Un flusso di lavoro basato sul web per la selezione di potenziatori specifici per geni e tessuti

Siamo interessati a decodificare il genoma non codificante per capire come vengono regolati i geni, per essere espressi al momento giusto e nel posto giusto. Sviluppiamo protocolli di facile utilizzo utilizzando strumenti di genomica basati sul web per rendere le scoperte avanzate accessibili a tutti i biologi. Ampia disponibilità di dati multimodali che possono aiutare a restringere la posizione dei potenziatori e il facile accesso a questi dati attraverso interfacce web open source.

Ciò consente un'identificazione completa dei potenziatori senza richiedere competenze di programmazione da parte dei ricercatori. Questo protocollo fornisce una base per chiunque non abbia un background in biologia degli enhancer per iniziare a navigare tra i set di dati disponibili pubblicamente per recuperare gli enhancer per i geni di interesse. Utilizziamo TBX5, un noto attore nella biologia cardiaca, come caso di studio.

Il nostro flusso di lavoro ha identificato 21 potenziatori, che possono far luce sui meccanismi di sviluppo del cuore e sulle cardiopatie congenite. Espanderemo il nostro protocollo con nuove fonti di dati, tra cui la genomica spaziale, sviluppando al contempo ulteriori strumenti di facile utilizzo per i biologi. Per iniziare, apri il browser del genoma di Ensembl.

Selezionare l'assemblaggio del genoma che corrisponde alla specie e alla versione di interesse. Inserisci il gene di interesse nel campo di ricerca e fai clic su Vai.Dai risultati, fai clic sull'ID del gene Ensembl appropriato.Quindi scorri fino alla sezione Riepilogo"e fai clic sul collegamento "Regione in dettaglio" per visualizzare la regione circostante del gene di interesse. Ora, cerca i due geni che fiancheggiano il gene di interesse utilizzando la traccia Gene Legend.

Questi geni appaiono come elementi visivi che rappresentano annotazioni fuse di Ensembl e Havana all'interno delle annotazioni geniche di base della traccia GENCODE. Determinare la direzionalità del gene di interesse osservando i segni maggiore o minore di accanto ai nomi dei geni. Fare clic e trascinare il cursore sulla regione intergenica tra questi geni, quindi fare clic su Salta alla regione" nella finestra popup per visualizzare la regione selezionata.

Personalizza la visualizzazione facendo clic su Aggiungi"o Rimuovi tracce"nella parte superiore del visualizzatore tracce. Utilizzare i controlli di zoom e navigazione per regolare la visualizzazione e migliorare la visualizzazione della regione. Nella regione in dettaglio"visualizzatore della scheda, fare clic su Configura questa pagina"nella barra laterale.

Nella barra laterale Configura immagine regione, in Regolamento, selezionare Attività per cellula o tessuto. Utilizzare la barra di ricerca delle cellule o dei tessuti per trovare e selezionare i tessuti desiderati oppure utilizzare l'indice alfabetico sotto la barra. Fare clic sulla scheda Esperimenti"adiacente all'opzione Cellula o tessuto".

Scegli H3K4me1 e H3K27ac come marker per gli enhancer e H3K4me3 come marker per i promotori e fai clic su Configura visualizzazione traccia. Quindi, seleziona Visualizza tracce"per visualizzare le regioni contrassegnate da H3K4me1 all'interno della regione di rilevamento dell'enhancer e le regioni contrassegnate da H3K4me3 a monte del gene di interesse. Fare clic sugli elementi visivi colorati o sulla casella nella traccia H3K4me1 per recuperare le coordinate genomiche delle regioni contrassegnate all'interno della regione di rilevamento definita.

Si apre il popup Hists e Pols, che mostra la posizione genomica dell'elemento in coppie di basi. In alternativa, è possibile definire manualmente le regioni di interesse per ciascuna caratteristica genomica facendo clic e trascinando sulla traccia per racchiudere i picchi del grafico sotto le tracce H3K4me1 o H3K27ac. Quindi copia le coordinate della posizione genomica in un file di testo e salva il file in formato BED.

Accedi al portale dati 4DN. Nella home page, assicurati che Set di esperimenti" sia selezionato come asse Y della barra principale in pila, Tipo di esperimento" sia selezionato come asse X e che il grafico sia raggruppato per organismo. Individua la barra Hi-C in situ lungo l'asse X e fai clic sulla parte che rappresenta i set di esperimenti umani.

Nel popup, fai clic sul pulsante Sfoglia e seleziona i mioblasti del muscolo cardiaco e il nostro gene di interesse, TBX5, associato all'organogenesi del cuore. Fare clic sul collegamento nella colonna Titolo" del campione biologico pertinente corrispondente al tessuto di interesse. Quindi, nella scheda File elaborati, fare clic su Esplora datiper esaminare il set di dati Hi-C in modo più dettagliato.

Inserire le coordinate del promotore identificato nel tessuto di interesse e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla mappa di calore per contrassegnare la regione orizzontalmente. Queste linee consentono di tracciare visivamente la regione del promotore attraverso la mappa di calore. Se necessario, regolare la vista trascinandola verticalmente fino a quando i limiti superiore e inferiore nelle coordinate Y della barra di ricerca non si allineano con i limiti della regione di interesse.

Per rimuovere eventuali linee indesiderate, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea e selezionare Orizzontale" o Regola verticale, quindi fare clic su Chiudi serie. Inserire le coordinate di tutti gli enhancer di controllo convalidati sperimentalmente per calcolare la soglia di interazione in base ai loro valori minimi di interazione. Visualizzare i tre potenziatori di controllo dalla letteratura insieme alla regione del promotore di Ensembl utilizzando la vista pre-preparata.

Quindi definisci la soglia del potenziatore del promotore utilizzando questi potenziatori di controllo selezionando il punteggio di interazione diverso da zero più basso, come indicato dalla chiave colore sul lato destro della matrice della mappa di calore. Inserire le coordinate genomiche di tutte le regioni enhancer associate a H3K4me1 e contrassegnare verticalmente sulla mappa di calore Hi-C. Filtra le regioni debolmente interagenti confrontando i punteggi di interazione delle regioni marcate con H3K4me3 rispetto alla soglia di interazione.

Selezionare le coordinate genomiche che mostrano le frequenze di interazione al di sopra di questa soglia, che appaiono come segnali più concentrati o più scuri sulla mappa di calore, e salvarle in formato BED. Tre dei quattro potenziatori cardiaci identificati nel VISTA Cardiac Enhancer Browser, HS2329, mm1282 e mm370, si sovrapponevano alle regioni previste dal protocollo di rilevamento degli enhancer basato sul web. L'enhancer Two si sovrapponeva sia a una regione prevista dal protocollo di rilevamento dell'enhancer che a un enhancer convalidato sperimentalmente.

L'enhancer 16 ha mostrato una sovrapposizione sia con le regioni dell'enhancer previste che con i dati sperimentali precedenti. L'enhancer Nine non si sovrapponeva ad alcun enhancer previsto dalla pipeline, ma mostrava un parziale arricchimento del segnale H3K4me1.