Name: Sequenziamento dellRNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dallepiblasto alla fine della gastrulazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Scopri il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per lo studio della gastrulazione nei topi mutanti. Questo protocollo consente analisi dettagliate delle decisioni di destino cellulare nello sviluppo embrionale.

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Ringraziamo il Genomics Core del Fox Chase Cancer Center e i membri del laboratorio del Dr. Johnathan Whetstine Zach Gray, Madison Honer e Benjamin Ferman per il supporto tecnico per gli esperimenti di sequenziamento. Ringraziamo i membri del laboratorio del Dr. Estaras e Alex Morris, uno studente laureato a rotazione che ha contribuito all'analisi iniziale degli studi su singole cellule. Questo lavoro è finanziato dalle sovvenzioni NIH R01HD106969 e R56HL163146 a Conchi Estaras. Inoltre, Elizabeth Abraham è stata supportata dalla sovvenzione di formazione T32 5T32HL091804-12.

Isolamento e genotipizzazione di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo viene presentata una robusta pipeline per ottenere sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità da embrioni di topo gastrulanti, specificamente progettata per facilitare gli studi sui meccanismi di specificazione del destino cellulare nelle prime fasi di sviluppo. Questo metodo affronta una lacuna cruciale nel campo della gastrulazione ottimizzando l'analisi degli embrioni che richiedono genotipi, come il sesso o i geni somatici. Utilizzando modelli murini di mutazione genetica e impiegando il sequenziamento di singole cellule ad alta risoluzione su embrioni di topo interi, questa pipeline può migliorare ulteriormente la comprensione dei profili di espressione genica della gastrula di topo precoce. Questo metodo dimostra la fattibilità dell'utilizzo di un modello murino di mutazione genetica mediante un sistema di ricombinasi Cre per ottenere cellule e nuclei di alta qualità nei primi momenti di sviluppo per le omiche a singola cellula. Questo metodo si è evoluto attraverso molteplici tentativi, durante i quali i campioni non soddisfacevano gli standard di qualità richiesti per la preparazione e il sequenziamento della libreria. La metodologia spiegata genera un numero sufficiente di cellule/nuclei da embrioni di età inferiore a E8 attraverso l'ottimizzazione di tre passaggi critici: (1) gravidanze sincronizzate a tempo per aumentare il numero di embrioni, (2) genotipizzazione in giornata per evitare il congelamento/scongelamento e (3) valutazione della vitalità di cellule/nuclei per evitare il sequenziamento di cellule morenti. Questo protocollo fornisce risultati positivi con RNASeq a singola cellula, ma le sospensioni cellulari o nuclei ottenute in questo protocollo possono essere elaborate in altre piattaforme di sequenziamento, dove la vitalità cellulare è il fattore limitante, come smart-seq, drop-seq e cel-seq16.
Nell'embrione E7, il numero di cellule può variare a seconda del ceppo e del genotipo mutante. In genere, un embrione E7 può variare da centinaia a qualche migliaio di cellule e ottenere embrioni con il genotipo desiderato è difficile, con solo 1 o 2 embrioni per madre incinta che soddisfano i criteri. Questo protocollo consente la cattura di circa 300 cellule vitali per embrione E7 per l'analisi di singole cellule. I tentativi di aumentare le dimensioni del pool di embrioni congelando a scatto embrioni provenienti da madri gravide in giorni diversi si sono rivelati infruttuosi, poiché la vitalità cellulare era gravemente compromessa dopo lo scongelamento, anche con l'aggiunta di agenti crioconservanti. Per affrontare questa sfida, è stata ottimizzata la strategia di allevamento e la sincronizzazione delle madri gravide. Per aumentare le possibilità di isolamenti multipli, si consiglia di utilizzare topi femmine che hanno partorito 1-2 volte prima di riprodursi per l'isolamento, poiché è più probabile che abbiano cucciolate di dimensioni maggiori. Monitorare il ciclo estrale della femmina è fondamentale; È più probabile che l'accoppiamento avvenga durante le fasi di proestro e estro. In caso di difficoltà di riproduzione, cambiare i partner di riproduzione dopo quattro giorni sarà utile anche se non viene prodotta alcuna spina.
È importante notare che questo metodo ha un limite: si basa su spine osservate e, anche se viene osservata una spina, non garantisce la gravidanza ma indica solo l'attività sessuale. Pertanto, l'aumento del numero di tappi osservati in un giorno aumenterà la probabilità di avere più di una madre gravida in un giorno e più genotipi positivi. Questo protocollo ha dimostrato la fattibilità dell'utilizzo di stadi embrionali che vanno da E7 a E7.75 come prova di concetto durante la gastrulazione. Tuttavia, questa pipeline può essere applicata da embrioni E6.5 a E8. Per gli embrioni E6.5, si consiglia di aumentare il numero di gravidanze sincronizzate per ottenere almeno 7 embrioni con il genotipo desiderato da raggruppare. Invece, per gli embrioni E8, aumentare la quantità di tripsina utilizzata per dissociare ciascun embrione a ~ 40 μL invece di 20 μL. L'obiettivo è quello di ottenere una sospensione cellula/nuclei in un intervallo di concentrazione di 700-1200 cellule per μl prima di procedere con il partizionamento.
Avere una buona vitalità cellulare è essenziale per il successo del sequenziamento di singole cellule. Nel design del chip microfluidico fornito dai produttori, le singole cellule sono suddivise in perle di gel in emulsione (GEM) all'interno di un chip contenente note perle di gel con codice a barre11. Tuttavia, una notevole limitazione di questo processo è che sia le singole celle di alta qualità che quelle di scarsa qualità possono essere partizionate. Anche con un numero adeguato di cellule vive (cioè 1000 cellule/μL), se la vitalità della sospensione è bassa (cioè 1000 cellule vive e 1000 cellule morte, con conseguente vitalità del 50%), l'esperimento di sequenziamento probabilmente fallirà. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di puntare a una vitalità di circa il 90%. Se la vitalità cellulare scende tra il 60% e l'89% circa, possono essere adottate misure specifiche per migliorare la vitalità dell'esperimento. Tuttavia, se la vitalità cellulare è inferiore al 60%, si sconsiglia vivamente di continuare con l'esperimento. La ragione di ciò è che le cellule morenti verranno "catturate" nel gel di partizionamento e la successiva preparazione della libreria e i controlli di qualità passeranno senza problemi evidenti. Tuttavia, l'esperimento di sequenziamento vero e proprio potrebbe fallire completamente, poiché la maggior parte delle letture di sequenziamento mapperà i geni mitocondriali, ribosomiali o dell'apoptosi, indicando segni di scarsa vitalità cellulare fin dall'inizio. I dati presentati in questo articolo illustrano una pipeline per il sequenziamento di singole cellule di embrioni di topo gastrulanti con cellule di alta qualità. Questa metodologia può essere applicata per la comprensione di molti diversi modelli murini di mutazione genetica durante lo sviluppo.

La gastrulazione è un processo fondamentale necessario per il normale sviluppo. Questo processo rapido e dinamico si verifica quando le cellule pluripotenti si trasformano in precursori specifici del lignaggio che definiscono il modo in cui si formano gli organi. Per anni, la gastrulazione è stata a lungo definita come la formazione di tre popolazioni in gran parte omogenee: mesoderma, ectoderma ed endoderma. Tuttavia, le tecnologie ad alta risoluzione e un numero emergente di modelli di cellule staminali embrionali 1,2 rivelano un'eterogeneità senza precedenti tra gli strati germinali precoci 3,4. Ciò suggerisce che resta ancora molto da scoprire sui meccanismi che regolano le distinte popolazioni cellulari della gastrula. Lo sviluppo embrionale del topo è stato uno dei migliori modelli per studiare le prime decisioni sul destino cellulare durante la gastrulazione 3,5. La gastrulazione nei topi è rapida, poiché l'intero processo di gastrulazione avviene entro 48 ore, dal giorno embrionale E6.5 a E85.
I recenti progressi nelle tecnologie a singola cellula hanno permesso una mappatura dettagliata dello sviluppo embrionale di topo wild-type, fornendo una panoramica completa dei paesaggi cellulari e molecolari degli embrioni durante la gastrulazione 3,4,6,7,8. Tuttavia, l'analisi degli embrioni mutanti in queste fasi è meno comune e spesso limitata alle popolazioni selezionate FACS 9,10. La scarsa letteratura riflette le sfide tecniche associate alla manipolazione e alla preparazione di singole cellule di embrioni gastrulanti che richiedono la genotipizzazione. Catturare il processo dinamico di gastrulazione può rappresentare una sfida a causa della sua natura rapida, soprattutto per la comprensione degli embrioni mutanti. La tempistica e la sincronizzazione delle gravidanze sono essenziali, poiché anche lievi differenze tra le gravidanze programmate possono essere interpretate erroneamente come un fenotipo di sviluppo derivante dal gene mutante. Ciò diventa particolarmente importante quando il gene mutante influenza il processo di gastrulazione 13,14. In questo studio, vengono stabilite le linee guida per ottenere gravidanze sincronizzate attraverso la visualizzazione dei tappi vaginali (cioè la massa di liquido seminale coagulato formata nella vagina della femmina dopo l'accoppiamento). Inoltre, è stata progettata una strategia per ottenere dati solidi su singole cellule da embrioni gastrulanti mutanti da E6.5 a E8. Questa strategia è stata ideata per superare i vincoli associati al basso numero di embrioni con il genotipo desiderato per gravidanza e alla diminuzione della vitalità causata dal congelamento-scongelamento di embrioni o cellule.
Questo articolo descrive una metodologia ottimizzata dall'instaurazione di gravidanze temporizzate tramite tappi vaginali al sequenziamento finale di singole cellule/nuclei. Questo metodo spiega come aumentare il numero di gravidanze sincronizzate per ottenere un numero maggiore di embrioni con il genotipo desiderato, isolamenti di cellule/nuclei per migliorare la vitalità delle cellule e un protocollo di genotipizzazione in giornata. Questo manoscritto descrive anche il processo di isolamento dell'embrione in diversi punti temporali della gastrulazione. La metodologia aiuta ad aumentare il numero di cellule/nuclei embrionali vitali finali per il sequenziamento, garantendo dati di sequenziamento di alta qualità. Pertanto, questo metodo aprirà le porte a studi su singole cellule di embrioni gastrulanti che richiedono la genotipizzazione.

<table><tbody><tr><td>Piastra Petri da 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Barriera Reach Tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L Reach Barriera Punta</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro; L Punta barriera reach</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m Colino reversibile, piccola</td><td>cellula staminale</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 6 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR a 8 strisce</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Apex Bioresearch Prodotto</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Bagno a secco</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Microcentrifuga refrigerata</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Cromo Next GEM Single Cell 3' Kit di reagenti v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Contatore cellulare automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Camera Vetrini</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagenti</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR sacco vitellino</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modificationation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 Sistema di imaging</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Termociclatore</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagenti (100 cicli) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 1000 Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ottico 8x striscia (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tappo tubo ottico 8x striscia (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga Poseidon 31-511, HS24, con 24 rotori da 1,5/2,0 mL, 1 centrifuga/unità</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsKit di saggi per la quantificazione del DNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td> Inibitore della RNasi <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Pinze standard Fine</td><td>Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Punte di caricamento della stazione a nastro</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td><td>Qualità biologica</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Tripano Macchia blu 0,4%</td><td>Theromo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Triplo Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer IKA MS3 con adattatore per piastra campione a 96 pozzetti</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenziamento dell'rna a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Nell'ultimo decennio, gli approcci a singola cellula sono diventati il gold standard per lo studio della dinamica dell'espressione genica, dell'eterogeneità cellulare e degli stati cellulari all'interno dei campioni. Prima dell'avanzamento delle singole cellule, la possibilità di catturare il panorama cellulare dinamico e le rapide transizioni cellulari durante lo sviluppo iniziale era limitata. In questo articolo, è stata progettata una robusta pipeline per eseguire analisi di singole cellule e nuclei su embrioni di topo dal giorno embrionale E6.5 a E8, corrispondente all'inizio e al completamento della gastrulazione. La gastrulazione è un processo fondamentale durante lo sviluppo che stabilisce i tre strati germinali: mesoderma, ectoderma ed endoderma, che sono essenziali per l'organogenesi. È disponibile un'ampia letteratura sulle omiche a singola cellula applicate agli embrioni perigastrulanti wild-type. Tuttavia, l'analisi di embrioni mutanti su singole cellule è ancora scarsa e spesso limitata alle popolazioni selezionate con FACS. Ciò è in parte dovuto ai vincoli tecnici associati alla necessità di genotipizzazione, alle gravidanze programmate, al numero di embrioni con genotipi desiderati per gravidanza e al numero di cellule per embrione in queste fasi. Qui viene presentata una metodologia progettata per superare questi limiti. Questo metodo stabilisce linee guida per l'allevamento e la gravidanza a tempo per ottenere una maggiore possibilità di gravidanze sincronizzate con i genotipi desiderati. Le fasi di ottimizzazione del processo di isolamento dell'embrione, abbinate a un protocollo di genotipizzazione in giornata (3 ore), consentono di eseguire una singola cellula basata su microgoccioline nello stesso giorno, garantendo un'elevata vitalità delle cellule e risultati robusti. Questo metodo include inoltre linee guida per l'isolamento ottimale dei nuclei dagli embrioni. Pertanto, questi approcci aumentano la fattibilità di approcci a singola cellula di embrioni mutanti nella fase di gastrulazione. Prevediamo che questo metodo faciliterà l'analisi di come le mutazioni modellano il paesaggio cellulare della gastrula.

La metodologia progettata in questo articolo è specificamente destinata a migliorare la preparazione di campioni di embrioni per l'omica a singola cellula da E6.5 a E8. Questa solida pipeline è composta da cinque fasi principali: gravidanze sincronizzate a tempo, isolamento degli embrioni, genotipizzazione in giornata, dissociazione cellulare e valutazione della vitalità cellulare (Figura 1A). Mentre i dati presentati si concentrano su punti temporali da E7 a E7.5, possono essere applicati a embrioni fino a E8 (Figura 1B) con piccole variazioni nella procedura (riferite alle note in tutto il protocollo). Le gravidanze sincronizzate a tempo sono state ottenute mettendo due topi femmine in una gabbia con un topo maschio. I tappi vaginali sono stati controllati ogni mattina prima delle 10 e, se è stato osservato un tappo, è stato considerato E0,5 entro mezzogiorno di quel giorno (Figura 2A). In questo studio, le condizioni ottimali per i tappi richiedevano che una femmina di topo in fase di estro o proestro fosse accoppiata con un maschio con una storia di posizionamento riuscito di diversi tappi durante la precedente riproduzione (Figura 2B). Per gli isolamenti degli embrioni sono stati presi in considerazione solo i tappi evidenti (Figura 2C).
I tempi di sviluppo sono stati stimati seguendo il calendario nella Figura 2A. Per E7.5, la dissezione dell'embrione è iniziata alle 12 del 7° giorno successivo al giorno del rilevamento di un tappo. La Figura 3 esemplifica un isolamento dell'embrione riuscito a E7.5. Dopo l'eutanasia della madre gravida, il corno uterino è stato sezionato, il gonfiore deciduale è stato tagliato individualmente, rivelando l'embrione, e il sacco vitellino è stato isolato per la genotipizzazione (Figura 3).
La genotipizzazione in giornata è stata eseguita entro 3 ore dall'isolamento dell'embrione seguendo i passaggi della Figura 4A. Gli embrioni sono stati mantenuti in ghiaccio durante il processo di genotipizzazione per preservarne l'integrità. Non congelare gli embrioni, poiché diminuirà il numero di cellule vitali per embrione. Le figure 4B, C mostrano il sacco vitellino viscerale, il sacco endodermico parietale e il cono ectoplacentare con sangue materno associato. Il sacco vitellino viscerale è stato utilizzato per la genotipizzazione (Figura 4C). Dopo aver digerito il sacco vitellino, è stata preparata la miscela PCR ed è stata eseguita la reazione PCR. Il prodotto PCR risultante è stato quindi separato su un gel di agarosio. La Figura 4D mostra le dimensioni previste dei frammenti per gli alleli LoxP e wild-type (597 bp e 498 bp, rispettivamente) e per l'allele Cre (650 bp). Nella Figura 4E, viene presentato un esempio di genotipizzazione del sacco vitellino da 6 embrioni ottenuti da coppie riproduttive portatrici degli alleli Cre e LoxP (flox). I gel raffigurano i prodotti della PCR degli alleli Cre e LoxP nei 6 embrioni analizzati. Gli embrioni numero 2 e numero 5 portano 2 alleli flox e 1 allele cre; pertanto, sono considerati embrioni KO condizionali (Figura 4E, punti rossi). Gli embrioni 1 e 3 hanno 2 alleli flox ma sono negativi per Cre; pertanto, sono considerati controlli flox. L'embrione 4 ha 2 alleli flox e una debole banda per l'allele Cre, risultando in un genotipo "poco chiaro". Questo embrione non è stato ulteriormente processato (in alternativa, lo sperimentatore può considerare di ripetere la genotipizzazione o condurre una convalida secondaria del KO condizionale utilizzando cellule che esprimono Cre). È importante notare che il driver Cre utilizzato in questo esperimento non è espresso nel sacco vitellinoviscerale 15; quindi, gli alleli LoxP non appaiono spostati sul gel degli embrioni Cre-positivi rispetto a quelli Cre-negativi.
La conta cellulare e una buona vitalità sono necessarie per il successo di un esperimento su singola cellula. Le sospensioni con bassa vitalità cellulare, un'alta percentuale di cellule morte, aggregazione o detriti significativi non sono adatte per ulteriori lavorazioni. Le condizioni ottimali sono per 700-1200 cellule vive per microlitro e &gt;90% di vitalità. La Figura 5A presenta un pannello che illustra la vitalità cellulare buona e non ottimale. Gli stessi criteri possono essere applicati anche per l'isolamento dei nuclei, come mostrato nella Figura 5B. Tuttavia, è fondamentale notare che la valutazione del blu di tripano differisce da quella delle cellule e dei nuclei: le cellule vitali non incorporano il blu di tripano, mentre i nuclei vitali lo fanno. Se la sospensione di cellule/nuclei è ottimale (vitalità del &gt;90%), procedere con il partizionamento di singole cellule utilizzando un chip microfluidico seguendo le procedure del produttore11. Le opzioni di risoluzione dei problemi sono fornite per le sospensioni in cui la vitalità di cellule/nuclei è compresa tra il 60% e l'89%, come illustrato nella Figura 5C. Se la vitalità, indipendentemente dal numero totale di cellule, scende al di sotto del 60%, considerare l'interruzione dell'esperimento.
L'intera condotta, dall'abbattimento della diga gravida alla costruzione della biblioteca, richiede un totale di 8 ore nello stesso giorno (cioè, le fasi del protocollo da 2 a 6 devono essere eseguite lo stesso giorno). Seguendo le procedure delineate dalle procedure dei produttori di singole cellule11, sono state preparate le costruzioni delle librerie per il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula utilizzando cellule ottenute da embrioni E7, con una vitalità cellulare che varia da condizioni subottimali a ottimali, con l'obiettivo di un recupero target stimato di 2000 cellule (Figura 6). La Figura 6A illustra una distribuzione rappresentativa delle dimensioni dei frammenti delle librerie scRNAseq sia per condizioni sub-ottimali che ottimali, indicando che la vitalità cellulare non influisce in modo significativo sull'intero processo di partizionamento di singole cellule. La distribuzione delle dimensioni dei frammenti variava tra 400-500 bp. Ciò indica che le condizioni non ottimali non influenzano il processo di preparazione della libreria. La Figura 6B mostra i risultati di esperimenti di RNAseq a singola cellula riusciti e subottimali. Dopo il sequenziamento, sono stati condotti controlli di qualità sui campioni e si è osservato che, nei casi in cui la vitalità cellulare era subottimale, solo il 10% delle cellule è stato sequenziato con successo. Al contrario, i campioni ottimali hanno mostrato una percentuale più elevata, con il 91% delle cellule totali sequenziate. Ciò è ulteriormente dimostrato dai grafici dei codici a barre, che indicano che le condizioni non ottimali hanno un rumore di fondo maggiore rispetto alle condizioni ottimali. L'analisi di clustering è stata eseguita per entrambi gli esperimenti e ha rivelato 9 cluster nelle condizioni ottimali e 4 in quelle sub-ottimali. L'annotazione dei cluster utilizzando marcatori noti3 ha rivelato i tipi di cellule attesi negli embrioni E7, tra cui l'epiblasto e la striscia primitiva (Figura 6B). Le annotazioni dei cluster nell'esperimento non ottimale non sono state possibili a causa della mancanza di arricchimento in marcatori noti per ciascun cluster. Ciò evidenzia l'importanza delle celle di alta qualità necessarie per la corretta rappresentazione dei dati durante queste fasi di sviluppo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> Figura 1: Ottimizzazione della gastrulazione di embrioni interi di topo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. (A) Schema del flusso di lavoro per ottenere cellule e/o nuclei di alta qualità da embrioni gastrulati. (B) Immagini rappresentative in campo chiaro e schemaadattato 3 di embrioni di topo durante la gastrulazione da E7 a E8. Barra della scala: 125 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> Figura 2: Strategia per gravidanze efficienti sincronizzate a tempo per l'isolamento degli embrioni durante la gastrulazione. (A) Diagramma schematico che indica la pipeline per le gravidanze a tempo e un calendario che descrive i tempi dal rilevamento del tappo all'isolamento dell'embrione per l'analisi di specifiche fasi di gastrulazione. (B) Immagini rappresentative delle fasi del ciclo dell'estro per topi femmine. Sono indicate le fasi più ricettive alla riproduzione. (C) Diagramma schematico che illustra come verificare la presenza di tappi vaginali ed esempi di aperture vaginali senza tappo, tappo parziale o buon tappo da considerare per l'isolamento degli embrioni. Le aperture vaginali sono ingrandite sotto ogni immagine. Il tappo (sperma coagulato nell'apertura della vagina) è evidenziato con una freccia rossa che punta verso di esso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> Figura 3: Dissezione e genotipizzazione di embrioni E7.5 per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Diagrammi schematici e immagini del processo di isolamento degli embrioni E7.5 e di sezionamento del sacco vitellino viscerale. La freccia gialla indica l'utero della madre incinta e il cerchio tratteggiato giallo delinea la posizione dell'embrione. Le linee tratteggiate rappresentano le aree che sono state tagliate durante la dissezione. "M" denota la fine del mesometrial, mentre "AM" denota la fine anti-mesometrial. Le barre di scala nelle immagini stereoscopiche sono di 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> Figura 4: Genotipizzazione in giornata dei sacchi vitellino da embrioni di topo gastrulanti. (A) Schema del flusso di lavoro per la genotipizzazione in giornata dei sacchi vitellino. (B) Immagine rappresentativa del sacco endodermico parietale e del cono ectoplacentare con sangue materno associato. (C) Sacco vitellino viscerale negli embrioni E7.5 evidenziati dalla linea tratteggiata. Barra della scala: 200 μm. (D) Gel rappresentativi di tipo selvatico (+/+), eterozigote (Flox/+) e omozigote (Flox/Flox) e genotipizzazione Cre (Mesp1cre15) con dimensioni dei frammenti di DNA osservate. (E) Vengono forniti i risultati della genotipizzazione nello stesso giorno per gli alleli Cre e flox da sacchi vitellino di 6 embrioni (1-6). I due embrioni con genotipizzazione flox/flox e Cre negativo (-) sono controlli flox (punti blu), mentre quelli con genotipizzazione flox/flox e Cre positivo (+) sono KO condizionali (punti rossi). L'embrione 4 non è ottimale a causa della debole banda Cre (flox/flox e Cre-unclear) ed è quindi escluso da ulteriori trattamenti. Gli embrioni con lo stesso genotipo vengono raggruppati e processati per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Si noti che la presenza dell'allele Cre nel sacco vitellino non influisce sulla dimensione delle bande di flix, poiché il Cre utilizzato (Mesp1cre) non è espresso nel sacco vitellino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> Figura 5: Valutazione della qualità cellulare e della vitalità dei nuclei. (A) Immagini rappresentative delle condizioni ottimali e sub-ottimali di vitalità cellulare da embrioni E7.5. (B) Immagini rappresentative delle condizioni di vitalità ottimali e sub-ottimali dei nuclei da embrioni E8 (C) Schema di risoluzione dei problemi che indica potenziali soluzioni per aiutare ad aumentare la vitalità delle cellule prima di iniziare il partizionamento di singole cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> Figura 6: Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni di topo E7. (A) Traccia rappresentativa della distribuzione dimensionale dei frammenti per librerie di sequenziamento di RNA a singola cellula da embrioni di topo E7 sia per condizioni sub-ottimali che ottimali di vitalità cellulare, con il picco principale vicino a 400-500 bp. Si noti che le tracce sono simili tra queste condizioni, indicando che la vitalità della cella non influisce sui controlli di qualità della libreria. (B) Analisi dei risultati del sequenziamento dell'RNA a singola cellula per embrioni di topo E7 in condizioni sia subottimali che ottimali che mostrano il recupero del bersaglio osservato, la classificazione dei codici a barre e il raggruppamento dei tipi di cellule attraverso la distribuzione uniforme di approssimazione e proiezione del manifold (UMAP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Tampone di lisi</td>
		</tr><tr><td>Nome del reagente</td>
			<td>Concentrazione delle azioni</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Volume totale 1 mL</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 metri</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0,1 milioni</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>3 μl</td>
		</tr><tr><td>Interpolazione-20</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Nondiedt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr><tr><td>Digitonina</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr><tr><td>DTT</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampone di lavaggio</td>
		</tr><tr><td>Nome del reagente</td>
			<td>Concentrazione delle azioni</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Volume totale 1 mL</td>
		</tr><tr><td>BSA in PBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione del tampone di lisi per l'isolamento dei nuclei e del tampone di lavaggio.

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

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