Name: Trasformazione mitocondriale in Baker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri la trasformazione mitocondriale in Saccharomyces cerevisiae per studiare la sintesi proteica e l'assemblaggio dei complessi respiratori. Questo metodo avanza la comprensione della funzione mitocondriale.

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Questa pubblicazione è stata sostenuta da Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. UPD è un borsista CONAHCYT (CCU:883299). Vogliamo ringraziare la dottoressa Ariann Mendoza-Martínez per l'aiuto tecnico con le immagini del microscopio ottico. Licenze Biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

NOTA: Si consiglia di effettuare sei trasformazioni per ogni costrutto poiché l'efficienza della trasformazione mitocondriale è solitamente bassa. La composizione dei diversi mezzi di crescita è mostrata nella Tabella 2.
1. Preparazione delle particelle di tungsteno
<ol><li>Pesare 30 mg di particelle di tungsteno da 0,7 μm (WP, microcarrier) in una microprovetta. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 70% (EtOH) per sterilizzare. Agitare i WP e lasciarli riposare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare a 13.200 x g per 15 min a temperatura ambiente. Lavare i WP aggiungendo 1,5 ml di acqua sterile alle particelle, agitandole e centrifugando a 13.200 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di glicerolo sterile al 50% (la concentrazione finale è di 60 μg di WP/μL). NOTA: I WP possono essere conservati a -20 °C per almeno 6 mesi. Da questo stock, prelevare la quantità necessaria per sei trasformazioni (100 μl).</li>
</ol>2. Rivestimento del DNA WPs
<ol><li>Aggiungere 5 μg del plasmide a 2 μ e 15 μg del plasmide batterico contenente la sequenza mitocondriale a un microtubo su ghiaccio. NOTA: Il volume finale non deve superare i 50 μl per evitare di diluire ulteriormente i reagenti necessari per il rivestimento del DNA.</li>
	<li>Aggiungere 100 μl della sospensione di WP e vorticare per 5 s (6 mg di WP).</li>
	<li>Aggiungere 4 μL di spermidina 1 M. Brevemente vortice.</li>
	<li>Aggiungere 100 μl di 2,5 M CaCl2 ghiacciato, brevemente vortice. Incubare su ghiaccio per 10 min; Agitare brevemente il mix ogni 3 minuti. NOTA: La soluzione di CaCl2 è sterilizzata con filtro e non deve essere sterilizzata in autoclave.</li>
	<li>Centrifugare i WP per 30 s a 13.200 × g a 4 °C ed eliminare il surnatante. Lavare le particelle rispendendole delicatamente in 200 μL di 100% EtOH a -20 °C.</li>
	<li>Centrifugare i WP per 30 s a 13.200 × g a 4 °C ed eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio.</li>
	<li>Risospendere i WP in 60-70 μL di temperatura ambiente 100% EtOH utilizzando un puntale per pipetta; non vortice. NOTA: Per garantire la qualità dei plasmidi, il rivestimento del DNA deve essere eseguito lo stesso giorno della trasformazione biolistica.</li>
</ol>3. Preparazione del materiale biolistico
<ol><li>Prima del bombardamento, sterilizzare sei supporti macrocarrier (Figura 5) in autoclave e asciugarli accuratamente. In alternativa, immergili in EtOH e sterilizzali usando una fiamma con l'aiuto di una pinza. Metteteli su un piatto di vetro sterile.</li>
	<li>Durante la precipitazione del DNA (10 minuti di incubazione su ghiaccio nella fase 2.4), inserire sei macrocarrier (o dischi volanti) in ciascuno dei sei supporti macrocarrier con l'aiuto di una pinza sterile. NOTA: Non sterilizzare i macrocarrier.</li>
	<li>Miscelare i WP rivestiti di DNA con la pipetta. Aggiungere 10 μl di WP su ciascuna superficie del macrocarrier e distribuire su tutta la superficie con il puntale della pipetta. Se necessario, aggiungere qualche microlitro in più di EtOH al 100% sulla superficie del macrocarrier per ottenere una distribuzione uniforme dei WP. Lasciare asciugare la sospensione a temperatura ambiente per ~20 min.</li>
</ol>4. Preparazione di cellule di lievito e piastre di bombardamento
<ol><li>Inoculare il ceppo del recettore rho0 su 2 mL di terreno YPR (Tabella 2). Coltiva per una notte a 30 °C in una ruota rotante.</li>
	<li>Diluire 300 μl di coltura in 30 mL di terreno YPR fresco. Coltivare a 30 °C e 200 giri/min su uno shaker rotante per due notti fino a quando la coltura non è satura.</li>
	<li>Centrifugare le cellule di lievito a 600 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere le cellule di lievito in 600 μL di terreno YPD (Tabella 2).</li>
	<li>Utilizzando un manico di vetro sterile, stendere 100 μl di sospensione cellulare di lievito su una piastra di terreno di bombardamento solido. NOTA: Il mezzo di bombardamento deve essere privo del marcatore di selezione del plasmide a 2 μ che verrà utilizzato per la trasformazione.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.4 per le altre cinque piastre.</li>
	<li>Incubare per 1-3 ore a temperatura ambiente prima del bombardamento per assicurarsi che il mezzo liquido sia completamente assorbito sulla superficie della piastra.</li>
</ol>5. Generazione di un ceppo sintetico di Rho- mediante trasformazione biolistica
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di leggere il manuale dell'utente dell'apparecchiatura biolistica. Descriveremo il protocollo dell'apparecchiatura di riferimento (Tabella dei materiali e Figura 5).
<ol><li>Pulire la camera del sistema di erogazione di particelle biolistiche con etanolo al 70% per evitare contaminazioni e lasciarla riposare per almeno 10 minuti. Poco prima del bombardamento, pulire la superficie con un tovagliolo di carta pulito.</li>
	<li>Aprire le valvole del serbatoio dell'elio per impostare circa 2.000 psi.</li>
	<li>Accendere l'apparecchiatura e accendere la fonte di vuoto.</li>
	<li>Usando una pinza, posizionare il macrocarrier rivolto verso il basso sul supporto del macrocarrier. NOTA: Non utilizzare la schermata di arresto fornita con l'apparecchiatura.</li>
	<li>Avvitare il coperchio del macrocarrier sulla parte superiore del macrocarrier. Tutte le parti insieme costituiscono il sistema di lancio della microportante (Figura 5).</li>
	<li>Posizionare il sistema di lancio del microcarrier all'interno della camera a vuoto al quinto livello dal basso.</li>
	<li>Posizionare una delle piastre contenenti il prato rho0 strain al secondo livello dal fondo della camera. Assicurarsi che il piatto sia rivolto verso l'alto e sia senza coperchio.</li>
	<li>Utilizzando una pinza sterile, posizionare un disco di rottura sul cappuccio di fissaggio. Avvitare il tappo di ritegno sul tubo di accelerazione; Assicurarsi che il tappo di fissaggio sia ben saldo. NOTA: Non trattare i dischi rotti con isopropanolo come suggerito nel manuale poiché abbiamo osservato che l'efficienza di trasformazione diminuisce.</li>
	<li>Chiudere lo sportello della camera a vuoto.</li>
	<li>Mettere l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione VAC . Quando viene raggiunto il vuoto di 25-28 inHg , portare l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione HOLD . NOTA: Tenere presente che il vuoto raggiungibile può variare in base al livello del mare. Abbiamo riscontrato il successo raggiungendo i 25 inHg.</li>
	<li>Premi l'interruttore FIRE per sparare ai WP. Attendi che la pressione si accumuli nel tubo di accelerazione fino a raggiungere i 1.300 psi, quando il disco di rottura si romperà, emettendo un suono pop.</li>
	<li>Immediatamente dopo la rottura del disco di rottura, l'interruttore FIRE e il vuoto vengono rilasciati portando l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione VENT .</li>
	<li>Con cautela, con una pinza sterile, rimuovere eventuali detriti del disco di rottura presenti sulla superficie della placca e coprire la placca con il suo coperchio.</li>
	<li>Ripetere la procedura per le restanti cinque piastre, posizionando un nuovo disco di rottura e un nuovo macrocarrier in ogni giro.</li>
	<li>Al termine, chiudere la valvola principale del serbatoio dell'elio.</li>
	<li>Chiudere la camera e creare un vuoto portando l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione VAC . Liberare il sistema da qualsiasi pressione dell'elio premendo e rilasciando l'interruttore FIRE alcune volte. Ripetere con la porta aperta.</li>
	<li>Spegnere la pompa del vuoto e l'attrezzatura di bombardamento.</li>
	<li>Pulire il sistema di erogazione con il 70% di EtOH. Lavare i supporti macrocarrier con una soluzione SDS allo 0,1%; risciacquare con acqua distillata sterile ed EtOH al 100%.</li>
</ol>6. Selezione sintetica delle colonie di rho-colonie
<ol><li>Incubare le piastre di bombardamento per 5-7 notti a 30 °C. NOTA: È importante controllare quotidianamente le piastre per verificare la presenza di contaminazioni. Se necessario, la regione contaminata può essere tagliata con una spatola sterile per evitare ulteriori contaminazioni.</li>
	<li>Inoculare il ceppo tester del tipo di accoppiamento opposto in 2 mL di terreno YPD per una notte (vedere l'esempio specifico nella Figura 2D, E).</li>
	<li>Inoculare 150 μl di coltura di deformazione del tester su una piastra YPD. Utilizzando un manico di vetro sterile, stendere uniformemente il tester sulla superficie della piastra. Lasciare asciugare la piastra per almeno 5 minuti.</li>
	<li>Crea repliche delle piastre di bombardamento usando cuscinetti replicanti in velluto e un timbro replicatore.<ol><li>Replicare su una piastra di terreno di dropout corrispondente al marcatore di auxotrofia plasmidico a 2 μ trasformato. La crescita richiede un'incubazione notturna a 30 °C. Successivamente, conservare a 4 °C fino a nuovo utilizzo. Questa piastra è la piastra principale.</li>
		<li>Replicare sulla piastra YPD contenente il prato del tester dal passaggio 6.3. Incubare a 30 °C per due notti. Successivamente, replicare questa piastra sul terreno selettivo per rilevare la presenza del gene mitocondriale di interesse, ad esempio un mezzo respiratorio o un terreno privo di arginina, e incubare per una notte a 30 °C. Solo le cellule che ospitavano il plasmide batterico sintetico nei mitocondri cresceranno sul terreno selettivo dopo l'accoppiamento con il ceppo tester.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificare sulla piastra principale (passaggio 6.4.1) le colonie corrispondenti che sono cresciute nel passaggio 6.4.2. NOTA: Poiché la piastra di bombardamento (e quindi la piastra principale) è affollata di colonie trasformanti, può essere difficile identificare quelle colonie positive osservate sulla piastra di accoppiamento del tester. Per questo motivo, si consiglia vivamente di tracciare un paio di piccole linee su ciascun lato di tutte le piastre con un pennarello indelebile. Disegna linee simili sull'anello del timbro replicante. Queste linee saranno utili per orientare e localizzare le colonie positive sulla piastra principale (vedere l'esempio nella Figura 2D).</li>
	<li>Purificare le colonie positive striandole dalla piastra master a una seconda piastra di dropout selettiva, come al punto 6.4.1. Incubare per due notti a 30 °C. NOTA: È essenziale che lo striature consenta la crescita di singole colonie per garantire un ceppo puro.</li>
	<li>Ripetere il processo di selezione (passaggi 6.2-6.5) per confermare la presenza del plasmide batterico nei mitocondri. NOTA: Di solito, questo processo può essere ripetuto altre due volte per selezionare ceppi sintetici stabili.</li>
	<li>Una volta che il ceppo sintetico rho- mantiene stabilmente il DNA plasmidico nei mitocondri, selezionare 3-5 diverse colonie positive e inocularle in 2 mL di YPD. Utilizzare questa coltura per preparare un ceppo crioviale (mescolando 600 μL di coltura e 600 μL di glicerolo al 50% da conservare a -70 °C) e per inserire la sequenza plasmidica nel mtDNA di interesse mediante citoduzione (passaggio 6.7). NOTA: Poiché non vi è alcuna pressione selettiva per mantenere il plasmide trasformato nei mitocondri dal ceppo sintetico di Rhostrain, il plasmide può essere facilmente perso. Pertanto, si consiglia di effettuare la citoduzione il prima possibile.</li>
</ol>7. Integrazione della costruzione presente nel ceppo sintetico di rho- nel sito bersaglio nel genoma mitocondriale mediante citoduzione
<ol><li>Inoculare due provette con 3 mL di terreno YPD, una con le cellule donatrici (cellule rho- sintetiche) e una con le cellule accettore (cellula di lievito dove è prevista la costruzione finale). Incubare per una notte a 30 °C.</li>
	<li>Miscelare 750 μl del ceppo donatore e 250 μl del ceppo recettore in una microprovetta sterile (rapporto 3:1).</li>
	<li>Centrifugare la miscela per 1 minuto a 13.200 × g; Eliminare il surnatante. Utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL con l'estremità tagliata, prelevare una goccia di pellet cellulare e posizionarla su una piastra YPD. Incubare a 30 °C per 2-4 ore. NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata, non mettere più di due sospensioni cellulari in una singola piastra (vedere l'esempio nella Figura 4A).</li>
	<li>Prelevare una piccola quantità della miscela di cellule, risospenderla in 15 μL di acqua sterile su un vetrino e posizionare un vetrino coprioggetti. Verificare al microscopio ottico la presenza di shmoo con obiettivo 40x o 100x; questa forma caratteristica si manifesta quando sono presenti due tipi di accoppiamento (Figura 3B).</li>
	<li>Se sono presenti shmoo, risospendere una piccola quantità (~0,5 mm3) della massa cellulare in 2 mL di terreno YPD. Incubare per 2 ore a 30 °C in una ruota rotante per consentire il recupero degli zigoti binucleati.</li>
	<li>Agitare la miscela e diluire 10 μl della sospensione cellulare in 990 μl di acqua sterile (diluizione 1:100). Utilizzare perle di vetro o un manico di vetro sterile per distribuire 100 μl di diluizione cellulare su un terreno di dropout in cui crescono solo il ceppo accettore (e i diploidi sporadici). Incubare per 2-3 notti a 30 °C.</li>
	<li>Replicare le colonie risultanti sui terreni selettivi necessari, come spiegato nell'introduzione (fase 4; vedere la Figura 4C per un esempio specifico).</li>
	<li>Dopo l'identificazione delle colonie positive, rimuoverle sullo stesso terreno selettivo per purificare il ceppo aploide che trasporta il mtDNA di interesse.</li>
	<li>Selezionare almeno due colonie positive e farle crescere su 2 mL di terreno YPD a 30 °C per una notte. Effettuare un backup criogenico mescolando 600 μl di glicerolo al 50% con 600 μl di coltura YPD satura. Conservare a -70 °C.</li>
	<li>Isolare il DNA dei ceppi risultanti 31,32. Amplificare la regione desiderata mediante PCR e sequenziare per confermare la presenza della mutazione mitocondriale. NOTA: Ogni colonia positiva è una replica tecnica che deve essere confermata in modo indipendente per garantire la corretta sequenza nel genoma mitocondriale.</li>
</ol>

Trasformazione biolistica dei mitocondri di lievito per l'analisi mutagenetica

<ol><li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+mutated+initiation+codons+in+the+mitochondrial+COX2+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+fused+to+the+reporter+gene+ARG8m+reveals+lack+of+downstream+reinitiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation.</a> Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).</li>
<li>Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox2p+of+yeast+cytochrome+oxidase+assembles+as+a+stand-alone+subunit+with+the+Cox1p+and+Cox3p+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules.</a> J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).</li>
<li>Flores-Mireles, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochrome+b+carboxyl+terminal+region+is+necessary+for+mitochondrial+complex+III+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly.</a> Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).</li>
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<li>García-Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cox1+C-terminal+domain+is+a+central+regulator+of+cytochrome+c+oxidase+biogenesis+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria.</a> J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).</li>
<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+lacking+the+mitochondrial+gene+encoding+the+ATP+synthase+subunit+6+exhibit+a+selective+loss+of+complex+IV+and+unusual+mitochondrial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology.</a> J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mss51p+promotes+mitochondrial+Cox1p+synthesis+and+interacts+with+newly+synthesized+Cox1p%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p.</a> EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).</li>
<li>Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrially+synthesized+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+and+Cox3p+depends+on+targeting+information+in+untranslated+portions+of+their+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs.</a> EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).</li>
<li>Saracco, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox18p+is+required+for+export+of+the+mitochondrially+encoded+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+C-tail+and+interacts+with+Pnt1p+and+Mss2p+in+the+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane.</a> Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il presente lavoro descrive come trasformare con successo i mitocondri dal lievito S. cerevisiae. Il processo, dal bombardamento di microproiettili ad alta velocità fino alla purificazione del ceppo di lievito previsto, richiede ~8-12 settimane, a seconda di quanti cicli di purificazione del ceppo sintetico di rho- sono necessari. Alcuni dei passaggi critici del metodo sono i seguenti. In primo luogo, più grandi sono le regioni fiancheggianti aggiunte intorno al sito di mutazione nel costrutto genico mitocondriale, maggiore è la probabilità di integrazione riuscita della mutazione bersaglio. La dimensione minima delle regioni di fiancheggiamento è di ~100 nt; Tuttavia, l'uso di più di 500 NT su ciascun lato della mutazione è altamente raccomandato. In secondo luogo, quando si selezionano le colonie rho-sintetiche dopo la trasformazione, si raccomanda che non vengano effettuati più di 3-4 cicli di purificazione; In caso contrario, c'è un alto rischio che alla fine il costrutto mitocondriale vada perso, poiché non c'è pressione selettiva per mantenere il plasmide nei mitocondri. In terzo luogo, per evitare di danneggiare l'utente o l'apparecchiatura, è necessario leggere attentamente il manuale della macchina da bombardamento prima di iniziare la procedura. Questa apparecchiatura è delicata e utilizza l'alta pressione e il vuoto.
Una limitazione di questa procedura è che finora solo il lievito e l'alga verde C. reinhardtii sono candidati a trasformare i mitocondri con questo metodo. Sarebbe rilevante se potessimo introdurre mutazioni sito-dirette sul genoma mitocondriale da altri organismi. Un'altra limitazione è che è difficile trasformare molti costrutti diversi nella stessa sessione. Si consiglia di effettuare sei trasformazioni per ogni costruzione, ognuna delle quali deve essere testata, selezionata e purificata. Ciò si traduce in oltre 50 piastre di terreno per ottenere solo colonie di Rho- pure di una singola mutazione mitocondriale.
Nonostante queste limitazioni, la capacità di manipolare il genoma mitocondriale del lievito ha contribuito in modo significativo alla comprensione di molte vie della biogenesi dei complessi respiratori. Questo approccio può essere utilizzato per introdurre geni reporter per monitorare e quantificare la traduzione mitocondriale 1,7,36,37, interrompere i geni mitocondriali 38, identificare gli chaperoni di assemblaggio dei complessi respiratori39, comprendere meglio i meccanismi di traduzione e assemblaggio mitocondriale accoppiati 7,11,12,36 , e cercare soppressori quando seguono l'espressione di un gene mitocondriale mutato40. Finora, sebbene alcuni approcci per manipolare il genoma mitocondriale nei mammiferi siano stati riportati in precedenza41, non esiste un metodo diffuso per trasformare il DNA mitocondriale per questi organismi.

<table><tbody><tr><td>Puntali per pipette da 1 mL</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta da 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L puntali per pipette</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL provetta a fondo conico&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L puntali per pipette</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 mL fondo conico&nbsp; provetta</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>TOMY</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per macrocarrier biolisitico&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen</td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>Formedium</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>Formedium</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DCS0169</tr><tr><td>Pallone di vetro per colture</td><td>KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di vetro per colture</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>JT Baker&nbsp;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Millipore</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Sigma</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>Manico in vetro</td><td>Sigma</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>JT BAKER</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di elio grado 5 (99,99 %)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSTaq&nbsp; Kit</td><td>PCR BIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>New Brunswick scientific</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He TM Sistema di somministrazione di particelle biolistiche</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>Replica plater</td><td>Scienceware</td><td>Z363391</td><td></td></tr><tr><td>Dischi di rottura 1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitolo</td><td>Sigma</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore per colture tissutali</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882015</td><td></td></tr><tr><td>Microcarrier di tungsteno M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per vuoto con capacità di 100 l/min</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cuscinetti in velluto</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>Vortice&nbsp;</td><td>Scientifc Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Bastone per aplicativi in legno</td><td>PROMA</td><td>1820060</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Lievito a base azotata senza aminoacidi</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr></tbody></table>

trasformazione mitocondriale in baker

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

Il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato per decenni per comprendere la biologia mitocondriale. Questo modello ha fornito conoscenze sulle vie mitocondriali essenziali e conservate tra gli eucarioti e sulle vie specifiche dei funghi o dei lieviti. Una delle molte capacità di S. cerevisiae è la capacità di manipolare il genoma mitocondriale, che finora è possibile solo in S. cerevisiae e nelle alghe unicellulari Chlamydomonas reinhardtii. La trasformazione biolistica dei mitocondri del lievito ci permette di introdurre mutazioni sito-dirette, effettuare riarrangiamenti genici e introdurre reporter. Questi approcci sono utilizzati principalmente per comprendere i meccanismi di due processi altamente coordinati nei mitocondri: la traduzione da parte dei mitoribosomi e l'assemblaggio di complessi respiratori e ATP sintasi. Tuttavia, la trasformazione mitocondriale può potenzialmente essere utilizzata per studiare altri percorsi. Nel presente lavoro, mostriamo come trasformare i mitocondri del lievito mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità, selezionare e purificare il trasformante desiderato e introdurre la mutazione desiderata nel genoma mitocondriale.

Questo lavoro spiega come trasformare i mitocondri del lievito utilizzando un metodo biolistico. Mostriamo anche come selezionare e purificare i trasformanti e come introdurre la mutazione desiderata nella posizione target all'interno del genoma mitocondriale.

Trasformazione mitocondriale in Baker

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about ...

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La respirazione mitocondriale nelle cellule intere di lievito è un prezioso indicatore della bioenergetica cellulare. Qui, presentiamo un protocollo per quantificare questo fenotipo applicabile a diverse specie di lievito.

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