitrificazione/riscaldamento rapido. La configurazione sperimentale è mostrata nella Figura 1 e i risultati sono presentati nella Figura 6. In 50 pazienti, è stata osservata una conta media di 77,98 follicoli vitali prima della vitrificazione e di 62,99 dopo la vitrificazione/riscaldamento rapido, che riflette un tasso di sopravvivenza dell'80,8%. Questo non era significativamente diverso secondo il test di Wilcoxon33.
Le griglie metalliche sono personalizzate individualmente con forbici affilate di dimensioni 25 mm x 8 mm, che si inseriscono nei cappucci dei crioviali da 1,8 mL, come mostrato nella Figura 2A, C. Dopo la sterilizzazione con autoclave a vapore, le griglie e i tappi delle fiale da 1,8 mL vengono assemblati sotto un banco a flusso laminare, come indicato nella Figura 2B. Questa configurazione fornisce una presa sicura nel tappo senza la necessità di ulteriori azioni e offre un'area sufficiente per tessuti di varie dimensioni. In genere, vengono vitrificati pezzi di tessuto di 5 mm x 10 mm per il trapianto e pezzi di 2 mm di diametro per la valutazione della conta dei follicoli vitali dopo un rapido scongelamento. Entrambe le dimensioni si adattano perfettamente alle griglie metalliche.
L'equilibratura con soluzioni di vetrificazione (VS1, VS2 e VS3) viene condotta in una piastra a 6 pozzetti su un agitatore oscillante a temperatura ambiente sotto un banco a flusso laminare, come mostrato nella Figura 3. I tempi previsti dallo schema garantiscono l'efficace assorbimento del glicole etilenico crioprotettore. Si consiglia l'uso di una piastra a 6 pozzetti su singoli recipienti in quanto facilita il rapido movimento del tessuto tra le soluzioni e aiuta a prevenire gli scambi.
Per una rapida vetrificazione verticale in azoto liquido, il tessuto della corteccia ovarica viene tagliato in pezzi adatti (Figura 4A). I campioni di corteccia ovarica vengono posti su dispositivi di carico (Figura 4B, C) e immersi verticalmente in azoto liquido (Figura 4D) per ottenere uno stato vetroso di aggregazione attraverso la vetrificazione. Le griglie metalliche scelte consentono la movimentazione verticale del tessuto, come mostrato nella Figura 4D. Inoltre, le griglie metalliche sono altamente conduttive termicamente e garantiscono velocità di raffreddamento rapide da 22 °C a -196 °C, un passaggio di fondamentale importanza nel processo di vetrificazione.
Per un riscaldamento rapido, l'RWS viene preparato in una tazza sterile a 37 °C. ES, RS1 e RS2 vengono preparati in una piastra a 6 pozzetti su un agitatore a oscillazione a temperatura ambiente, come mostrato nella Figura 5. L'elevato volume di RWS preriscaldato impedisce che la soluzione si raffreddi eccessivamente dopo l'aggiunta del tessuto vetrificato e garantisce un ambiente costantemente caldo per il tessuto durante tutto il processo di riscaldamento rapido.
Per valutare e garantire elevati standard di qualità, i punzoni per biopsia da 2 mm x 2 mm vengono colorati con calceina prima della vetrificazione e dopo un rapido riscaldamento per determinare la vitalità follicolare utilizzando la microscopia a fluorescenza34,35 (Figura 6). I follicoli vitali emettono fluorescenza verde a 495 nm dopo l'assorbimento intracellulare della calceina. In alternativa, la vitalità follicolare (Tabella 3) può essere valutata utilizzando coloranti rossi neutri36.
Seguendo i passaggi descritti in questo protocollo, il tessuto ovarico viene trasformato in uno stato vetroso di aggregazione, che facilita alti tassi di sopravvivenza dopo un rapido riscaldamento, come confermato dalla microscopia a fluorescenza.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg"> 
Figura 1: Disegno dello studio. I campioni corticali ovarici di 50 pazienti sono stati esaminati prima (fresco) e dopo la vitrificazione e il riscaldamento rapido per il numero di follicoli vitali. Per ogni gruppo, due pezzi di tessuto di 2 mm di diametro sono stati coltivati per 24 ore prima della valutazione della conta dei follicoli. Il tessuto è stato digerito con collagenasi e colorato con calceina per valutarne la vitalità. Il numero di follicoli vitali è stato determinato utilizzando un microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg"> 
Figura 2: Preparazione dei dispositivi di carico. Le griglie metalliche sono state tagliate a una dimensione di 8 mm x 25 mm (A). Le griglie metalliche personalizzate sono state sterilizzate in autoclave (B). Le griglie metalliche sterilizzate sono state quindi inserite in tappi da flaconcini da 1,8 mL, pronti per l'uso (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg"> 
Figura 3: Preparazione di soluzioni di vitrificazione. Le soluzioni di vetrificazione (VS) sono state preparate e trasferite su una piastra a 6 pozzetti. I pozzetti mostrano il volume di ciascuna soluzione e i tempi di incubazione individuali utilizzati nel protocollo di vetrificazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg"> 
Figura 4: Processamento e vitrificazione della corteccia ovarica. Il tessuto della corteccia ovarica è stato processato per la crioconservazione rimuovendo il midollo e tagliando il tessuto in pezzi di 5 mm x 10 mm (A). Dopo l'incubazione nelle soluzioni di vitrificazione mostrate nella Figura 3, il tessuto è stato caricato sul dispositivo di carico di vitrificazione (B,C). Per una rapida vitrificazione verticale di campioni di corteccia ovarica, i tappi con il tessuto caricato sono stati rapidamente inseriti in azoto liquido sterilizzato (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg"> 
Figura 5: Preparazione di soluzioni di riscaldamento rapido. La soluzione di riscaldamento rapido (RWS), la soluzione di equilibrio (ES) e le soluzioni di risciacquo (RS) 1 e 2 sono state preparate e trasferite in una piastra a 6 pozzetti. I recipienti e i pozzetti mostrano il volume di ciascuna soluzione e i corrispondenti tempi di incubazione. Si noti che l'RWS viene mantenuto a 37,2 °C su una piastra riscaldante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg"> 
Figura 6: Conteggio della vitalità. Per valutare il numero di follicoli vitali, pezzi di tessuto di 2 mm di diametro sono stati digeriti con collagenasi e colorati con calceina. Le immagini rappresentative mostrano (A) la colorazione con calceina di 3 follicoli recuperati prima della vitrificazione. (B) Un follicolo vitale recuperato dopo vetrificazione e riscaldamento rapido. (C) Un follicolo vitale recuperato prima del congelamento lento. (D) Recupero di follicoli vitali dopo il congelamento lento e lo scongelamento. La vitalità follicolare è indicata dalla calceina, un colorante fluorescente verde che emette fluorescenza verde quando viene convertito enzimaticamente da cellule vitali a 495 nm. Barra della scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>VS 1 (15 mL)</td>
			<td>Glicole etilenico</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>12 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 2 (15 mL)</td>
			<td>Glicole etilenico</td>
			<td>20%</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>10,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 3 (15 mL)</td>
			<td>Glicole etilenico</td>
			<td>35%</td>
			<td>5,25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Saccarosio</td>
			<td>0,5 mol/L</td>
			<td>2,57 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PVP</td>
			<td>5 % (p/v)</td>
			<td>0,75 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Composizione delle soluzioni di vitrificazione (VS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 mL)</td>
			<td>Saccarosio</td>
			<td>0,8 mol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8,22 grammi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 ml)</td>
			<td>Saccarosio</td>
			<td>0,4 mol/L</td>
			<td>2,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1&amp;2 (15 mL)</td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Composizione della soluzione di riscaldamento rapido (RWS), della soluzione di equilibrio (ES) e delle soluzioni di risciacquo (RS). Questa tabella fornisce i componenti e le concentrazioni per la soluzione di riscaldamento rapido (RWS), la soluzione di equilibrio (ES) e le soluzioni di risciacquo (RS) utilizzate nel processo post-vetrificazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametro</td>
			<td>Fresco</td>
			<td>Intervallo</td>
			<td>Riscaldamento rapido dopo la vetrificazione</td>
			<td>Intervallo</td>
			<td>n</td>
			<td>*Valore P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conta della vitalità follicolare [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Test di Wilcoxon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Risultati rappresentativi della vitalità follicolare. Questa tabella presenta i risultati delle valutazioni della vitalità follicolare prima della crioconservazione e dopo un rapido riscaldamento. Due pezzi di tessuto di 2 mm di diametro per paziente sono stati utilizzati per contare il numero di follicoli vitali prima e dopo la vitrificazione/riscaldamento rapido. I campioni di tessuto accoppiati di 50 pazienti sono stati analizzati utilizzando il test di Wilcoxon.

Vitrificazione del tessuto della corteccia ovarica per raggiungere uno stato vetroso di aggregazione

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