Name: Un flusso di lavoro basato sul web per la selezione di potenziatori specifici per geni e tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:10:10.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri un flusso di lavoro basato sul web per identificare enhancer specifici per tessuti e geni senza competenze di programmazione. Utilizza dati pubblici di marcatori istonici H3K4me1/H3K27ac e Hi-C per la ricerca genomica.

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<ol><li>Barral, A., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+signatures+of+enhancers+and+their+dynamic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation.</a> Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).</li>
<li>Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+control+of+gene+expression%3A+emerging+mechanisms+and+disruption+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).</li>
<li>Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+redundancy+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancer redundancy in development and disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).</li>
<li>Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+biology+and+enhanceropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer biology and enhanceropathies.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).</li>
<li>Sur, I., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+enhancers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of enhancers in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).</li>
<li>Panigrahi, A., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhancer+action%3A+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown.</a> Genome Biol. 22 (1), 108(2021).</li>
<li>Bulger, M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mechanistic+diversity+of+distal+transcription+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers.</a> Cell. 144 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+promoter+interactions-long+distance+calls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Enhancer and promoter interactions-long distance calls.</a> Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+connectivity+maps+reveal+dynamic+promoter-enhancer+long-range+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations.</a> Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Thurman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).</li>
<li>Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Gao, T., Qian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EnhancerAtlas+2.0%3A+an+updated+resource+with+enhancer+annotation+in+586+tissue%2Fcell+types+across+nine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).</li>
<li>Erwin, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+diverse+datasets+improves+developmental+enhancer+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction.</a> PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Spicuglia, S., Vanhille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of active enhancers.</a> Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).</li>
<li>Borsari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+with+tissue-specific+activity+are+enriched+in+intronic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions.</a> Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).</li>
<li>Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation+in+a+TBX5+enhancer+leads+to+isolated+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).</li>
<li>Boogerd, C. J., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBX5+and+NuRD+divide+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TBX5 and NuRD divide the heart.</a> Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+compendium+and+functional+assessment+of+in+vivo+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers.</a> Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+of+sequence+and+functional+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Limits of sequence and functional conservation.</a> Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).</li>
<li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISTA+Enhancer+Browser-a+database+of+tissue-specific+human+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Postazione di lavoro del computer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Computer compatibile con browser Web, sistema operativo Windows/Mac/Linux</td></tr><tr><td>Portale dati 4DN</td><td>Portale dati 4DN</td><td>https://data.4dnucleome.org/</td><td></td></tr><tr><td>Galassia</td><td>Galassia</td><td>https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445</td><td></td></tr><tr><td>Github</td><td>Github</td><td>https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow</td><td></td></tr><tr><td>VISTA&nbsp;</td><td>VISTA Cardiac Enhancer Browser</td><td>https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/</td><td></td></tr></tbody></table>

un flusso di lavoro basato sul web per la selezione di potenziatori specifici per geni e tessuti

A Web-Based Workflow for Selecting Gene- and Tissue-Specific Enhancers

Per illustrare l'uso del protocollo presentato, abbiamo studiato il gene TBX5 nel cuore umano, esplorando gli enhancer associati a TBX5 utilizzando il flusso di lavoro completo che coinvolge i dati H3K4me1, H3K27ac e Hi-C. TBX5 è un gene che contribuisce allo sviluppo degli arti e del cuore, compresa la formazione delle quattro camere e la separazione del setto24. La mutazione in questo gene è una delle principali cause della sindrome di Holt-Oram (HOS), che causa anomalie degli arti e cardiopatie congenite (CHD), inclusi difetti del setto24. La mutazione degli enhancer cardiaci associati a TBX5 può influenzare in modo critico la CHD24. Uno studio precedente ha scoperto tre noti enhancer TBX5 nel tessuto cardiaco umano specifico, vale a dire "Enhancer 2", "Enhancer 9" e "Enhancer 16" (Supplementary File 2), che hanno dimostrato di avere fenotipi comparativi nei topi transgenici23.
Abbiamo studiato le regioni arricchite con H3K4me1 e H3K27ac tra RBM19 e TBX3, che sono due geni fiancheggianti a valle e a monte di TBX5 nell'uomo, per recuperare potenziatori putativi nel locus TBX5 (Figura 1 e Figura 2). Per identificare i potenziatori specifici del cuore, sono state scelte le cellule del muscolo cardiaco. Le regioni putative dell'enhancer cardiaco TBX5 sono state recuperate come coordinate (chr12: inizio-fine) e sono state identificate 22 regioni associate a H3K4me1 e H3K27ac (Figura 3 e File supplementare 3). I potenziatori cardiaci putativi di TBX5 sono stati recuperati dal database genomico EnsEMBL per incrociare i dati Hi-C contenuti nel database 4DNucleome (Figura 4). Questo è stato fatto per valutare le possibili interazioni tra potenziali potenziatori e il promotore cardiaco TBX5 . Seguendo il protocollo qui descritto, è stato confermato che 21 delle 22 regioni genomiche interagiscono con il promotore TBX5 (chr12: 114400143-114410103) nelle cellule muscolari cardiache (File supplementare 4). C'era una regione che non aveva alcuna interazione fisica con il promotore (Figura 4, passaggio 4.8). Infine, abbiamo confrontato questo protocollo con questi enhancer biologicamente convalidati e l'attuale database gold standard di enhancer cardiaci, VISTA Cardiac Enhancers Browser, e abbiamo rivelato ulteriori enhancer non attualmente catturati dal database25.
Abbiamo eseguito un confronto incrociato dei 21 enhancer TBX5 recuperati dal protocollo qui presentato con i database esistenti. Abbiamo recuperato 4 enhancer TBX5 da VISTA Cardiac Enhancer Browser (File supplementare 5)25. Dei 4 potenziatori cardiaci identificati da VISTA, 3 potenziatori, hs2329, mm1282 e m370 si sovrapponevano alle regioni identificate da questo protocollo di rilevamento degli enhancer basato sul web (Figura 5). Ciascuno degli enhancer previsti condivideva anche le regioni genomiche con gli enhancer precedentemente validati sperimentalmente da Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) e Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), mentre non mostravano sovrapposizioni con l'Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Uno degli enhancer identificati da VISTA, hs498 non si sovrapponeva ad alcun enhancer previsto da questo protocollo o dagli enhancer23 convalidati sperimentalmente da Smemo et al. (Figura 5), anche se la regione mostrava una parziale sovrapposizione con i marcatori H34Kme1 (Figura 5). Allo stesso modo, l'enhancer 9 non si sovrapponeva agli enhancer previsti da questa pipeline, ma era associato ai marcatori H3K4me1 (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig1.jpg"> 
Figura 1: Guida passo passo per individuare il GoI nel browser del genoma EnsEMBL. L'utente apre prima la homepage di EnsEMBL (1.1), seleziona la specie (Umano) e inserisce il gene nella barra di ricerca (1.2-1.3). Dall'elenco dei risultati, viene selezionato l'ID del gene appropriato (1.4), che apre la pagina di riepilogo del gene. L'utente fa quindi clic sul collegamento ipertestuale Region in Detail (1.5) per visualizzare la regione genomica che circonda il GoI, inclusi gli elementi adiacenti e le caratteristiche regolatorie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig2.jpg"> 
Figura 2: Definizione della regione di rilevamento dell'enhancer intorno al GoI utilizzando il browser genomico EnsEMBL. Per definire la regione di rilevamento dell'enhancer, identificare i due geni vicini che fiancheggiano il GoI utilizzando le annotazioni geniche di base del percorso GENCODE , in cui i geni sono mostrati come blocchi giallo scuro etichettati con annotazioni EnsEMBL/Havana unite. La direzione trascrizionale di ciascun gene è indicata da punte di freccia (&lt; o &gt;) accanto al nome del gene (2.1). Per selezionare la regione intergenica tra i geni vicini, fare clic e trascinare sulla regione di interesse, quindi scegliere Salta alla regione nella finestra pop-up per ingrandire (2.2). Per aggiungere annotazioni relative alle normative o ai potenziatori, fare clic su Aggiungi/rimuovi tracce (2.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig3v2.jpg"> 
Figura 3: Configurazione delle tracce di modifica degli istoni nella regione di rilevamento dell'enhancer utilizzando il browser genomico EnsEMBL. Nella barra degli strumenti a sinistra, fare clic su Configura questa pagina (3.1) per accedere al pannello di configurazione della traccia e passare a "Attività per cellula/tessuto" nella sezione Regolazione (3.2). Nella scheda che si apre, seleziona la sezione "Esperimenti" (3.3) e utilizza la barra di ricerca Cellula/Tessuto per individuare e selezionare il tessuto di interesse (cellula del muscolo cardiaco) (3.4). Nel pannello dei segni istonici (3.5), abilitare H3K4me1 e H3K27ac come segni di potenziamento attivi e H3K4me3 come segno promotore, quindi fare clic su "Configura visualizzazione traccia" (3.6). Dopo aver confermato le selezioni delle tracce, fare clic su "Visualizza tracce" (3.7) per tornare al visualizzatore del genoma. I picchi degli istoni sono ora mostrati nella regione di rilevamento (3.8) come blocchi colorati sotto l'etichetta del tessuto corrispondente (giallo: H3K4me1, blu: H3K27ac e arancione: H3K4me3). Pop-up "Hists &amp; Pols" contenente le coordinate genomiche della regione in coppie di basi (chr:start-end), che possono essere copiate e salvate per l'analisi a valle. Un pop-up "Hists &amp; Pols" appare dopo aver cliccato sugli elementi colorati nel brano. Il pop-up contiene le coordinate genomiche della regione in coppie di basi (ad esempio, chr12:11443450-114451611 per la regione del promotore), che possono essere copiate e salvate per l'analisi a valle (3.8). Allo stesso modo, per estrarre i potenziatori candidati, dare priorità alle regioni in cui i picchi di H3K4me1 e H3K27ac si sovrappongono, come mostrato dall'allineamento verticale dei picchi e delle caselle tra le tracce (3.9). Le regioni sovrapposte possono essere selezionate direttamente facendo clic sulle relative caselle o facendo clic e trascinando manualmente sui picchi allineati per definire una regione (ad esempio, chr12:114400143-114410103 per una regione candidata attiva). Le coordinate mostrate nel pop-up devono essere salvate in formato BED per la convalida o la visualizzazione a valle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig4v2.jpg"> 
Figura 4: Visualizzazione delle interazioni tra promotore e potenziatore della cromatina utilizzando le mappe di calore Hi-C dal 4D Nucleome Data Portal. La homepage del 4D Nucleome Data Portal mostra un grafico a barre impilate che riassume i tipi di esperimenti disponibili per organismo. Il set di dati "Hi-C in situ " per campioni umani viene selezionato facendo clic sulla sezione corrispondente della barra (4.1). Viene visualizzato un elenco filtrato di set di dati pertinenti; è stato selezionato un dataset Hi-C derivato da cellule H9 differenziate in mioblasti cardiaci (4.2). Il set di dati selezionato (4.3) viene aperto nel browser HiGlass tramite il pulsante Esplora dati (4.4). La regione genomica di interesse viene inserita nella casella delle coordinate (4.5) e la matrice di contatto viene visualizzata come una mappa di calore in scala di colori. I colori più scuri (dal rosso intenso al nero) indicano una frequenza di contatto della cromatina più forte, mentre i colori più chiari (dal bianco all'arancione) rappresentano interazioni più deboli. Una regola orizzontale è posta alla coordinata del promotore e le regole verticali sono disegnate nelle posizioni di tre enhancer di controllo validati sperimentalmente (4.6). Queste intersezioni sono utilizzate per definire una soglia di interazione rigorosa, impostata dal segnale visibile più forte (colore più scuro) tra i contatti promotore-potenziatore (4.7). Ulteriori regole verticali sono disegnate nelle posizioni dei candidati enhancer marcati H3K27ac e H3K4me1 (dal passaggio 3.8). I candidati le cui intersezioni promotore-potenziatore sono uguali o più scure della soglia vengono mantenuti, mentre quelli con segnali più deboli (quadrati di colore più chiaro) sono esclusi (4.8). Le coordinate conservate vengono estratte manualmente e salvate in formato BED per le analisi a valle. (a. Enhancer 2, b. Enhancer 9 e c. Enhancer 16) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig5.jpg"> 
Figura 5: Vista del browser genomico degli enhancer TBX5 previsti rispetto agli enhancer cardiaci e agli enhancer di controllo convalidati da VISTA. Le istantanee del browser del genoma mostrano l'intervallo di ricerca dell'enhancer (STEP 2) confrontando gli enhancer previsti recuperati dal protocollo basato sul web (in basso) con gli enhancer convalidati da VISTA (in alto) e gli enhancer di controllo convalidati sperimentalmente (al centro). Il pannello principale mostra il locus genomico completo con elementi regolatori annotati, inclusi i picchi H3K4me1 specifici per le cellule muscolari cardiache (giallo), H3K27ac (blu) e H3K4me3 (arancione). Tre figure ingrandite catturano l'allineamento tra il recuperato dal protocollo, VISTA e i potenziatori di controllo. La sovrapposizione con i potenziatori di controllo è delineata da riquadri rossi. Le coordinate per ogni sottoregione vengono visualizzate nei pannelli inferiori del browser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Dati utilizzati nello studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%201.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Strumenti basati sul Web utilizzati nello studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%202.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
File supplementare 1: Istruzioni per la risoluzione dei problemi per EnsEMBL Genome Browser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Un file BED in formato GRCh38, i potenziatori del controllo cardiaco TBX5 convalidati sperimentalmente 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%202.bed" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Un file BED in formato GRCh38, potenziatori cardiaci TBX5 recuperato da STEP3 da EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%203.bed" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: Un file BED in formato GRCh38, potenziatori cardiaci TBX5 recuperato da STEP4 da EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%204.bed" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 5: Un file BED in formato GRCh38, potenziatori cardiaci TBX5 recuperati dal browser VISTA 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%205.bed" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Un flusso di lavoro basato sul web per la selezione di potenziatori specifici per geni e tessuti

Enhancers are DNA regions that regulate gene expression. Mutations within enhancers can result in abnormal gene regulation leading to disease. Therefore, ...

a-web-based-workflow-for-selecting-gene-and-tissue-specific-enhancers

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Ricerca

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Genetics

Genetica

In questo lavoro forniamo un flusso di lavoro sperimentale su come i potenziatori attivi possono essere identificati e convalidati sperimentalmente.

Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

A differenza dei dati di sequenza di DNA, epigenomic dati non sono facilmente soggetti a ricerche basate su testo. Presentato qui sono le procedure per utilizzare una versione aggiornata di GeNemo, uno strumento web-based di bioinformatica, per condurre le ricerche basate su pattern per somiglianze nei dati di epigenomic confronto database online disponibili tra cui Encyclopedia of DNA Elements con dati dell'utente.

Ricerca basata su pattern di Epigenomic dati utilizzando GeNemo

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per progettare e realizzare targeting multiplex di esaltatori con la proteina di fusione disattivazione SID4X-dCas9-KRAB, noto anche come interferenza di enhancer (Enhancer-i). Questo protocollo consente l'identificazione dei rinforzatori che regolano l'espressione genica e facilita la dissezione delle relazioni tra esaltatori di un gene bersaglio comune di regolazione.

Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

Questo protocollo illustra i passaggi necessari per generare un sistema di modello in cui la trascrizione di un gene endogeno di interesse può essere controllata in modo condizionale in animali vivi o celle utilizzando avanzata lac repressore e/o sistemi di attivatore di tet .

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

Segnaliamo l'applicazione della cattura della conformazione quantitativa del cromosoma seguita dal sequenziamento ad alto processo in corpi embrionali generati da cellule staminali embrionali. Questa tecnica consente di identificare e quantificare i contatti tra stimolatori e regioni promotrici di un determinato gene durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali.

Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C)

Questo protocollo descrive un nuovo test di enhancer-reporter transitorio basato su rAAV. Questo test può essere utilizzato per indurre l'espressione guidata dal potenziatore in vivo nel cervello del topo.

Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

Qui, presentiamo un protocollo per la selezione in vitro di repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) con un'efficienza di silenziamento alta, a lungo termine, stabile, on-target e bassa attività a livello di genoma, off-target. Questo flusso di lavoro consente di ridurre un repertorio iniziale e complesso di ETR candidati a un breve elenco, adatto per un'ulteriore valutazione in contesti terapeuticamente rilevanti.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Descriviamo un metodo per ordinare singole cellule di mammifero e quantificare l'espressione di un massimo di 96 geni bersaglio di interesse in ogni cellula. Questo metodo include l'uso di standard qPCR interni per consentire la stima dei conteggi assoluti dei trascritti.

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Scopri un flusso di lavoro basato sul web per identificare enhancer specifici per tessuti e geni senza competenze di programmazione. Utilizza dati pubblici di marcatori istonici H3K4me1/H3K27ac e Hi-C per la ricerca genomica.

Un flusso di lavoro basato sul web per la selezione di potenziatori specifici per geni e tessuti

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