Name: Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D allavanguardia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Scopri la perfusione epatica con collagenasi per isolare epatociti primari da ratti e coltivarli in organoidi 3D funzionali a lungo termine. Questo metodo ottimizzato supera i limiti delle colture tradizionali.

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<ol><li>Heslop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+evaluation+of+primary+human+hepatocyte+culture+using+global+proteomic+analysis+reveals+a+selective+dedifferentiation+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile.</a> Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).</li>
<li>Ietto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+liver+organoids%3A+Generation+and+importance+of+diverse+specialized+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components.</a> Cells. 12 (10), 1429(2023).</li>
<li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+in+collagen+sandwich%3A+evidence+for+transcriptional+and+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation.</a> J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).</li>
<li>Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Hepatocytes+in+sandwich+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Primary Hepatocytes in sandwich culture.</a> Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hepatocyte+isolation+and+cultures%3A+Technical+aspects%2C+challenges+and+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements.</a> Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).</li>
<li>Thompson, W. L., Takebe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+model+systems+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Human liver model systems in a dish.</a> Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+organoids+are+a+powerful+tool+for+the+study+of+liver+disease+and+personalized+treatment+design+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).</li>
<li>Raju, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pluripotent+stem+cell+differentiation+to+hepatocyte+ceases+further+maturation+at+an+equivalent+stage+of+e15+in+mouse+embryonic+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development.</a> Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).</li>
<li>Peng, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokine+TNFalpha+promotes+the+long-term+expansion+of+primary+hepatocytes+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3d+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+undergo+phenotypic+transformation+to+biliary+epithelium+in+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures.</a> Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGF%CE%B2-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLancaster%2C+MA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+hepatocytes+with+multiparameter+perfusion+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control.</a> J Vis Exp. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), e3917(2012).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> J Vis Exp. (132), e56993(2018).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PREPARE%3A+Guidelines+for+planning+animal+research+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing.</a> Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).</li>
<li>Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+murine+primary+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+coculture+of+primary+rat+and+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).</li>
<li>Knobeloch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes%3A+isolation%2C+culture%2C+and+quality+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- Inibitore ALK5 IV</td><td>Doppia Elica</td><td> T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo reale&nbsp;</td><td>&nbsp; Kit di imaging Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>Collagene, tipo I, soluzione da coda di ratto</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone&nbsp;</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck</td><td> E9644</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sodica 25000 UI/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 100-39 ore</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina-transferrina-selenio 100x&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific 41400045</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-Glutammina</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Digerito Fegato Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Perfusione epatica Media</td><td>Thermofisher Scientific 17701038</td><td></td><td></td></tr><tr><td>integratore di N2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Merck</td><td> N-0636</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>tampone PBS 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Ismatec&trade; &nbsp;</td><td>MS-4/12 Reglo Pompa</td><td></td>Digitale</tr><tr><td>TNFa</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Tubo Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ismatec&trade; &nbsp;</td><td>&nbsp; ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E Medium, senza glutammina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Twin Helix</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3d all'avanguardia

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

Al termine delle procedure di set-up (fase 6.13), abbiamo ottenuto una resa cellulare fino a 1 x 108 cellule per isolamento dal fegato di circa 300 g di un ratto. La vitalità cellulare tra il 78% e il 97% è stata stabilita mediante la conta del blu di tripano.
Come già descritto in studi precedenti 1,18,19, gli epatociti primari in coltura perdono la loro morfologia, le funzioni specifiche del fegato e muoiono entro pochi giorni.
E' ben noto in letteratura23,24 che gli epatociti adulti primari perdono rapidamente la morfologia cuboidale-esagonale, si trasformano in una forma "fibroblastica" nel giro di pochi giorni e muoiono. La Figura 1 illustra le varie fasi: a 4 ore dalla placcatura su una piastra rivestita di collagene, gli epatociti aderiscono alla superficie, si diffondono in un tipico monostrato che mostra una morfologia cuboidale, i bordi delle cellule sono definiti, le giunzioni tra le cellule sono lineari e la superficie delle cellule appare liscia (Figura 1A). Il giorno 1, gli epatociti primari acquisiscono la loro tipica forma esagonale e le goccioline lipidiche diventano visibili (Figura 1B). Nei giorni 2-3, le goccioline lipidiche aumentano (Figura 1C-1D), mentre nei giorni 4-5, le cellule accumulano fibre di stress di actina (Figura 1E-F). Abbiamo anche valutato la percentuale di cellule vitali in coltura 2D primaria dal giorno 1 al giorno 5 e l'abbiamo confrontata con la vitalità prima della piastratura al giorno 0 (Figura 2). È possibile osservare una drastica riduzione della vitalità già nei primi giorni di coltura, raggiungendo il 49,5% (DS 12,7) il giorno 1, che scende al 45,2% (DS 18,2) il giorno 2 e al 33,5% (DS 0,77) il giorno 3. La percentuale di cellule vitali al giorno 4 è già del 16,9% (DS 5,4), mentre al giorno 5 raggiunge il 9,1% (DS 0,38). Pertanto, è evidente che la perdita di morfologia accompagna una rapida e progressiva morte cellulare degli epatociti adulti in coltura 2D.
Gli epatociti isolati, prima della placcatura (giorno 0), hanno mostrato un'elevata espressione di mRNA dei geni marcatori epatici (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) valutati mediante RT-qPCR (Figura 3). Tutti i geni analizzati mostrano una diminuzione dell'espressione dipendente dal tempo della coltura già al giorno 1 in coltura. I livelli di espressione dell'mRNA evidenziano la perdita funzionale e di vitalità degli epatociti primari durante il tempo.
Gli epatociti isolati sono stati piastrati in goccioline di matrice 3D e le strutture cellulari di organoidi 3D sono state seguite nel tempo. Il giorno 1 della coltura, i singoli epatociti sono sospesi nelle goccioline della matrice (Figura 4A). La concentrazione cellulare viene mantenuta intenzionalmente bassa per fornire agli epatociti ampio spazio per crescere. Inoltre, questo ci permette di seguire visivamente la crescita degli organoidi. Gli epatociti primari hanno mostrato divisione cellulare nei primi giorni di coltura (Figura 4C). Inoltre, mentre il Giorno 0 gli Hep-Org sono stati misurati a 30 μm, il Giorno 2 gli Hep-Org hanno quasi raddoppiato le loro dimensioni, sottolineando la crescita dimensionale che è stata mantenuta fino al Giorno 15 (33,08 μm il Giorno 1; 64,86 μm il Giorno 2; 45,06 μm il Giorno 5; 55,19 μm il Giorno 7; 51,93 μm il Giorno 10; 62,90 μm il Fay 15). Per quanto riguarda la forma degli Hep-Org, mentre il giorno 1 erano di forma rotonda, hanno raggiunto la "forma del grappolo d'uva" (tipica degli organoidi epatici) nei giorni successivi.
Gli epatociti piastrati in una matrice 3D rimangono vivi in coltura per settimane, mostrando una vitalità del 23% ±10% dopo 15 giorni utilizzando il test del blu di tripano (Figura 4B, prima riga). Per convalidare la proliferazione di Hep-Org di ratto, il giorno 15 è stato eseguito un test EdU (Figura 4D). Tuttavia, la colorazione di Hoechst ha mostrato un numero elevato di cellule singole piuttosto che di Hep-Org, era presente un'attività proliferativa degli epatociti (cellule verdi), anche se l'incorporazione di EdU era bassa (9% ± 7%) (Figura 4B, seconda riga).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> Figura 1: Coltura 2D di epatociti primari su piastre rivestite di collagene nel tempo. Le immagini sono state scattate con ingrandimento 20x con (A) microscopia a contrasto di fase a 4 ore dopo la placcatura, (B) Giorno 1, (C) Giorno 2, (D) Giorno 3, (E) Giorno 4, (F) Giorno 5. In ogni immagine è riportata una barra di scala corrispondente a 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> Figura 2: Cellule primarie vitali in coltura 2D su piastre rivestite di collagene. Il grafico mostra la percentuale di cellule vitali dal Giorno 1 al Giorno 5, rispetto alle cellule vitali piastrate il Giorno 0, considerata come 100%. I risultati sono riportati come repliche singole, media e SD di 3 diversi esperimenti (* valore p ≤ 0,05; ** valore p ≤ 0,005). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> Figura 3: Espressione dell'mRNA dei marcatori epatici misurata mediante RT-qPCR negli epatociti primari. I risultati sono stati normalizzati su β-actina e/o GAPDH (geni housekeeping) e sono espressi come relativi agli epatociti primari raccolti prima della placcatura al giorno 0, considerati come 1. I risultati sono riportati come media ± SD di almeno 3 diversi esperimenti (**+ valore p ≤ 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> Figura 4: Coltura 3D di epatociti in goccioline di matrice nel tempo. (A) Epatociti isolati placcati in goccioline di matrice per Hep-Org a lungo termine: nell'immagine, le goccioline di matrice sono visibili sulla superficie del pozzetto (cerchio rosso = una gocciolina). (B) Percentuale di cellule vitali da parte del blu di tripano e di cellule proliferative da parte dell'EdU al giorno 15 prima del passaggio. La quantificazione delle cellule positive EdU è stata eseguita dal software ImageJ2. I risultati sono riportati in percentuale come Media±SD di almeno 3 diversi esperimenti. (C) Immagini a contrasto di fase della coltura 3D di Hep-Org di ratto in diversi giorni di crescita in coltura 3D: giorno 1, 2, 5, 7, 10, 15. Ingrandimento dell'immagine 20X. In ogni immagine è riportata una barra di scala corrispondente a 50 μm. (D) Saggio di incorporazione EdU di Hep-Org di ratto il giorno 15. Ingrandimento dell'immagine 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Buffer e composizione dei media. La tabella riporta il nome e i componenti (con la loro concentrazione finale) di tutti i tamponi e dei mezzi cellulari utilizzati nel protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Elenco dei primer per ratti. La tabella riporta l'elenco dei primer utilizzati per gli esperimenti di RT-qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

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Un nuovo metodo per ottenere i macrofagi da colture primarie di cellule di fegato di ratto è descritto. Questo metodo utilizza la proliferazione dei macrofagi nella cultura, seguita da agitazione di palloni cultura e la purificazione di attaccamento selettivo ai piatti di plastica. Questa tecnica fornisce in modo efficiente i macrofagi del fegato, senza attrezzature complesse e competenze.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.

In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

Epatociti primari costituirà un valido strumento per valutare le funzioni biochimiche, molecolari e metaboliche in un sistema fisiologicamente rilevante sperimentale. Noi descriviamo un protocollo affidabile per la perfusione di fegato di ratto in situ, che genera costantemente epatociti vitali fino to1.0 ×...

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

A due fasi procedura di perfusione con collagenasi modificata per l'isolamento di epatociti umani è descritta. Questo metodo può essere applicato anche ad altri fegati mammiferi. Gli epatociti isolati sono disponibili in alta resa e redditività, che li rende un modello adatto per la ricerca scientifica in settori quali la rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere alta attuabilità e ad alto rendimento di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali dal fegato. Ciò avviene mediante che irrora il fegato con una soluzione di collagenasi tipo IV tramite la vena portale, seguita da centrifugazione differenziale per ottenere gli epatociti e le cellule endoteliali sinusoidali.

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

Presentato qui è un protocollo per l'isolamento degli epatociti del topo dai fegati di topo adulti utilizzando una tecnica di perfusione di collagenasi modificata. È stata inoltre descritta la cultura a lungo termine degli epatociti in un sandwich di collagene 3D, nonché l'immunolabeling dei componenti citoscheletrici per studiare la formazione biliare e la sua risposta al trattamento.

Isolamento e 3D Collagen Sandwich Cultura del topo primario Epatociti per studiare il ruolo del citoscheletro nella formazione canalicolare bile in vitro

Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

Qui, presentiamo un metodo robusto per la perfusione in situ del fegato di topo per studiare la regolazione acuta e diretta del metabolismo epatico senza disturbare l'architettura epatica ma in assenza di fattori extra-epatici.

Produzione di glucosio epatico, ureagenesia e lipolisi quantificate utilizzando il modello di fegato di topo perfuso

Scopri la perfusione epatica con collagenasi per isolare epatociti primari da ratti e coltivarli in organoidi 3D funzionali a lungo termine. Questo metodo ottimizzato supera i limiti delle colture tradizionali.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D allavanguardia (Video) | JoVE Journal

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

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