Name: Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri un modello murino transgenico tricolore per studiare le lesioni della cartilagine di crescita. Questo metodo consente di mappare le risposte cellulari durante la riparazione ossea pediatrica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health, del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) 1R21AR079153 e da una sovvenzione del programma di miglioramento della ricerca (REP) dell'Università del Connecticut. Gli autori desiderano ringraziare l'assistenza di Renata Rydzik della struttura MicroCT Imaging Core dell'Università del Connecticut.

Studio preciso sulle lesioni della cartilagine di crescita utilizzando topi fluorescenti trilineage

<ol><li>Iannotti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Growth plate physiology and pathology.</a> Orthop Clin North Am. 21 (1), 1-17 (1990).</li>
<li>Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+responses+and+repair+mechanisms+of+the+injured+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).</li>
<li>Salter, R. B., Harris, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injuries+involving+the+epiphyseal+plate%5BTitle%5D)+AND+%22JBJS%22%5BJournal%5D)">Injuries involving the epiphyseal plate.</a> JBJS. 45 (3), 587-622 (1963).</li>
<li>Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classifications+in+brief%3A+Salter-harris+classification+of+pediatric+physeal+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Classifications in brief: Salter-harris classification of pediatric physeal fractures.</a> Clin Orthop Relat Res. 474 (11), 2531-2537 (2016).</li>
<li>Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+analyses+of+bone+bridge+formation+within+the+growth+plate+injury+site+and+cartilage+degeneration+at+the+adjacent+uninjured+area%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area.</a> Bone. 49 (4), 904-912 (2011).</li>
<li>Shaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+approaches+for+the+treatment+of+pediatric+physeal+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries.</a> Tissue Eng Part B Rev. 24 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Xian, C. J., Zhou, F. H., Mccarty, R. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+ossification+mechanism+for+bone+bridge+formation+at+the+growth+plate+cartilage+injury+site%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site.</a> J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).</li>
<li>Muruganandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+foxa2%2B+long-term+stem+cell+population+is+necessary+for+growth+plate+cartilage+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A foxa2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury.</a> Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).</li>
<li>Coleman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+small+animal+growth+plate+injury+model+using+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography.</a> Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).</li>
<li>Lee, E. H., Gao, G. X., Bose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+partial+growth+arrest%3A+Physis%2C+fat%2C+or+silastic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Orthop%22%5BJournal%5D)">Management of partial growth arrest: Physis, fat, or silastic.</a> J Pediatr Orthop. 13 (3), 368-372 (1993).</li>
<li>Planka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+mesenchymal+stem+cells+with+chondrocytes+in+prevention+of+partial+growth+plate+arrest+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pap+Med+Fac+Univ+Palacky+Olomouc+Czech+Repub%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs.</a> Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).</li>
<li>Foster, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimplantation+of+growth+plate+chondrocytes+into+growth+plate+defects+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep.</a> J Orthop Res. 8 (4), 555-564 (1990).</li>
<li>Erickson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+tibial+growth+plate+injury+model+to+characterize+repair+mechanisms+and+evaluate+growth+plate+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies.</a> J Vis Exp. (125), e55571(2017).</li>
<li>Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+effect+of+bone+marrow-derived+stem+cell+implantation+after+epiphyseal+plate+injury+is+abrogated+by+chondrogenic+predifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation.</a> Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).</li>
<li>Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+autologous+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+an+ovine+model+of+growth+plate+cartilage+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Orthop+J%22%5BJournal%5D)">Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury.</a> Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+mandibular+condylar+cartilage+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations.</a> Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).</li>
<li>Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+differentiation+of+fluorescent+multireporter+cells+on+zonally-organized+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+type+i+collagen+green+fluorescent+protein+transgenes+to+identify+subpopulations+of+cells+at+different+stages+of+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Use of type i collagen green fluorescent protein transgenes to identify subpopulations of cells at different stages of the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 17 (1), 15-25 (2002).</li>
<li>Maye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+col10a1-mcherry+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice.</a> Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).</li>
<li>Chokalingam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+effects+of+compression+and+time+in+culture+on+aggregate+modulus+and+on+gene+expression+and+protein+content+of+collagen+type+ii+in+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes.</a> Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).</li>
<li>Dutta, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Men+and+mice%3A+Relating+their+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Men and mice: Relating their ages.</a> Life Sci. 152, 244-248 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multi-image+cryohistology+of+mineralized+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">multi-image cryohistology of mineralized tissues.</a> J Vis Exp. (115), e54468(2016).</li>
<li>Chavez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+micro-computed+tomography+analysis+of+rodent+dentoalveolar+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Plus%22%5BJournal%5D)">Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues.</a> JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).</li>
<li>Chung, R., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+on+the+growth+plate%3A+Mechanisms+for+growth+plate+injury+repair+and+potential+cell-based+therapies+for+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Recent research on the growth plate: Mechanisms for growth plate injury repair and potential cell-based therapies for regeneration.</a> J Mol Endocrinol. 53 (1), T45-T61 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

L'uso innovativo di topi reporter in collagene tricolore consente la creazione di difetti della cartilagine di crescita con una dimensione e una posizione predeterminate, migliorando significativamente l'accuratezza dei modelli sperimentali murini per le lesioni della cartilagine di crescita. Date le piccole dimensioni dei topi di 2 settimane, è fondamentale utilizzare una piccola fresa da 0,5 mm per creare la lesione per evitare di indebolire l'arto e causare una frattura a tutto spessore. Il chirurgo deve anche applicare una pressione sufficiente quando crea il difetto per evitare di perforare troppo in profondità l'osso per lo stesso motivo. L'uso della periosonda è fondamentale per confermare una profondità costante della lesione.
Come per qualsiasi intervento chirurgico, è importante confermare un'adeguata profondità di anestesia, confermata da un pizzico occasionale del dito del piede e la sterilità viene mantenuta per tutto il tempo. Un altro punto chirurgico importante è che la dissezione smussata con un intagliatore è stata descritta perché evita di danneggiare i tessuti molli e aiuta a garantire che i topi siano in grado di deambulare immediatamente dopo il recupero dall'anestesia per raggiungere la madre topo per nutrimento e comfort. Nella nostra esperienza, le ferite chiuse con punti di sutura sono rimaste chiuse con successo e non sono necessarie clip per le ferite. Si raccomanda un intervento chirurgico sui topi a 2 settimane di età per imitare al meglio il bambino che subisce fratture della cartilagine di crescita. Uno svantaggio di questo protocollo è che, data la natura imprevedibile del parto, l'uso di questo modello murino richiede la disponibilità del chirurgo con breve preavviso.
Per quanto riguarda il posizionamento della fresa per creare il difetto, il protocollo descrive la creazione della lesione utilizzando un set di filtri rossi mCherry/Texas che illumina la zona ipertrofica all'interno della placca di crescita a causa della luminosità della fluorescenza del collagene X. Per garantire che la lesione si crei all'interno della cartilagine di accrescimento tibiale, è utile spostare leggermente l'apertura dei tessuti molli a sinistra e a destra per confermare che la cartilagine di accrescimento tibiale prossimale sia in vista e non il femore. Il passaggio tra i canali del set di filtri per illuminare la zona proliferativa dei condrociti o le sezioni ossee adiacenti è utile per confermare un posizionamento accurato rispetto alla posizione della zona proliferativa e delle sezioni ossee adiacenti.
Mentre la zona dei condrociti proliferativi e l'osso epifisario e metafisario possono essere distinti al microscopio a fluorescenza nei topi vivi, il valore reale dei reporter di collagene di tipo II e di tipo I si realizza durante l'analisi istologica della cartilagine di crescita. Data la natura acquosa dei processi crio-istologici, i tradizionali protocolli di precipitazione del colorante cromogenico non sono adatti a causa del potenziale disallineamento del colore con l'imaging fluorescente causato dalle fasi di disidratazione. Sebbene il protocollo acquoso produca modelli di colorazione simili a quelli delle sezioni di paraffina, l'imaging rapido post-colorazione è essenziale per prevenire la diffusione del colorante dal tessuto. L'utilizzo del 30% di glicerolo in acqua distillata come mezzo di montaggio può rallentare questa diffusione, consentendo la colorazione cromogenica multipla sulla stessa sezione, compresa la cartilagine con Safranin O/Fast Green.
Il processo di ossificazione endocondrale è chiaramente visibile con condrociti rossi che rivestono il ponte osseo in evoluzione (Figura 6). L'uso aggiuntivo di tecniche di immunoistochimica, per le quali sono disponibili molti anticorpi murini, potrebbe migliorare ulteriormente gli studi meccanicistici condotti in questi topi transgenici. Nel complesso, la combinazione di faxitroni, microCT e tecniche di imaging crio-istologico in questo modello murino transgenico offre una comprensione completa dei cambiamenti macroscopici e microscopici che si verificano in risposta alle lesioni della cartilagine di crescita, aprendo la strada a futuri interventi terapeutici per mitigare tali esiti avversi. Ulteriori manipolazioni genetiche di questi topi transgenici potrebbero essere fatte per consentire studi di tracciamento del lignaggio per comprendere l'origine delle cellule che sono temporalmente e spazialmente coinvolte nella guarigione. La sperimentazione sui topi con ulteriori modifiche consentirebbe lo studio delle malattie della cartilagine come l'osteocondroma, una crescita eccessiva di cartilagine e osso vicino alla cartilagine di crescita.
La coerenza del nostro modello è dimostrata dalla formazione riproducibile di ponti ossei in tutti i topi senza la necessità di scartare alcun topo dal gruppo a causa di lesioni della cartilagine articolare. Questo è un miglioramento rispetto ai modelli precedenti che si avvicinavano alla cartilagine di crescita da una finestra corticale sotto la cartilagine di crescita e inclinavano uno strumento affilato o una fresa verso l'alto verso la cartilagine di crescita e occasionalmente superavano la cartilagine articolare. Un'ulteriore lesione della cartilagine articolare non imita le lesioni della cartilagine di accrescimento che si verificano comunemente nei bambini. La lesione più precisa di questo modello animale riduce il numero di topi necessari per esperimento e questo è un altro miglioramento. L'uso di topi transgenici consente al ricercatore di concentrare la lesione su sottosezioni della cartilagine di crescita, come l'area ipertrofica/provvisoriamente calcificata o l'area epifisi/zona di riposo/zona proliferativa, senza intaccare la cartilagine articolare. Tuttavia, un limite di questo modello è la variabilità del volume del ponte osseo, che può differire fino al 30% tra gli animali feriti. Di conseguenza, rilevare un effetto clinicamente significativo sulla formazione del ponte osseo richiede ancora un gran numero di animali per raggiungere la rilevanza statistica.
I vantaggi di un modello murino come descritto qui rispetto ai modelli di lesioni della cartilagine di crescita di ratto o coniglio precedentemente pubblicati 7,9,10,14, includono un numero inferiore di animali utilizzati, riduzione dei costi, una dimensione di replica efficiente grazie alla formazione riproducibile della barra ossea, un intervallo di tempo di studio più breve e un posizionamento più preciso della lesione grazie all'imaging dal vivo dei topi transgenici tripli. Sebbene non sia discusso in dettaglio, questo modello murino può essere utilizzato per testare impianti di ingegneria tissutale o biomateriali che forniscono fattori di crescita. Una notevole limitazione di questo metodo murino è che la dimensione di un impianto utilizzato per somministrare farmaci terapeutici o cellule è limitata al volume del difetto di circa una sfera di 0,5 mm di diametro. Solo i modelli animali più grandi possono ospitare il volume di materiale di prova che verrebbe utilizzato nei pazienti umani. Il difetto della fresa creato in questo protocollo non ha la stessa geometria di una frattura sottile e quindi differisce dalle lesioni umane reali. Ciononostante, i vantaggi di questo modello murino sono molteplici, e l'approccio laterale evita di danneggiare la cartilagine articolare che si verificherebbe quando ci si avvicina alla cieca sopra o sotto la placca di accrescimento in linea con l'asse lungo tibiale. Questa metodologia rappresenta un salto sostanziale nella ricerca sulle lesioni della cartilagine di crescita, fornendo un metodo dettagliato e riproducibile per indagare la patologia e valutare nuove strategie terapeutiche.

Le placche di crescita ossea svolgono un ruolo fondamentale nella crescita longitudinale delle ossa lunghe durante l'infanzia e l'adolescenza1. Situata alle estremità delle ossa lunghe, la placca di crescita comprende più zone, con i condrociti che sono i componenti cellulari chiave responsabili della produzione e del mantenimento di questa area di crescita dinamica. L'ossificazione endocondrale della cartilagine di crescita si verifica per allungare ed espandere le ossa attraverso una progressione sequenziale di proliferazione dei condrociti, ipertrofia, apoptosi, invasione da parte dei vasi sanguigni, reclutamento di cellule osteoprogenitrici e, infine, formazione ossea2. Poiché la cartilagine di accrescimento è relativamente più morbida dell'osso, è altamente suscettibile alla frattura quando le ossa sono sovraccaricate durante lo sport o altre attività. La classificazione di Salter-Harris delinea cinque tipi distinti di lesioni da cartilagine di accrescimento3. La frattura di tipo II attraverso la zona ipertrofica della cartilagine di accrescimento e il tessuto osseo inferiore adiacente è la più prevalente4. Un ponte osseo si forma spesso in risposta a lesioni della zona ipertrofica o dell'osso adiacente e porta alla fusione prematura delle sezioni ossee lunghe adiacenti5. I ponti ossei impediscono la normale espansione della cartilagine di crescita. Attualmente, non sono disponibili trattamenti preventivi per la formazione del ponte osseo e alcuni non vengono trattati a seconda dell'età del paziente e delle dimensioni e della posizione del ponte osseo6. Quando la malformazione degli arti è grave, le opzioni chirurgiche includono la rimozione seguita dall'impianto di materiali interposizionali come grasso o gomma siliconica o procedure correttive di osteotomia e allungamento osseo; Eppure un ponte osseo può ancora riformarsi6. Sono necessarie ulteriori ricerche per prevenire la formazione di ponti ossei e per migliorare gli esiti dei bambini con lesioni della cartilagine di crescita ossea.
Sono stati stabiliti diversi modelli animali per esplorare i meccanismi sottostanti e sviluppare nuove strategie per prevenire la compromissione del ponte osseo delle placche di crescita dopo la lesione 7,8,9,10,11,12. Questi modelli animali si concentrano spesso sulla placca di accrescimento tibiale prossimale e sulla cartilagine di accrescimento del femore distale come sito di lesione primaria, dato che questo è tipicamente il luogo in cui si verificano lesioni umane. I difetti ossei degli animali sono creati da un approccio laterale simile a un vero e proprio percorso di frattura o da un approccio dall'alto o dal basso della cartilagine di accrescimento che porta a un foro centrale nella cartilagine di accrescimento. In un modello di ratto precedentemente riportato, un difetto della cartilagine di accrescimento viene creato inserendo una fresa dentale attraverso una finestra corticale nell'asta mediana tibiale e perforando verso l'alto attraverso il midollo verso l'articolazione del ginocchio per ferire centralmente la cartilaginedi accrescimento 7,13. In alternativa, un recente modello murino utilizza un approccio laterale con un ago di piccolo diametro per creare una traccia planare dell'ago attraverso la placca di crescita8. In un modello di ratto ampiamente utilizzato, il difetto viene creato nella cartilagine di crescita del femore distale perforando la cartilagine articolare tra i condili 9,14. Negli animali più grandi come conigli e pecore, i difetti della cartilagine di accrescimento sono stati indotti lateralmente direttamente nella tibia prossimale e nel femore distale perforando o tagliando la cartilagine di accrescimento o avvicinandosi dal basso e creando un difetto centrale lasciando inalterati i bordi della cartilagine di accrescimento 10,11,12,15.
I modelli murini per le lesioni della cartilagine di crescita sono vantaggiosi per gli studi meccanicistici che possono essere realizzati con topi geneticamente modificati, come gli studi di tracciamento del lignaggio delle cellule staminali8. Tuttavia, una sfida significativa nei modelli animali murini o di ratto è ottenere lesioni coerenti e precise in una particolare sottoregione della cartilagine di crescita. La lesione di particolari zone della cartilagine di accrescimento e dell'osso adiacente è necessaria per imitare uno dei percorsi di frattura clinicamente rilevanti descritti dalle classificazioni di Salter-Harris. Le sfide fino ad oggi nei modelli di roditori sono principalmente dovute alla mancanza di mezzi visivi per identificare i substrati della cartilagine di crescita durante la creazione chirurgica della lesione. Questo protocollo descrive una tecnica raffinata per creare difetti della cartilagine di accrescimento in substrati mirati della cartilagine murina utilizzando topi transgenici tripli che esprimono reporter fluorescenti di collagene I, II e X 16,17,18. La fluorescenza di colore diverso di questi collageni in ciascuna delle zone primarie della cartilagine di accrescimento consente la discriminazione visiva delle varie sezioni della cartilagine di accrescimento sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza durante la creazione chirurgica della lesione della cartilagine di accrescimento. L'uso di questi topi transgenici consente una precisione delle lesioni senza precedenti in un topo giovane in una fase di sviluppo paragonabile a quella dei bambini feriti.

<table><tbody><tr><td>2-metil-butano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi antisettici per alcol</td><td>Acme United Corporation</td><td>H305-200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Software AxioVision</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Betadine (10% povidone-iodio)</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>67618-150-01</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td></td></tr><tr><td>CFP set di filtri</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td></td></tr><tr><td>Lame per criostato</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td></td></tr><tr><td>Sezione Cryotape</td><td>Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Curvo fine forbice&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche per zanzare curve</td><td>HuFriedyGroup</td><td>H3</td><td></td></tr><tr><td>cy5 set</td><td>di filtri Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>Fresa dentale (diametro 0,5 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intagliatore discoidale cleoide dentale</td><td>ACE Surgical Supply Inc.</td><td>6200097A-EA</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perle di vetro a secco (Inotech Steri 350)</td><td>Inotech Bioscience, LLC</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per le orecchie</td><td>Fine Science Tools</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elettrico Comando elettronico a pedale</td><td>Nouvag AG</td><td>1866nou</td><td></td></tr><tr><td>Motori elettronici 31 ESS</td><td>Nouvag AG</td><td>2063nou</td><td></td></tr><tr><td>Barriera ambientale di superficie (3 x 12 pollici tubo sox)</td><td>Patterson Companies, Inc.</td><td>BB-0312H</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (70%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (buprenorfina sospensione iniettabile a rilascio prolungato) 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>86084-100-30</td><td></td></tr><tr><td>Cabina radiografica Faxitron</td><td>Parametro scientifico Kubtech</td><td>Stereomicroscopio</td><td></td></tr> a <tr><td>fluorescenza</td><td>Carl Zeiss AG Set di</td><td>filtri GFP Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Manipolo (contrangolo 32:1 pulsante)</td><td>Nouvag AG</td><td>5201</td><td></td></tr><tr><td>Unità di controllo del sistema di implantologia/chirurgia orale (Straumann)</td><td>Nouvag AG</td><td>SEM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Busta di sterilizzazione a tenuta istantanea con doppi indicatori di processo interni/esterni (3 1/2 x 5 1/4&nbsp; pollici)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-50</td><td></td></tr><tr><td>Busta di sterilizzazione a chiusura istantanea con doppi indicatori di processo interni/esterni (5 4/1 x 10 pollici)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina (29 G)</td><td>Exel International</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano& nbsp;</td><td>Dechra Pharmaceuticals plc</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr>Sistema <td></td><td></td><td></td><td>di anestesia isoflurano</td></tr><tr><td>mCherry set di filtri</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>Forbice per micro-dissezione</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ago (20 G)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Porta ago</td><td>HuFriedyGroup</td><td>NHCW</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra (10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi applicatori non sterili</td><td>Allegro Industries</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>Garza non tessuta (3 x 3 pollici)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028560</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo ottico Norland, 61</td><td>Adesivo ottico Norland Optiland</td><td>Optiv, 61</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico (lubrificante oculare Optixcare)</td><td>CLC Medica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Sonda parodontale</td><td>HuFriedyGroup</td><td>PQW</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4 (1x)</td><td>Gibco, by Life Technologies</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in plastica</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71890-01</td><td></td></tr><tr><td>Clipper/trimmer professionale (Wahl Classic Peanut)</td><td>Wahl Clipper Corporation</td><td>8685</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>62800-46</td><td></td></tr><tr><td>Software Scanco Medical</td><td>SCANCO Medical</td><td>Scanco &mu; CT 50</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Nitrito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td></td></tr><tr><td>Tartrato di sodio bibasico diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td></td></tr><tr><td>Disco campione</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica in acciaio inossidabile #15</td><td>Prodotti chirurgici Aspen, Inc.</td><td></td><td></td>371615</tr><tr><td>Guanti chirurgici sterili</td><td>Cardinal Health, Inc.</td><td>2D72PT65X</td><td></td></tr><tr><td>Telo per asciugamani sterile (18 x 26 pollici)</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio (1 mL)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sutura vicryl rivestita intrecciata non colorata (5-0)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J490G</td><td></td></tr><tr><td>Luce UV nera</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr></tbody></table>

modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

Le placche di crescita della cartilagine nelle ossa dei bambini consentono l'allungamento degli arti, ma sono deboli rispetto all'osso, rendendole inclini alla frattura quando le ossa sono sovraccaricate. Sono necessari trattamenti migliori per le placche di crescita gravemente fratturate perché la risposta alla lesione è un ponte osseo che fonde prematuramente la cartilagine di crescita, portando a arti rachitici e/o storti. I modelli murini di lesione della cartilagine di accrescimento sono vantaggiosi per gli studi meccanicistici, ma sono impegnativi perché è difficile visualizzare e danneggiare con precisione le piccole cartilagini di accrescimento nei topi giovani. Descriviamo qui un modello di lesione della cartilagine di crescita migliorata utilizzando topi transgenici con reporter fluorescenti tri-lineage per collagene di tipo I, II e X.
Questi topi mostrano una fluorescenza nativa associata ai tre substrati primari della cartilagine di crescita. Una lesione della cartilagine di accrescimento simile a una lesione di Salter-Harris di tipo II viene creata in modo riproducibile con una fresa utilizzando la sezione ipertrofica della cartilagine di accrescimento come riferimento durante l'imaging dal vivo sotto guida di stereoscopia a fluorescenza. L'analisi istologica congelata della fluorescenza nativa semplifica la valutazione della risposta cellulare alla lesione. Questa metodologia rappresenta un salto sostanziale nella ricerca sulle lesioni della cartilagine di crescita, fornendo un metodo dettagliato e riproducibile per indagare la patologia e valutare nuove strategie terapeutiche.

Questo protocollo utilizza topi reporter fluorescenti trilineari per indurre con precisione un difetto della placca di crescita laterale nella tibia prossimale, sfruttando la fluorescenza rossa intrinseca emessa dal collagene di tipo X per la guida chirurgica. La vista che il chirurgo ha mentre guarda attraverso l'oculare dello stereomicroscopio con il set di filtri mCherry è mostrata nella Figura 2D. La fluorescenza nativa di tipo X consente al chirurgo di posizionare la fresa nella zona ipertrofica e creare una lesione che imita un tipo comune di lesione della cartilagine di accrescimento che porta a un ponte osseo (Figura 2F). La fluorescenza sotto il canale rosso è la più brillante e, quindi, consigliata per l'uso durante il posizionamento della fresa. In alternativa, la creazione di difetti potrebbe essere guidata utilizzando altri colori della fluorescenza nativa dei topi tripli transgenici se l'obiettivo dell'esperimento è studiare lesioni in altre zone della cartilagine di crescita rispetto alla zona ipertrofica e alla regione calcificata adiacente.
La creazione di un difetto simile a Salter-Harris di tipo II nella zona ipertrofica della cartilagine di accrescimento e del tessuto osseo inferiore adiacente, utilizzando una fresa dentale di 0,5 mm di diametro, è stata convalidata attraverso microCT e crio-istologia delle tibie prossimali danneggiate (tempo 0) rispetto ai controlli laterali illesi in N = 3 topi (Figura 4). I difetti erano difficili da vedere nelle immagini microCT 3D, ma erano rilevabili nelle sezioni trasversali 2D (Figura 3A, B, E, F). La Figura 3G mostra la distribuzione delle cellule ossee produttrici di collagene di tipo I (fluorescenza verde), dei condrociti proliferativi produttori di collagene di tipo II (fluorescenza ciano) e dei condrociti ipertrofici produttori di collagene di tipo X. Nell'immagine del topo ferito (Figura 4G), c'è una rottura della zona ipertrofica, dello strato provvisoriamente calcificato e di parte dell'osso di nuova formazione rispetto al controllo con la zona proliferativa solo leggermente disturbata. La colorazione Safranin O/Fast Green (Figura 4H) illustra al meglio la posizione del difetto all'interno della cartilagine di crescita danneggiata poiché tutte le cellule sono chiaramente visibili.
L'analisi a raggi X fornisce alcune informazioni sui topi vivi per quanto riguarda l'impatto di questo tipo di lesione della cartilagine di crescita sulla lunghezza della tibia e sulla formazione del ponte osseo nel tempo (Figura 3). L'imaging comparativo tra tibie illese (Figura 3A) e ferite (Figura 3B), prelevato prima dell'intervento chirurgico e 3 settimane dopo l'intervento, rivela una grande quantità di crescita degli arti, assottigliamento delle placche di crescita e una distinta regione opaca che si è sviluppata nell'area della cartilagine di crescita lesa a 3 settimane. Questa opacità all'interno della cartilagine di crescita non è presente nella controparte illesa né nei topi prima dell'intervento chirurgico. Il faxitron è quindi un modo per osservare i cambiamenti patologici indotti dalla lesione nei topi vivi, come la formazione di un ponte osseo e i cambiamenti nella lunghezza degli arti.
L'imaging MicroCT delle ossa sezionate offre una visualizzazione dettagliata della formazione del ponte osseo all'interno delle placche di crescita danneggiate tre settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura 5). Come si vede nelle immagini di sei diversi topi feriti mostrati nella Figura 5, c'è uno sviluppo costante del ponte osseo in tutti i topi. Utilizzando il software Scanco Medical, il volume del ponte osseo è stato calcolato esaminando ciascuna sezione della placca di crescita tibiale prossimale, delineando l'area del ponte osseo (Figura 5B) con lo strumento di selezione e quindi integrando ciascuna area della sezione nell'intero volume della placca di crescita per ottenere il volume totale24. Il volume del ponte osseo calcolato in questo modo era 0,0761 mm3 ± 0,0246 (media ± deviazione standard, N = 6). La maggior parte dei ponti ossei si forma vicino al centro della cartilagine di accrescimento nonostante l'approccio laterale, che ferisce il bordo esterno e il centro della cartilagine di accrescimento. Questo fenomeno può essere attribuito al fatto che le cellule staminali mesenchimali (MSC) del midollo osseo, piuttosto che del pericondrio, sono responsabili della formazione del ponte osseo25.
In questi topi transgenici tricolori, l'analisi crio-istologica della cartilagine di crescita danneggiata è arricchita dalla fluorescenza del collagene nativo (Figura 6). Rivela la complessa interazione tra cellule ossee e condrociti nel sito della lesione. Le immagini MicroCT mostrate nella Figura 6J,K sono state fornite al tecnico istologo per guidare l'inclusione e il sezionamento. Le cellule ossee produttrici di collagene di tipo I sono visibili nella Figura 6L, O, P (fluorescenza verde), mentre i condrociti proliferativi produttori di collagene di tipo II sono visibili nella Figura 6L, O, Q (fluorescenza ciano). I condrociti ipertrofici che producono collagene di tipo X sono visibili nella Figura 6L,O,R (fluorescenza rossa). Questo approccio a fluorescenza multicolore consente un esame dettagliato della differenziazione dei condrociti post-operatoria all'interno dell'area del ponte osseo su uno sfondo di tessuto mineralizzato. La colorazione DAPI è stata utilizzata per confermare la distribuzione di tutti i tipi di cellule all'interno dell'area della cartilagine di crescita (Figura 6M). La colorazione Safranin O/Fast Green dimostra l'organizzazione composita e strutturale della cartilagine e dell'osso all'interno della cartilagine di crescita lesionata (Figura 6N). L'imaging di queste sezioni colorate con un set di filtri Cy5 illumina notevolmente le cellule della zona di riposo all'interfaccia tra l'osso epifisario e la cartilagine.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig03.jpg"> Figura 3: Immagini radiografiche del controllo controlaterale e delle tibie di topo ferite. (A) Le immagini a raggi X della tibia di controllo controlaterale vengono scattate appena prima della lesione quando i topi hanno 2 settimane e a 3 settimane dopo l'intervento chirurgico quando i topi hanno 5 settimane, dimostrando l'entità della crescita che si verifica durante questo periodo. (B) Tibia ferita dallo stesso topo negli stessi punti temporali di cui al punto (A). I punti di riferimento utilizzati per le misurazioni della lunghezza della tibia sono l'apice della testa della tibia prossimale fino all'estremità della tibia all'altezza dell'articolazione della caviglia (frecce rosse a due punte). Il ponte osseo opaco è visibile nella cartilagine di crescita della tibia prossimale lesionata a 5 settimane. Barre della scala = 5,00 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig04.jpg"> Figura 4: MicroCT e immagini istologiche del controllo controlaterale a tempo zero e tibie prossimali di topo ferite. (A,E) e (B,F) raffigurano viste microCT 3D e 2D trasversali, con il difetto indicato da frecce rosse in (E) e (F). (C,G) Immagini crio-istologiche combinate in composito che fondono tre strati di fluorescenza innata con uno strato di tessuto mineralizzato. Le cellule verdi (Col3.6GFPtpz) sono le cellule ossee produttrici di collagene di tipo I, le cellule di colore blu ciano (Col2A1GFPcyan) sono condrociti proliferativi produttori di collagene di tipo II e i globuli rossi (Col10A1RFPchry) sono condrociti ipertrofici che producono collagene di tipo X. (D,H) Safranina O/Colorazione Fast Green della stessa regione di (C) e (G). Barre della scala = 1,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig05.jpg"> Figura 5: Immagini MicroCT dei ponti ossei formati da questo protocollo. (A,C,E,G,I,K) Sezioni trasversali della placca di crescita tibiale prossimale di sei diversi topi a 3 settimane dalla creazione del difetto della fresa. Ponte osseo delineato da una linea tratteggiata rossa in (A). (B,D,F,H,J,L) Ricostruzioni 3D con un piano longitudinale tagliato. Ponte osseo delineato da una linea tratteggiata rossa in (B). Barre della scala = 1,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig06.jpg"> Figura 6: MicroTC e immagini istologiche del controllo controlaterale e della tibia prossimale di topo lesionata con formazione di ponti ossei. (A,J) e (B,K) raffigurano viste microCT 3D e 2D trasversali, con il ponte osseo indicato da frecce gialle in (J) e (K). (C,L) Immagini crio-istologiche combinate in composito che fondono tre strati di fluorescenza innata con uno strato di tessuto mineralizzato. Le cellule verdi (Col3.6GFPtpz) sono le cellule ossee produttrici di collagene di tipo I, le cellule di colore blu ciano (Col2A1GFPcyan) sono condrociti proliferativi produttori di collagene di tipo II e i globuli rossi (Col10A1RFPchry) sono condrociti ipertrofici che producono collagene di tipo X. La casella bianca indica l'ingrandimento maggiore mostrato nei pannelli F e O. (D,M) Il tessuto mineralizzato e la colorazione DAPI nell'area della placca di crescita dei pannelli C e L. (E,N) Colorazione Safranin O/Fast Green della stessa regione di (D) e (M) scansionata con fluorescenza cy5. (F,O) Un ingrandimento maggiore dell'area della piastra di crescita nell'immagine unita dei pannelli C e L. (G-I,P-R) Singoli canali della fluorescenza nativa mostrati con uno sfondo tissutale mineralizzato. Barre della scala = 1,0 mm (A-E) e (J-N), = 250 μm in (F-I) e (O-R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un modello murino migliorato per le lesioni della cartilagine di crescita ossea degli adolescenti. Utilizzando topi transgenici con reporter fluorescenti tri-lineage per collagene di tipo I, II e X, le matrici primarie associate a tre diversi substrati della placca di crescita, il posizionamento delle lesioni è guidato dalla fluorescenza nativa al microscopio.

Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

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