Name: Metodo basato sullestrazione di Apoplast per migliorare la purezza delle proteine ricombinanti prodotte dalle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Scopri il metodo di estrazione dell'apoplasto per ottenere proteine ricombinanti ad alta purezza da Nicotiana benthamiana. Questa tecnica riduce l'interferenza delle proteine intracellulari e migliora l'efficienza della purificazione.

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Questo lavoro è sostenuto dall'Associazione per la promozione dell'innovazione giovanile CAS (2021084) e dal Fondo di sostegno al progetto di distribuzione chiave del piano d'azione triennale dell'Istituto di microbiologia, Accademia cinese delle scienze.

1. Preparazione delle piante di N. benthamiana
<ol><li>Mettere i blocchi di piantina in un vassoio, aggiungere 1 L di acqua e immergere per circa 2 ore fino a completa saturazione.</li>
	<li>Cospargere uniformemente i semi di N. benthamiana selvatici sui blocchi della piantina, coprire con un coperchio e germinare per 1 settimana. Coltiva N. benthamiana in serra con fotoperiodo di 18 ore, 24 °C, 45% di umidità relativa e concima ogni 2 settimane.</li>
	<li>Una volta che i semi sono germogliati, usa una pinzetta per rimuovere delicatamente una piantina, facendo attenzione a non danneggiare le sue radici. Scava una piccola fossa al centro di un nuovo vassoio, mettici dentro la piantina e copri leggermente le radici con la terra. Coprite con un coperchio e continuate a crescere.</li>
	<li>Cresci fino a quando le piantine hanno tre foglie, con il coperchio. Togliete il coperchio quando emerge la 4a fogliavera.</li>
	<li>Lasciare che le piante continuino a crescere per altre due settimane prima dell'agroinfiltrazione.</li>
</ol>2. Costruzione della GFP-His ricombinante
<ol><li>Eseguire l'ottimizzazione del codone di N. benthamiana e la sintesi di GFP e PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) in base alle sequenze geniche.</li>
	<li>Effettuare la doppia digestione del vettore pCAMBIA1300 utilizzando gli enzimi Xba I e Sac I (vedi Tabella dei Materiali).</li>
	<li>Eseguire l'amplificazione di PR1a utilizzando primer a monte (TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT TGTTCTCTTTTC) e primer a valle (TCCTCG CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA GTGGG), amplificazione della GFP mediante primer a monte (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGGGTCGACATGGTGAG CAAGGGCGAGGA) e primer a valle (GGGGAAATTCGAGCTCAGTGGTGATGGTGGTG GTGAGATCTTCCGGACTTGT).</li>
	<li>Utilizzando la ricombinazione omologa, clonare PR1a e GFP nel vettore di espressione della pianta pCAMBIA1300. Dopo il trasferimento in E. coli, selezionare i singoli cloni e inviarli all'azienda per il sequenziamento. Il confronto tra i risultati del sequenziamento e il plasmide giusto è il plasmide ricombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, indicato come p35s-PR1a-GFP-His.</li>
</ol>3. Produzione di GFP-His in N. benthamiana
<ol><li>Aggiungere 1 μL di plasmide GFP in 50 μL di cellule del recettore dell'Agrobacterium GV3101, mescolare delicatamente e aggiungere alla coppa dell'elettrodo, rimuovere dopo l'elettrocuzione sull'elettroshocker.</li>
	<li>Distribuire l'Agrobacterium tumefaciens trasformato su una piastra di terreno solido LB contenente 50 μg/mL di kanamicina (Kan) e 50 μg/mL di rifampicina (Rif). Incubare capovolto a 28 °C per 48 h. Il vettore pCAMBIA1300 è kan-resistente e l'Agrobacterium è resistente al rif; solo l'Agrobacterium corretto può crescere su piastre con kan e rif. I cloni monoclonali erano i trasformanti positivi, denominati A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).</li>
	<li>Usa uno stuzzicadenti sterilizzato per prelevare una quantità appropriata di AtGPG e inocularela in 4 ml di LB liquido con Kan e Rif. Coltura a 28 °C, 220-300 giri/min per 24 h.</li>
	<li>Sottocoltura dei batteri 1:50 in LB fresco (50 μg/mL Kan, 10 mM 2-(N-Morpholino) acido etansolfonico (MES), 20 μM acetosiringone (AS)) e incubare a 28 °C, 220-300 rpm per 10-12 h.</li>
	<li>Raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 1500 x g per 10 minuti e risospendere il pellet con 1 mL di MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).</li>
	<li>Misura e regola la densità ottica (OD) di AtGPG a OD600=0,8 utilizzando MMA. Incubare i batteri per altre 2-4 ore a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione batterica con una siringa senza ago, premerla leggermente contro la parte posteriore delle foglie e fare pressione per far penetrare la soluzione nelle foglie. Inietta solo le 3-4 foglie centrali per pianta.</li>
	<li>Continua a coltivare N. benthamiana in serra per 3-4 giorni prima di raccogliere le foglie per l'estrazione delle proteine.</li>
</ol>4. Osservazione della localizzazione subcellulare della GFP
<ol><li>Dopo 48 h di agroinfiltrazione, selezionare un'anta piana e utilizzare un punzone da 6 mm per bloccare la lama per la punzonatura.</li>
	<li>Versare la soluzione di saccarosio al 30% su un vetrino, posizionare il campione di foglia con la parte posteriore rivolta verso l'alto e coprirlo con un vetro di copertura.</li>
	<li>Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 488 nm e rilevare la fluorescenza verde a 490-550 nm dopo un ingrandimento di 400x. Scatta la prima foto una volta preparata la diapositiva e un'altra 10 minuti dopo.</li>
</ol>5. Estrazione della GFP dalla pianta
<ol><li>Estrazione AWF<ol><li>Raccogliere le foglie fresche intatte di N. benthamiana che esprimono GFP ricombinante a 3 giorni dall'agroinfiltrazione. Trattare delicatamente la foglia e mantenerne l'integrità per evitare l'efflusso di proteine intracellulari. Usa immediatamente le foglie raccolte per il passaggio successivo per evitare la degradazione delle proteine.</li>
		<li>Sciacquare la lama della foglia con ddH2O sterilizzato preraffreddato per rimuovere i detriti.</li>
		<li>Pesare le foglie fresche e immergere 20 g di foglie (lato abassiale rivolto verso il basso) in 100 mL di tampone fosfato 100 mM pre-raffreddato (PB 100 mM Na2HPO4 e 100 mM NaH2PO4 sono stati configurati separatamente e miscelati a un rapporto di 2,2:1 pH 7,0) in un becher a bocca larga da 200 mL. Coprire le foglie con filato di nylon a maglia fine da 100 maglie (vedi Tabella dei materiali) e una piastra di plastica. NOTA: Il pre-raffreddamento impedisce la degradazione delle proteine. I volumi tampone possono essere regolati in base alla scala sperimentale. Assicurati che tutte le foglie siano immerse.</li>
		<li>Posizionare il becher in una pompa a vuoto. Applicare il vuoto a 0,8 MPa per 1 minuto, quindi ripristinare rapidamente la pressione atmosferica.</li>
		<li>Rimuovere le foglie dal tampone e asciugare delicatamente con carta assorbente. Arrotolare le foglie, avvolgerle con il filo a rete e mettere 5 g di foglie in ogni provetta da centrifuga da 50 ml. Per raccogliere l'AWF, posizionare le foglie arrotolate con la punta rivolta verso l'alto in tubi con filo a rete fissato dai tappi dei tubi.</li>
		<li>Centrifugare a 4 °C, 500 x g per 5 min. Rimuovere le foglie e raccogliere l'AWF sul fondo della provetta utilizzando una pipetta. Da ciascuna provetta si possono ottenere circa 5 mL di AWF. NOTA: Al fine di ridurre al minimo l'interferenza delle proteine intracellulari e di estrarre la massima quantità di proteine AWF, l'estrazione può essere ripetuta 2x-3x, ma non più di 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrazione totale di proteine solubili<ol><li>Macinare 20 g di foglie in polvere fine in azoto liquido. Aggiungere il tampone di estrazione (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Triton X-100, 0,034% β-mercaptoetanolo (vedere la Tabella dei materiali)) in rapporto 1: 2.</li>
		<li>Agitare l'omogeneizzato in un mixer verticale per 30 minuti a 4 °C. Centrifugare omogeneizzare a 13.000 x g per 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta e ripetere la centrifugazione per 15 minuti. Trasferire il surnatante chiarificato in un'altra provetta.</li>
		<li>Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali) per ottenere l'estratto proteico solubile totale.</li>
	</ol></li>
</ol>  
6. Purificazione di GFP-His con cromatografia di affinità al nichel (Ni)
NOTA: Eseguire tutti i passaggi a 4 °C.
<ol><li>Aggiungere la resina di Ni sefarosio excel (vedere la tabella dei materiali) a una provetta in un rapporto 1:1000 rispetto al volume dell'estratto proteico del passaggio 5.1.6. Il volume della resina è pari a 1/1000del volume dell'estratto proteico.</li>
	<li>Lavare separatamente la resina Ni 3x con un volume di resina 10x di ddH2O e PB (pH 7,0) separatamente e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Incubare l'estratto proteico con la resina di Ni per 2 ore per consentire il legame completo. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti per rimuovere le proteine non legate nel surnatante. Lavare 3 volte con 20 volte il volume di resina di PB. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Eluire GFP-His aggiungendo 10 volte il volume di resina di 250 mM di imidazolo (50 mM di Tris-HCl pH 7,4, 150 mM di NaCl, 10% di glicerolo, 250 mM di imidazolo) e raccogliere il surnatante.</li>
</ol>7. Colorazione blu di Coomassie delle proteine
<ol><li>Aggiungere 10 μL di tampone di caricamento SDS 5x a 40 μL di campioni proteici, far bollire per 10 minuti, quindi eseguire su SDS-PAGE al 15% a 110 V per 60 minuti.</li>
	<li>Colorare i gel proteici con soluzione di blu di Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanolo, 10% acido acetico glaciale) per 2 ore.</li>
	<li>Versare la soluzione e lavare con soluzione decolorante per 2 ore. Osservare il gel; Le proteine sul gel saranno colorate di blu.</li>
</ol>8. Western blotting delle proteine
<ol><li>Aggiungere 10 μL di tampone di caricamento SDS 5x a 40 μL di campioni proteici, far bollire per 10 minuti, quindi eseguire su SDS-PAGE al 15% a 110 V per 60 minuti.</li>
	<li>Trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 μm a 280 mA. Bloccare la membrana con latte scremato al 5% per 1 ora.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi anti-His-tag a 1:5000 e incubare la membrana con gli anticorpi per 1 ora. Utilizzare la soluzione salina tris-tamponata e tween 20 (TBST) per lavare la membrana 4 volte per 5 minuti.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi anti-topo a 1:10000 e incubare la membrana con gli anticorpi per 1 ora. Utilizzare TBST per lavare la membrana 4 volte per 5 minuti.</li>
	<li>Mescolare il rivelatore (vedi Tabella dei materiali) nel rapporto di 1:1. Aggiungere 400 μl alla membrana e lasciare agire per 1 minuto. Scatta fotografie dopo 1 minuto di esposizione con un visualizzatore.</li>
</ol>9. Saggio della concentrazione proteica
<ol><li>Aggiungere 5 μL di proteine a 1 mL di reagente colorante Bradford 1x e reagire per 5 minuti.</li>
	<li>Determinare il valore OD595 dopo l'azzeramento e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard.</li>
</ol>10. Quantificazione delle proteine 31
<ol><li>Eseguire il Western blotting di campioni proteici insieme agli standard.</li>
	<li>Esegui la quantificazione della GFP in rapporto agli standard utilizzando l'analisi della scala di grigi ImageJ 1.5.0.</li>
</ol>

Estrazione e purificazione efficiente di GFP-His dalle foglie di N. benthamiana

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<li>Streatfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+achieve+high-level+heterologous+protein+production+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants.</a> Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).</li>
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<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+Apoplast-localized+lipid+transfer+protein+TaLTP3+enhances+defense+responses+against+Puccinia+triticina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina.</a> Front Plant Sci. 12, 771806(2021).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

L'uso delle piante per produrre proteine terapeutiche si è espanso rapidamente negli ultimi anni 1,2,3,4,5,6. I geni codificanti le proteine vengono clonati in vettori di espressione e trasportati nei tessuti vegetali tramite agroinfiltrazione. Dopo la produzione da parte delle cellule vegetali, le proteine vengono purificate per le applicazioni a valle. Tipicamente, le proteine ricombinanti vengono purificate dagli estratti di TSP. Tuttavia, abbondanti proteine vegetali e citocromi rilasciati dalle cellule vegetali durante l'estrazione possono ostacolare la purificazione33. Da un lato, i citocromi delle piante possono ostruire le colonne di separazione, rallentando l'elaborazione17; d'altra parte, proteine altamente abbondanti come RuBisCO sono difficili da rimuovere, riducendo la purezza 18,19. Questi problemi diventano più problematici quando le proteine bersaglio sono espresse a bassi livelli. La purificazione da AWF aggira questi problemi, consentendo una maggiore purezza (Figura 2J).
Sebbene l'estrazione dell'AWF sia stata ampiamente utilizzata in biologia vegetale 24,25,26,27, è raramente sfruttata nelle condutture dell'agricoltura molecolare. Qui, utilizziamo un modello GFP di origine vegetale per dimostrare la purificazione delle proteine basata su AWF. L'estrazione della GFP dall'AWF è stata eseguita aggiungendo un peptide segnale per consentire la secrezione di GFP nello spazio dell'apoplasto. Questo metodo estrae le proteine con maggiore omogeneità e riduce i costi di lavorazione delle proteine a valle. Diverse considerazioni meritano di essere studiate in futuro per l'implementazione della purificazione AWF nei bioreattori delle piante. In primo luogo, una secrezione efficiente richiede la fusione di specifici peptidi segnale N-terminali. In secondo luogo, per preservare la qualità dell'AWF, le foglie intatte devono essere lavorate rapidamente dopo la raccolta senza congelamento, che rilascia contenuti intracellulari. In terzo luogo, il PB estrae efficacemente le proteine AWF34, ma il pH del tampone e la concentrazione di sale dovrebbero essere adattati per le singole proteine ricombinanti (Figura 2C-D). In quarto luogo, abbiamo ottenuto proteine purificate da 200 g di N. benthamiana molte volte in condizioni di laboratorio con purezza e resa stabili. Per essere scalati per l'uso in fabbrica, vengono richiesti recipienti e pompe per vuoto più grandi e un metodo di purificazione più efficace, e potrebbe essere necessario ottimizzare condizioni come la durata del vuoto, il numero di recuperi, ecc.
Questo metodo è limitato dal fatto che le proteine esogene sono secrete nell'AWF e le proteine all'interno della membrana plasmatica sono deserte (Figura 2H-I). Porta il vantaggio di ottenere proteine purificate più elevate con una corretta modifica, ma a un costo di resa più elevato. Il principale collo di bottiglia tecnico per la purificazione basata su AWF è il miglioramento del livello di proteina target all'interno di AWF. L'accoppiamento con promotori forti e sistemi di secrezione ottimizzati migliorerà le piattaforme di espressione delle piante sia per un'elevata purezza che per maggiori rese. Per superare questo collo di bottiglia, nel lavoro futuro è necessario un sistema di produzione più elevato e un sistema di secrezione più efficace.

Al giorno d'oggi, sono in fase di studio varie proteine terapeutiche ricombinanti prodotte dalle piante, tra cui anticorpi, vaccini, proteine bioattive, enzimi e piccoli polipeptidi 1,2,3,4,5,6. Le piante stanno diventando una piattaforma sempre più utilizzata per la produzione di proteine terapeutiche grazie alla loro sicurezza, al basso costo e alla capacità di scalare rapidamente la produzione 7,8. L'espressione e la modificazione delle proteine nei sistemi vegetali, insieme alla purificazione delle proteine, sono fattori critici che determinano la produttività dei bioreattori delle piante 9,10. Migliorare la produttività delle piante e ottenere proteine target di elevata purezza sono le sfide principali che i sistemi di produzione a base vegetale devono affrontare11,12.
La localizzazione subcellulare e la modifica delle proteine ricombinanti dipendono dallo specifico peptide segnale codificato all'N-terminale, che indirizza la proteina alla sua destinazione finale nell'organello durante l'espressione genica. Le proteine ricombinanti sono progettate per localizzarsi nell'apoplasto, nel reticolo endoplasmatico (ER), nel cloroplasto, nel vacuolo o nel citoplasma, in base alle loro proprietà uniche13. Per gli antigeni e gli anticorpi, sono preferite le proteine secrete. Prima della secrezione, le proteine progrediscono attraverso l'ER e il Golgi per il corretto ripiegamento e le modifiche post-traduzionali 14,15,16.
Dopo la produzione nelle piante, le proteine ricombinanti devono essere purificate da estratti vegetali. Tipicamente, le proteine vengono purificate da estratti vegetali solubili totali, che contengono abbondanti proteine intracellulari, prodotti mal ripiegati e non modificati e citocromi17. Per rimuovere le impurità, gli estratti vegetali subiscono un frazionamento esteso, tra cui la cromatografia di affinità specifica per ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (RuBisCO), la precipitazione dei fitati, la precipitazione del polietilenglicole e la regolazione della temperatura e del pH18,19. Tali passaggi di rimozione delle impurità sono laboriosi e possono compromettere la qualità delle proteine.
Il compartimento cellulare vegetale oltre la membrana plasmatica è definito come apoplasto, che comprende la parete cellulare, gli spazi intercellulari e lo xilema20. La fase acquosa è comunemente chiamata fluido di lavaggio apoplast (AWF). L'AWF contiene molecole secrete dalle cellule per regolare numerosi progressi biologici come il trasporto, il metabolismo della parete cellulare e le risposte allo stress21,22. A differenza del TSP, i costituenti molecolari dell'AWF sono meno complessi. L'estrazione di proteine ricombinanti da AWF può evitare la contaminazione da proteine intracellulari, prodotti mal ripiegati e residui citoplasmatici. In breve, il lipide di estrazione entra nelle foglie attraverso gli stomi a pressione negativa e l'AWF viene raccolto mediante centrifugazione delicata23. Sebbene l'isolamento dell'AWF sia ampiamente utilizzato per studiare il progresso biologico all'interno dell'apoplasto 24,25,26,27, non è stato sfruttato nei sistemi di produzione a base vegetale.
Migliorare la produttività delle piante e ottenere proteine target ad alta purezza sono sfide centrali per i sistemi di produzione vegetale28. Tipicamente, le proteine vengono purificate da estratti vegetali solubili totali contenenti grandi quantità di proteine intracellulari, prodotti mal ripiegati e non modificati e citocromi29, che richiedono grandi costi per la successiva purificazione30. L'uso di metodi di estrazione delle proteine AWF per l'estrazione di proteine ricombinanti esogene secrete nell'apoplast può migliorare efficacemente l'omogeneità delle proteine ricombinanti e ridurre il costo della purificazione delle proteine. Qui, utilizziamo un peptide segnale PR1a per abilitare la secrezione di proteine esogene nello spazio dell'apoplasto e introduciamo un metodo dettagliato per la purificazione di proteine ricombinanti dall'AWF di N. benthamiana.

<table><tbody><tr><td>100 mesh nylon filato a maglia fine</td><td>Guangzhou Huayu Trading società a responsabilità limitata</td><td>hy-230724-2</td><td>Per l'estrazione di proteine AWF</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml</td><td>Vazyme</td><td>TCF00150</td><td>Per centrifuga</td></tr><tr><td>ClonExpress II kit di clonazione in un solo passaggio</td><td>Vazyme</td><td>C112-02</td><td>Per clone</td></tr><tr><td>FastDigest Sac1</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td>Per clone</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>NEB</td><td>FD0685</td><td>Per clone</td></tr><tr><td>ImageJ 1.5.0</td><td>/</td><td>/Per</td> <td>l'analisi della scala di grigi</td></tr><tr><td>Filtro grande</td><td>Thermo Fisher</td><td>NEST</td><td>Per il filtraggio</td></tr><tr><td>Microscopia confocale a scansione laser</td><td>Leica SP8</td><td></td><td>Per la localizzazione subcellulare</td></tr><tr><td>Ni sepharose excel</td><td>Cytiva</td><td>10339806</td><td>Per la purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Proteina prefabbricata più gel</td><td>YEASEN</td><td>36246ES10</td><td>Per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Filtro piccolo</td><td>Nalgene</td><td>1660045</td><td>Per filtraggio</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrato Kit di prova</td><td>Thermo Fisher</td><td>34076</td><td>Per western blotting</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SCR</td><td>30188928</td><td>Per configurare il buffer di estrazione</td></tr><tr><td>Tipo pompa per vuoto rotativa</td><td>Zhejiang taizhouqiujing pompa</td> <td>per vuoto società a responsabilità limitata2XZ-2</td><td>Per l'infiltrazione sottovuoto</td></tr><tr><td>Miscelatore verticale</td><td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing società a responsabilità limitata</td><td>BE-1200</td><td>Per la miscelazione</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>SIGMA</td><td>BCBK8223V</td><td>Per configurare il tampone di estrazione</td></tr></tbody></table>

metodo basato sull'estrazione di apoplast per migliorare la purezza delle proteine ricombinanti prodotte dalle piante  

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Le piante sono un sistema di espressione eucariotica in via di sviluppo che viene esplorato per produrre proteine terapeutiche. La purificazione delle proteine ricombinanti dalle piante è una delle fasi più critiche del processo di produzione. In genere, le proteine sono state purificate da proteine solubili totali (TSP) e la presenza di varie proteine intracellulari e citocromi pone sfide per le successive fasi di purificazione delle proteine. Inoltre, la maggior parte delle proteine terapeutiche come antigeni e anticorpi vengono secrete per ottenere una corretta glicosilazione e la presenza di proteine non completamente modificate porta a strutture incoerenti di antigeni o anticorpi. Questo lavoro introduce un metodo più efficace per ottenere proteine ricombinanti altamente purificate dallo spazio apoplastico delle piante. La proteina fluorescente verde ricombinante (GFP) è ingegnerizzata per essere secreta nell'apoplasto di Nicotiana benthamiana e viene quindi estratta utilizzando un metodo di infiltrazione-centrifugazione. La GFP-His dell'apoplasto estratto viene quindi purificata mediante cromatografia di affinità con nichel. A differenza dei metodi tradizionali del TSP, la purificazione dall'apoplast produce proteine ricombinanti altamente purificate. Questo rappresenta un importante miglioramento tecnologico per i sistemi di produzione degli impianti.

GFP-His è bersaglio della secrezione nello spazio apoplastico di N. benthamiana La GFP è stata clonata nel plasmide pCAMBIA1300 con un peptide segnale PR1a N-terminale per la secrezione e un His-tag C-terminale per la purificazione, generando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). La proteina ricombinante è stata espressa transitoriamente in N. benthamiana e una banda di 30 kDa è stata rilevata mediante western blot utilizzando anticorpi anti-His a 3 giorni dall'agroinfiltrazione (Figura 1B). La plasmolisi è il trattamento delle foglie utilizzando una soluzione ipertonica per separare la parete cellulare dalla membrana cellulare32. Per determinare se la GFP si trova nell'apoplasto, abbiamo usato il 30% di saccarosio per fare la plasmolisi delle foglie. La microscopia a fluorescenza ha illustrato la presenza di GFP-His all'interno dell'apoplasto (Figura 1C). Le proteine AWF estratte mediante infiltrazione-centrifugazione sotto vuoto contenevano anche GFP-His (Figura 1D). Questi risultati dimostrano la secrezione di GFP-His nell'AWF delle foglie di N. benthamiana, da cui può essere estratto per la purificazione a valle.
Purificazione delle proteine da AWF L'efficacia dell'estrazione AWF influenza fortemente la resa finale di GFP. Sulla base dei protocolli di estrazione AWF pubblicati 24,25,26,27, abbiamo testato varie soluzioni per ottimizzare il recupero della GFP-His secreta. Qui sono state esaminate otto soluzioni di estrazione: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,1), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) e ddH2O (pH 7,0). PB ha estratto la maggior quantità di AWF e GFP-His, superando le altre soluzioni di oltre 4 volte (Figura 2A, B). Il confronto del PB a pH variabile ha rivelato un miglioramento dell'estrazione di AWF e GFP-His in condizioni da neutre a lievemente alcaline (pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0; Figura 2C,D). Inoltre, il PB con concentrazioni di 50 mM, 100 mM e 150 mM è stato confrontato per l'efficacia dell'estrazione. I risultati hanno indicato che 100 mM di PB hanno mostrato la massima efficacia per il recupero sia di AWF che di GFP-His (Figura 2E, F).
Sulla base di questi esperimenti di ottimizzazione, 100 mM PB, pH 7,0, sono stati selezionati per l'estrazione AWF su larga scala da N. benthamiana. Utilizzando questo tampone, sono stati recuperati dall'apoplasto 495 μg di proteine AWF totali per grammo di materiale fogliare fresco (Figura 2G). L'AWF estratto conteneva 10 μg di GFP-His (Figura 2H), che corrispondevano a circa il 18% del GFP-His totale nel TSP (Figura 2I). Dopo la cromatografia di affinità Ni, la purezza della GFP-His ha raggiunto l'84,3% dall'estrazione dell'AWF, sostanzialmente superiore alla purezza del 44,9% raggiunta attraverso l'estrazione totale di proteine solubili (Figura 2J).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig01.jpg"> Figura 1: GFP-His è bersaglio per la secrezione nell'apoplasto di N. benthamiana. (A) Schema della costruzione PR1a-GFP-His nel vettore di espressione vegetale pCAMBIA1300. (B) Western blot che rileva la produzione di GFP-His in N. benthamiana. Qui, sono stati caricati e rilevati 10 μL di campioni di proteine. Le foglie di N. benthamiana iniettate contemporaneamente con MMA sono state utilizzate come controllo negativo. Lo stesso volume di campioni è stato esaminato e colorato utilizzando grandi subunità vegetali come controllo di carico (C) Microscopia confocale che mostra la localizzazione subcellulare di GFP-His (verde). Le foglie di N. benthamiana sono state plasmolizzate con il 30% di saccarosio. Le linee tratteggiate bianche indicano la membrana plasmatica. Le frecce rosse denotano l'accumulo di GFP-His nell'apoplasto. (D) Western blot che dimostra la presenza di GFP-His nel liquido apoplastico estratto. Qui, sono stati caricati e rilevati 10 μL di campioni di proteine. Le foglie di N. benthamiana iniettate contemporaneamente con MMA sono state utilizzate come controllo negativo. Abbreviazioni: 35s = 2x promotore del virus del mosaico del cavolfiore 35s; PR1a = peptide segnale della proteina 1a correlata alla patogenesi del tabacco ; His = 6x il suo tag; Nos = terminatore della nopalina sintasi. BS = prima della plasmolisi; PS = post-plasmolisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig02.jpg"> Figura 2: Ottimizzazione del metodo di estrazione delle proteine da AWF. (A-B) Estrazione di proteine da AWF utilizzando diversi tamponi. Otto soluzioni sono state testate per l'estrazione di proteine da AWF: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,0), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) e ddH2O (pH 7,0). L'efficienza di estrazione è stata analizzata mediante SDS-PAGE (A) e la GFP-His è stata rilevata mediante western blotting utilizzando l'anticorpo anti-His (B). (C-D) Estrazione con PB a diversi valori di pH. Per l'estrazione dall'AWF è stato utilizzato PB con pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0. L'efficienza di estrazione è stata rilevata da SDS-PAGE (C) e GFP-His è stata rilevata mediante western blotting con anticorpi anti-His (D). (E-F) Estrazione mediante PB a diverse concentrazioni. Per l'estrazione da AWF sono stati utilizzati PB a 50 mM, 100 mM e 150 mM. L'efficienza di estrazione è stata analizzata mediante SDS-PAGE (E) e la GFP-His è stata rilevata mediante western blotting con anticorpi anti-His (F). (G-H) Analisi quantitativa delle proteine estratte. Le proteine sono state estratte utilizzando 100 mM di PB (pH 7,0). La proteina solubile totale (G) e la GFP-His (H) sono state quantificate per l'analisi statistica. (I) Analisi statistica della proporzione delle GFP AWF rispetto alle GFP totali. (J) Purificazione di GFP-His da proteine solubili totali di N. benthamiana o AWF. Le proteine sono state estratte utilizzando 100 mM di PB (pH 7,0) e la GFP-His è stata purificata mediante cromatografia di affinità Ni. La purificazione è stata analizzata mediante SDS-PAGE. La corsia più a destra è lo standard BSA da 1 μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

La purificazione delle proteine ricombinanti dai sistemi vegetali è solitamente messa alla prova dalle proteine vegetali. Questo lavoro fornisce un metodo per estrarre e purificare efficacemente una proteina ricombinante secreta dall'apoplasto di Nicotiana benthamiana.

Metodo basato sull'estrazione di Apoplast per migliorare la purezza delle proteine ricombinanti prodotte dalle piante  

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