Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione
14 giugno 2024
Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.
Ci concentriamo sulla decifrazione dei meccanismi che controllano le decisioni precoci sul destino cellulare durante il differenziamento delle cellule staminali embrionali, sia in vitro che in modelli murini. Complesse reti regolatorie guidano il differenziamento durante lo sviluppo e studiamo come l'interazione tra vie di segnalazione, fattori di trascrizione e regolatori epigenetici promuova diversi destini cellulari. Studiare il processo dinamico e rapido di gastrulazione nei topi è tecnicamente impegnativo a causa del piccolo numero di cellule per embrione e del numero limitato di embrioni con il genotipo desiderato per figliata.
Sebbene la letteratura mostri ampiamente lo studio di singole cellule utilizzando popolazioni di embrioni selezionati con cellule wild type o attivate da fluorescenza, un'analisi completa degli embrioni con mutazioni di lignaggio è ancora limitata. Il nostro protocollo offre la possibilità di generare set di dati omici a singola cellula da embrioni gastrulanti che ospitano mutazioni di lignaggio. Aiuterà gli scienziati con nessuna o limitata esperienza nella manipolazione dei topi o che desiderano imparare la manipolazione precoce degli embrioni o gli approcci a singola cellula.
Il nostro protocollo aiuterà a rispondere a nuove domande scientifiche sulla gastrulazione e sull'organogenesi precoce, compreso lo sviluppo del cuore. Forniamo una pipeline per analizzare embrioni mutanti specifici per il lignaggio con risoluzione di una singola cellula, che faciliterà l'analisi del ruolo di un gene specifico nell'impegno del lignaggio. Speriamo di utilizzare questa metodologia per comprendere i meccanismi regolatori delle decisioni sul destino cellulare durante il processo rapido e dinamico di gastrulazione.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la generazione di sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità da embrioni di topo in fase di gastrulazione. Questo approccio facilita il sequenziamento di singole cellule e nuclei, consentendo un'analisi completa dello sviluppo embrionale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Genetica
Sfondo
- La gastrulazione è una fase critica dello sviluppo embrionale.
- Le prime decisioni riguardo al destino cellulare sono influenzate da reti regolatorie complesse.
- Esistono studi limitati sugli embrioni con mutazioni della linea cellulare.
- L'analisi a singola cellula è difficoltosa a causa del ridotto numero di cellule per embrione.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per l'analisi di singole cellule di embrioni di topo in fase gastrulativa.
- Consentire a ricercatori con esperienza limitata nella manipolazione del topo di eseguire operazioni sugli embrioni.
- Semplificare la generazione di dataset omici da embrioni con mutazioni di linea cellulare.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di singole cellule e nuclei da embrioni di topo.
- Sequenziamento di sospensioni di singole cellule e nuclei.
- Applicazione del protocollo a embrioni con specifici background genetici.
- Analisi delle vie di segnalazione e dei fattori di trascrizione durante la gastrulazione.
Risultati principali
- Il protocollo genera con successo sospensioni di singole cellule di alta qualità.
- Permette un'analisi completa delle prime decisioni riguardo al destino cellulare.
- Facilita lo studio di embrioni con mutazioni di linea.
- Fornisce una risorsa preziosa per i ricercatori alle prime armi con la manipolazione degli embrioni.
Conclusioni
- Questo studio offre un approccio innovativo allo studio della gastrulazione nei topi.
- Il protocollo stabilito migliora la comprensione dello sviluppo embrionale.
- Apre nuove prospettive di ricerca sulle mutazioni della linea germinale nei modelli embrionali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La sequenza dell'RNA a singola cellula di embrioni di topo mutanti durante la gastrulazione consente una risoluzione senza precedenti delle decisioni riguardo al destino cellulare e alla specificazione delle linee cellulari, fornendo direttamente informazioni per la scoperta precoce e la validazione di bersagli in biologia dello sviluppo e modellazione delle malattie. Questa solida procedura supera gli ostacoli tecnici nella genotipizzazione e nella vitalità cellulare, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva negli studi meccanicistici della funzione genica. L'approccio aumenta il valore del portafoglio permettendo un'interrogazione sistematica delle perturbazioni genetiche in punti critici di svolta dello sviluppo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una mappatura ad alta risoluzione della dinamica dell'espressione genica durante l'impegno della linea cellulare.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli genetici coinvolti nell'organogenesi precoce.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando mutazioni a fenotipi cellulari a risoluzione singola-cellula.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione dei bersagli nei percorsi di medicina dello sviluppo e rigenerativa.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce sospensioni di singole cellule e nuclei validate per flussi di lavoro omici successivi.
- Standardizza la preparazione del campione e il genotipaggio per ottenere risultati quantitativi riproducibili.
- Consente lo screening su larga scala di perturbazioni genetiche in popolazioni embrionali sincronizzate.
- Supporta lo sviluppo di saggi robusti per la valutazione della funzione genica in tessuti complessi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i fenotipi cellulari a stadi dello sviluppo rilevanti per la malattia, al fine di scoprire biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica della funzione genica.
- Riduce i rischi nelle decisioni di avanzamento fornendo informazioni meccanicistiche sui difetti dello sviluppo.
- Permette la modellizzazione dei meccanismi delle malattie congenite a livello di singola cellula.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa metodologia integra la fase iniziale della scoperta fino all'identificazione del composto promettente e alla ricerca preclinica, consentendo un'analisi sistematica della funzione genica durante l'embriogenesi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi risolvendo le transizioni di stato cellulare in embrioni mutanti.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili a livello di singola cellula per l'analisi comparativa di varianti genetiche.
- Analisi: Offre letture ad alto contenuto informativo per il confronto statistico di popolazioni cellulari e profili di espressione genica.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica modellando processi di sviluppo rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e riutilizzabile per l'analisi single-cell di diversi modelli genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro a singola cellula.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi genetici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento, corretti per il rischio, dei programmi di biologia dello sviluppo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in embriologia, genomica a singola cellula e protocolli di genotipizzazione.
- Richiede l'accesso a piattaforme di partizionamento microfluidiche e a infrastrutture per il sequenziamento ad alto rendimento.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per la gestione dei campioni e l'analisi dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse fasi di sviluppo o contesti genetici.
- Il rendimento cellulare e la vitalità sono limitati dalla fase embrionale e dalla frequenza del genotipo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:50
Isolation of Murine Embryos During Gastrulation for Single‐Cell RNA Sequencing
5:30
Same‐Day Genotyping of Isolated Gastrulating Murine Embryos
7:22
Cell Dissociation of Isolated Gastrulating Murine Embryos for Single‐Cell Sequencing
