Name: Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Scopri il saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri in cellule HEK293T vive. Questo metodo semplifica la quantificazione delle comunicazioni interorganello per studiare la neurodegenerazione.

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<meta charset="utf8"></head><body>Un semplice test per misurare i contatti ER-mitocondri per schermi ad alta produttività

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
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<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube</td><td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti TC Treated</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Puntali per pipette OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L puntali per pipette OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L Punte smussate OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Rack per microprovette flipper a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti TC Trattata&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm TC Piatto trattato</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu; L Tips OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5910&nbsp; Ri - Centrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido, anidro, &ge; 99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>ThermoFisher Scientific 11965092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>Sciogliere in DMSO; conservare a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>EnduRen Live Cell Substrato</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Conservare le aliquote a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Eppendorf 2-20 &mu; L. pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu; L pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 &; L pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12 canali</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; L pipetta</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>Siero fetale bovino, regioni qualificate, approvate dall'USDA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; Incubatrice, 184 L, Acciaio Inox Lucido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di conteggio manuale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro - Neubauer Bright Line, Camera di Conteggio Doppia LW</td><td>Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr> Multi <tr><td>Tube Rack per provette coniche da 50 ml, coniche da 15 ml e per microcentrifuga</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Polietilenenimina cloridrato lineare di trasfezione (MW 40.000)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Rosina cloridrato</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>Dissolvere in DMSO; conservare a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre multimodale Varioskan LUX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>livello 8</td></tr><tr><td>VWR Sistema di aspirazione sottovuoto</td><td>VWR</td><td>VWR 75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>Sciogliere in DMSO; conservare a -70 gradi E</td></tr></tbody></table>

saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Abbiamo utilizzato il protocollo sopra descritto per misurare il livello di contatti ER-mitocondri con l'aggiunta di tre composti noti per inibire specifiche GTPasi. CDC42, RHO e RAC sono GTPasi che promuovono la polimerizzazione dell'actina28 quando attivate e sono inibite rispettivamente da ZCL278, Rhosin e Ehop-01624. HEK293T cellule trasfettate con split-Rluc sono state trattate con DMSO (controllo), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) o Ehop-016 (25 μM) e incubate per 1 h, 2 h e 5 h. Utilizzando un lettore di piastre, abbiamo misurato l'attività split-Rluc in punti temporali definiti (Figura 2).
Le cellule trattate con Rhosin (RHO GTPase inhibitor) non hanno mostrato cambiamenti significativi nell'attività della luciferasi rispetto alle cellule di controllo trattate con DMSO a 1 h, 2 h e 5 h del trattamento (p &gt; 0,9999, p = 0,6956, p &gt; 0,9999) (Figura 2). Questi risultati dimostrano che la Rhosin non influenza i contatti ER-mitocondri, suggerendo l'assenza di coinvolgimento dell'attività della RHO GTPasi nella regolazione dei contatti tra i due organelli.
Al contrario, l'inibitore della GTPasi RAC Ehop-016 ha mostrato un'attività della luciferasi significativamente inferiore rispetto al DMSO a 1 ora, 2 ore e 5 ore di trattamento (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (Figura 2). Questi dati indicano che l'attività della GTPasi RAC è necessaria per mantenere la normale interazione ER-mitocondri nella cellula.
Infine, l'inibitore CDC42 ZCL278 ha mostrato i cambiamenti più drastici nell'attività della luciferasi (Figura 2). Le cellule trattate con ZCL278 hanno mostrato una diminuzione significativa dell'attività della luciferasi rispetto al DMSO di controllo e hanno avuto i valori p più bassi in tutti e tre i punti temporali, mantenendo un p &lt; 0,0001 per tutto il tempo. I nostri dati dimostrano una forte inibizione dell'accoppiamento ER-mitocondri quando l'attività della GTPasi CDC42 è bloccata da ZCL278, in linea con il nostro precedente rapporto utilizzando il saggio originale split-Rluc eseguito in cellule co-trasfettate con due vettori che codificano separatamente ciascuna metà della split-luciferasi24.
Dati i risultati sorprendenti con ZCL278, soprattutto se confrontato con gli altri inibitori della GTPasi, l'attività di ZCL278 è stata ulteriormente testata a varie concentrazioni [0,5 μM, 5 μM, 50 μM] rispetto a un controllo DMSO. Le attività della luciferasi misurate a 1 ora, 2 ore e 5 ore dopo il trattamento hanno mostrato una risposta dose-dipendente; 0,5 μM di ZCL278 hanno determinato l'effetto più debole sull'attività della luciferasi, mentre 5 μM hanno mostrato una riduzione più forte e 50 μM hanno mostrato la più forte riduzione dell'attività enzimatica ricostituita (Figura 3). Insieme, i nostri risultati mostrano che ZCL278 sottoregola l'attività di split-Rluc in modo dose-dipendente e, con il passare del tempo, concentrazioni più elevate di ZCL278 (inibitore CDC42) mostrano ancora un cambiamento significativo rispetto al DMSO di controllo rispetto a concentrazioni più basse.
Per convalidare il nostro test split-Rluc, è possibile eseguire saggi indipendenti consolidati, come il saggio di legatura di prossimità (PLA), la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e il monitoraggio dell'assorbimento di calcio mitocondriale (Figura 4 e dati non mostrati)24. L'isoproterenolo, un agonista del recettore β2 adrenergico, che è uno dei composti identificati nel nostro screening per i promotori del contatto ER-mitocondri (Figura 4A), è stato utilizzato per confermare che l'attività luciferasica dello split-Rluc dopo il trattamento con isoproterenolo era aumentata a causa dell'aumento dei contatti ER-mitocondri, come dimostrato dai cambiamenti nell'intensità del segnale PLA e nell'assorbimento mitocondriale del calcio (Figura 4B-E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> Figura 1: Il saggio di riassemblaggio split-R luc. (A) Rappresentazione schematica del saggio Split-R Luc. Dove non ci sono contatti di membrana tra i mitocondri e il reticolo endoplasmatico, il Mito-R lucN e il RlucC-ER non riescono a interagire e quindi non c'è attività di Rluc8. Tuttavia, l'interazione tra il Mito-R lucN e il RlucC-ER, dove l'ER e le membrane dei mitocondri entrano in contatto, provoca una piena attività enzimatica, che viene rilevata dalla conversione del substrato in luminescenza. (B) Mappa schematica del costrutto di DNA split-Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) Diagramma del flusso di lavoro per il saggio split-Rluc in cellule HEK293T. Abbreviazioni: Mito = mitocondri; ER = reticolo endoplasmatico; IRES, sito di ingresso ribosomiale interno; rb_glob pA, segnale di poliadenilazione della beta-globina di coniglio; T2A, una sequenza di peptide 2A auto-scissa dal virus Thosea asigna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> Figura 2: Le attività split-Rluc corrispondenti ai livelli di contatti ER-Mito nelle cellule trattate con inibitori della GTPasi. (A-C) Attività della luciferasi ricostituita a (A) 1 ora, (B) 2 ore o (C) 5 ore dopo il trattamento con DMSO (controllo), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] o ZCL278 [50 μM] (n = 12 per ciascun gruppo). Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con confronti multipli. I valori di P sono riportati come p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Le barre di errore indicano l'errore medio ± standard di misura. Abbreviazioni: Mito = mitocondri; ER = reticolo endoplasmatico; RLU = unità di misura della luce relativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> Figura 3: Le attività split-Rluc che misurano i livelli di contatti ER-Mito nelle cellule trattate con ZCL278. (A-C) Attività della luciferasi ricostituita a (A) 1 ora, (B) 2 ore o (C) 5 ore dopo DMSO (controllo) o ZCL278 a [0,5 μM], [5 μM] o [50 μM] (n = 12 per ciascun gruppo). Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale con confronti multipli. I valori di P sono riportati come p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Le barre di errore indicano l'errore medio ± standard di misura. Abbreviazioni: Mito = mitocondri; ER = reticolo endoplasmatico; RLU = unità di misura della luce relativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> Figura 4: Convalida del saggio split-Rluc. (A) Un esempio di quantificazione dell'attività split-Rluc dopo il trattamento di cellule HEK293T con 11 farmaci, tra cui l'isoproterenolo, identificato in uno screening composto per i promotori di contatto ER-mitocondri. (B) Un esempio di saggio di legatura di prossimità in cellule HeLa trattate con DMSO o isoproterenolo (1 μM). Il segnale PLA (rosso) indica un contatto stretto tra ER e Mito. Sec61-GFP (verde): per etichettare ER; DAPI (blu): nucleo. (C) Quantificazione del segnale PLA in A (n = 4 esperimenti con 77-97 celle ciascuno; test di Mann-Whitney). (D) Captazione mitocondriale del calcio in risposta all'istamina (100 μM). La variazione di intensità fluorescente di Mito-R-GECO1 (la media è stata presa su più cellule HeLa) è stata tracciata ogni 2,5 s in cellule trattate con DMSO o isoproterenolo. La freccia indica l'aggiunta di istamina. (E) A sinistra: picco massimo di assorbimento mitocondriale di calcio in A. T-test a due code spaiato (n = 10, DMOS; 14, isoproterenolo). A destra: tasso di assorbimento del calcio mitocondriale (come in A; da 7,5 a 12,5 s). Test di Mann-Whitney (n = 12, DMSO; 11, isoproterenolo). Questa cifra è modificata da Lim et al.24. Abbreviazioni: RLU = unità di luce relativa; PLA = saggio di legatura di prossimità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Riepilogo delle tecniche attuali per i contatti ER-mitocondri. Elenco dei vantaggi e dei limiti per ogni metodo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File supplementare 1: File zip contenente la sequenza di DNA (formati PDF e GBK) di pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S1: Mappa di pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

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Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l'effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

Le interazioni tra le proteine ​​sono fondamentali per tutti i processi cellulari. Uso bioluminescenza Resonance Energy Transfer, l'interazione fra una coppia di proteine ​​può essere monitorata in cellule vive e in tempo reale. Inoltre, gli effetti delle mutazioni potenzialmente patogeni possono essere valutati.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Il protocollo qui presentato ha lo scopo di dimostrare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi con N- e/o C-termini esposti citoplasmaticamente in cellule di mammifero vive utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa.

Dimostrazione di complessi eterologhi formati da proteine di membrana di tipo III residenti in Golgi utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa

La necessità di nuovi approcci per studiare i siti di contatto di membrana (MCS) è cresciuta a causa del crescente interesse per lo studio di queste strutture cellulari e dei loro componenti. Qui, presentiamo un protocollo che integra tecnologie di microscopia precedentemente disponibili per identificare e quantificare i complessi proteici intra-organello e inter-organello che risiedono nelle MCS.

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni proteiche endogene intra-organelli nei siti di contatto ER-mitocondri mediante saggi di legatura di prossimità

Questo protocollo descrive un saggio basato su BRET per misurare le interazioni della chinasi CRAF con le proteine 14-3-3 in cellule vive. Il protocollo delinea i passaggi per la preparazione delle celle, la lettura delle emissioni BRET e l'analisi dei dati. Viene inoltre presentato un risultato di esempio con l'identificazione dei controlli appropriati e la risoluzione dei problemi per l'ottimizzazione del saggio.

Saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per la misurazione delle interazioni di CRAF con proteine 14-3-3 in cellule vive

Scopri il saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri in cellule HEK293T vive. Questo metodo semplifica la quantificazione delle comunicazioni interorganello per studiare la neurodegenerazione.

Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

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