Name: Istituzione di un modello di impianto embrionale in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Scopri come stabilire un modello di impianto embrionale in vitro utilizzando embrioni di topo e cellule endometriali. Questo metodo semplice e riproducibile aiuta a studiare gli effetti ormonali e migliorare i risultati della fecondazione assistita.

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I nostri studi sono stati supportati dalla National Natural Science Foundation of China (82171603), dalla Foundation of Shanghai Municipal Health Commission (202140341), dalla Science and Technology Commission della Municipalità di Shanghai (23JC1403803) e dal Programma di promozione dell'innovazione di NHC e Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).

La manipolazione dei topi e gli studi sperimentali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Comitato per gli animali dell'Istituto di Shanghai per le tecnologie biomediche e farmaceutiche. Garantire le procedure di sicurezza: Indossare sempre dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati quando si maneggiano prodotti chimici o materiali biologici.
1. Acquisizione di embrioni di topo
NOTA: Questa sezione descrive il processo per ottenere embrioni di topo. Topi femmina adulta (6-8 settimane di età, ibridi C57BL/6 e DBA/2) sono stati mantenuti in condizioni ambientali standard di 12 ore di luce e 12 ore di buio a 20-25 °C e 40-60% di umidità con cibo e acqua forniti ad libitum.
<ol><li>Iniettare topi femmina per via intraperitoneale con 10 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) e poi, iniettare 10 UI di gonadotropina corionica umana (HCG) a un intervallo di 42-48 ore.</li>
	<li>Accoppia ogni topo femmina con un maschio di età comparabile e controlla se c'è un tappo vaginale la mattina successiva. NOTA: Il tappo vaginale è un grumo giallo chiaro di supposta che si forma dopo che lo sperma si è solidificato all'apertura vaginale.</li>
	<li>Eutanasia delle tope femmine con tappi vaginali per inalazione di CO2 .</li>
	<li>Aprire l'addome e localizzare i genitali femminili; allungare l'ovidotto, l'ovaio e i cuscinetti adiposi con una pinza; tagliare l'ovidotto e l'ovaio con le forbici; e poi, tagliare l'ovidotto e l'utero (Figura 1).</li>
	<li>Trasferire l'ovidotto ottenuto in una piastra di Petri da 35 mm preriempita con terreno M2. NOTA: Il mezzo M2 deve essere preriscaldato in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2) per 30 minuti.</li>
	<li>Perforare l'ampolla allargata dell'ovidotto con un ago da 25 G per rilasciare o pizzicare il complesso cumulo-zigote (Figura 2).</li>
	<li>Utilizzare una pinza per trasferire il complesso cumulo-zigote in una soluzione M2 contenente 0,5 mg/mL di ialuronidasi e incubare per diversi minuti fino a quando le cellule del cumulo non si dissociano (Figura 3).</li>
	<li>Raccogliere gli zigoti utilizzando una pipetta per il trasferimento degli ovuli e lavarli in un terreno M2 contenente 4 mg/mL di BSA per rimuovere la ialuronidasi residua, le cellule del cumulo e le impurità.</li>
</ol>2. Coltura in vitro di embrione di topo
NOTA: Questa sezione descrive in dettaglio il processo di coltura in vitro di embrioni di topo da zigoti a blastocisti. Le microgocce di coltura KSOM devono essere preparate 24 ore prima per garantire l'equilibrio della temperatura e dei gas.
<ol><li>Preparare 12 microgoccioline di terreno KSOM, ciascuna con un volume di 20 μl, sul fondo di una piastra di Petri da 35 mm. Coprire le microgoccioline con 3-5 mL di olio minerale (Figura 4) e porre le piastre di Petri in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per l'equilibratura.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni di topo dal terreno M2 al terreno KSOM utilizzando una pipetta di trasferimento per un lavaggio accurato. NOTA: Questo passaggio richiede uno stereomicroscopio con un tavolino di riscaldamento a 37 °C. Ridurre al minimo la durata della manipolazione degli embrioni al di fuori dell'incubatrice.</li>
	<li>Mettere gli embrioni lavati nelle microgoccioline KSOM preparate e incubarli a 37 °C con il 5% di CO2 per 4 giorni. NOTA: Per garantire un'alimentazione adeguata, coltivare 5-10 embrioni per microgoccia da 20 μl.</li>
	<li>Selezionare le blastocisti vantaggiose in base alle loro dimensioni (100-130 μm), alla massa cellulare interna (la massa cellulare interna è composta da molte cellule tutte compattate), al numero di cellule del trofoblasto (il trofoectoderma è composto da molte cellule coese e impacchettate insieme) e al grado di espansione (il blastocele occupa l'80-100% dell'embrione).</li>
</ol>3. Preparazione delle cellule endometriali
<ol><li>All'interno di una cappa di biosicurezza, aspirare 1 mL di gelatina al 2% utilizzando una pipetta ed erogarla in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Ruotare delicatamente la piastra per garantire la copertura completa del fondo con la gelatina. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti. Successivamente, aspirare la gelatina in eccesso e lasciare asciugare completamente il fondo del piatto.</li>
	<li>Al termine del processo di rivestimento, coltivare cellule di adenocarcinoma endometriale umano (Ishikawa) con DMEM/F12 (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di L-glutammina, 100 μg/mL di streptomicina e 100 UI/mL di penicillina, seminarle nelle piastre a 12 pozzetti rivestite di gelatina (2 × 105cellule/pozzetto) e incubare per 24 ore.</li>
</ol>4. Attaccamento all'embrione
<ol><li>Posizionare delicatamente 5-15 blastocisti fresche in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti contenente le cellule di Ishikawa preparate nella fase precedente per la co-coltura (Figura 5).</li>
	<li>Dopo 48 ore di incubazione, osservare gli embrioni al microscopio per valutare il loro stato di attaccamento. Per osservare l'attaccamento dell'embrione, spostare rapidamente la piastra tre volte. Gli embrioni non attaccati mostreranno un movimento fluttuante o rotolante sulla superficie delle cellule di Ishikawa.</li>
	<li>Calcolare il tasso di impianto dell'embrione utilizzando l'equazione (1); Utilizzare il tasso di adesione dell'embrione per rappresentare l'effetto dell'impianto. Tasso di Impianto degli Embrioni = (Embrioni Attaccati/Numero Totale di Embrioni Impiantati) × 100% (1)</li>
</ol>

Valutazione dell'adesione dell'embrione in un modello di co-coltura in vitro con cellule di Ishikawa

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interessi finanziari o di altro tipo da dichiarare.

La semplicità e la rapidità del modello in vitro proposto per l'impianto dell'embrione offrono notevoli vantaggi per lo screening farmacologico in fase iniziale e altre applicazioni di ricerca. Il protocollo semplice, unito alla natura ad alto rendimento delle linee cellulari Ishikawa, lo rende un candidato ideale per screening su larga scala, in particolare nelle prime fasi della scoperta di farmaci. Liang13 ha scoperto che il knockdown di TAGLN2 diminuisce la capacità di invasione delle cellule del trofoblasto. Green14 ha dimostrato che il fattore di crescita insulino-simile migliora la competenza di adesione della blastocisti di topo sulla base del sistema embrione-cellule di Ishikawa di topo. Il modello non solo consente la valutazione rapida dei farmaci candidati, ma facilita anche lo studio di altre molecole, come le citochine e i fattori di trascrizione, che svolgono un ruolo nell'impianto dell'embrione15,16. Date le implicazioni significative dell'impianto embrionale nella biologia riproduttiva, questo modello è promettente per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi sottostanti e per lo sviluppo di nuove terapie.
Sebbene l'attuale modello in vitro fornisca uno strumento prezioso per studiare l'impianto dell'embrione, è importante riconoscerne i limiti. Essendo un sistema di coltura 2D, manca della complessità dell'ambiente 3D in vivo 17, che può avere un impatto significativo sulle interazioni cellula-cellula e sulle vie di segnalazione. Pertanto, mentre il modello può fornire informazioni iniziali sugli effetti di varie molecole sull'adesione dell'embrione, dovrebbe essere considerato uno strumento di screening piuttosto che un sostituto per gli studi in vivo. Le direzioni future potrebbero comportare lo sviluppo di sistemi di coltura 3D più rilevanti dal punto di vista fisiologico che ricapitolino meglio il complesso microambiente dell'endometrio18, consentendo previsioni più accurate delle risposte ai farmaci e dei meccanismi molecolari. Inoltre, sarebbe utile esplorare l'integrazione di questo modello con altre tecnologie avanzate, come la microfluidica e i sistemi organ-on-a-chip19,20 per migliorarne ulteriormente la rilevanza fisiologica e le capacità predittive.
Durante il processo di terapia di riproduzione assistita, la superovulazione mira ad aumentare la produzione di ovuli nelle ovaie, aumentando così le possibilità di gravidanza. Tuttavia, questa procedura può comportare un marcato aumento dei livelli di estrogeni, superando la normale soglia fisiologica. Gli estrogeni, un ormone vitale nella riproduzione femminile, sono responsabili della promozione della proliferazione endometriale e della creazione di un ambiente favorevole all'impianto dell'embrione. Inoltre, regola l'equilibrio di altri ormoni riproduttivi, incluso il progesterone. Utilizzando un modello in vitro, i nostri risultati rivelano che mentre un aumento della concentrazione di estrogeni inizialmente migliora i tassi di impianto dell'embrione, livelli eccessivamente elevati oltre l'intervallo fisiologico ostacolano significativamente questo processo. In particolare, l'integrazione di progesterone può contrastare efficacemente questo effetto inibitorio. Queste osservazioni suggeriscono che livelli anormalmente elevati di estrogeni durante la superovulazione possono essere un fattore che contribuisce ai tassi di impianto più bassi clinicamente osservati associati ai trasferimenti di embrioni freschi rispetto ai trasferimenti di embrioni congelati. Inoltre, l'integrazione di progesterone post-trapianto è promettente nel migliorare i tassi di successo dell'impianto degli embrioni.
Abbiamo stabilito un approccio semplice, economico e affidabile per il rilevamento dell'impianto degli embrioni. Gli embrioni di topo, una volta raggiunto lo stadio di blastocisti attraverso la coltura in vitro , sono stati co-coltivati con cellule di Ishikawa. Questa configurazione sperimentale consente di esaminare il ruolo e la funzione di varie molecole, come citochine, farmaci e fattori di trascrizione, nelle prime fasi dell'impianto dell'embrione. Sebbene le linee cellulari consolidate come le cellule di Ishikawa possano non fornire i sistemi modello fisiologicamente più rilevanti se abbinate a embrioni umani o di topo, la loro adattabilità e le capacità ad alto rendimento le rendono ideali per lo screening di farmaci su larga scala in fase iniziale. Sebbene i modelli di coltura in vitro 2D che abbiamo creato richiedano un'ulteriore ottimizzazione, essi stabiliscono le basi per una modellazione endometriale ideale.

L'impianto dell'embrione, la fase iniziale di una gravidanza di successo, è fondamentale per comprenderne le basi biologiche e affrontare le sfide dell'infertilità. Tuttavia, i vincoli etici pongono limiti significativi nella raccolta di campioni di embrioni clinici umani, ostacolando la ricerca sulle intricate interazioni tra embrioni umani ed endometrio durante l'inizio della gravidanza. Una profonda comprensione di questi complessi meccanismi è vitale per far progredire la ricerca biologica fondamentale, la scoperta di farmaci e la salute riproduttiva.
I precedenti modelli in vitro utilizzavano modelli di adesione in cui le cellule epiteliali endometriali umane monostrato (RL95-2)2 venivano co-coltivate con sostituti embrionali, come le cellule di coriocarcinoma BeWo, JAr o Jeg-33 . Tuttavia, la selezione delle dimensioni degli sferoidi, che vanno da 70 a 100 μm, è stata cruciale in quanto aggregati cellulari più grandi o più piccoli potrebbero compromettere l'accuratezza dell'esperimento. In particolare, solo il 25% degli sferoidi in ogni preparazione soddisfaceva lo standard perla dimensione 4 adatta e c'erano differenze significative rispetto alle condizioni fisiologiche delle blastocisti.
Inoltre, i sistemi di coltura tridimensionali (3D) per l'endometrio e la blastocisti offrono un ambiente fisiologicamente più rilevante5, ma richiedono elevate competenze tecniche, crescita cellulare lenta, elevati costi di risorse e manutenzione, difficoltà di standardizzazione e bassa riproducibilità6.
In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro economico e rapido di impianto embrionale che può essere sviluppato e utilizzato nella maggior parte dei laboratori. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una piattaforma affidabile e riproducibile per studiare le interazioni tra embrioni ed endometrio in un ambiente controllato. Simulando gli eventi chiave dell'impianto dell'embrione in vitro, questo modello mira a colmare il divario tra i modelli animali e i contesti clinici, consentendo una ricerca più precisa e mirata.
Rispetto ai sostituti embrionali, l'uso di blastocisti di topo offre una rappresentazione fisiologicamente più rilevante del processo di impianto dell'embrione in vivo7. Inoltre, la linea cellulare di Ishikawa, derivata dall'adenocarcinoma endometriale umano, possiede caratteristiche miste dell'epitelio ghiandolare e dell'epitelio del lume uterino1, che le consentono di esprimere enzimi, proteine strutturali e recettori steroidei funzionali simili a quelli che si trovano nell'endometrio normale, fornendo così un substrato fisiologicamente rilevante per l'impianto dell'embrione. La semplicità e la rapidità del sistema di co-coltura consentono screening e test antidroga ad alto rendimento 8,9,10. Fornendo una piattaforma robusta e riproducibile, questo metodo offre l'opportunità di far progredire la nostra comprensione dell'impianto dell'embrione e del suo impatto sulla salute umana.

<table><tbody><tr><td>17-β-estradiolo</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>Il più potente ormone estrogenico per mammiferi</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>Piastre di Petri batteriologiche stile 35 x 10 mm con coperchio ermetico, polistirene vergine di grado cristallino,</td></tr><tr><td>sterile Armadio di biosicurezza</td><td>ESCO</td><td>classe <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/66873/66873eq01.jpg" style="margine: auto; ">BSC</td><td>Operazioni asettiche, preparazione di piatti di coltura, aliquotazione di reagenti, ecc</td></tr>. <tr><td>CO2 Incubatrice</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>Coltura embrionale</td></tr><tr><td>Piastra</td><td>di coltura Corning</td><td>3506</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM/F12 (1x), liquido 1:1, Contiene L-glutammina e 15 mM di tampone HEPES</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Gibco</td><td></td><td>10099141</td><td>Siero fetale bovino, qualificato, gelatina di origine australiana</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>Tipo B, polvere, bioreagente, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>HCG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>Reagente di sterilizzazione, iniezione intraperitoneale, 50 UI/mL</td></tr><tr><td>ialuronidasi </td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>Reagente, polvere </td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x), polvere, senza fenolo rosso, 5 x 10 mL</td></tr> di <tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-glutammina-200 mM (100x), liquido</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 Medium (1x), liquido, con olio minerale rosso fenolo</td></tr><tr><td> </td><td>L'olio minerale SIGMA</td><td>M8410</td><td>è adatto per l'uso come strato di copertura per controllare l'evaporazione e la contaminazione incrociata in varie applicazioni di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina, liquido</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>10.000 unità di penicillina (base) e 10.000 unità di streptomicina (base), utilizzando penicillina G (sale di sodio) e streptomicina solfato in soluzione salina allo 0,85%</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>Reagente di sterilizzazione, iniezione intraperitoneale, 50 UI/mL</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>Ormone steroideo secreto dal corpo luteo durante la seconda metà del ciclo mestruale</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Il piruvato di sodio viene comunemente aggiunto ai terreni di coltura cellulare come fonte di carbonio in aggiunta al glucosio</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>Prelievo degli embrioni e osservazione dello sviluppo degli embrioni</td></tr></tbody></table>

istituzione di un modello di impianto embrionale in vitro

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

L'impianto dell'embrione è il primo passo per l'instaurazione di una gravidanza di successo. Un modello in vitro per l'impianto dell'embrione è fondamentale per la ricerca biologica di base, lo sviluppo di farmaci e lo screening. Questo articolo presenta un modello in vitro semplice, rapido e altamente efficiente per l'impianto dell'embrione. In questo protocollo, introduciamo prima l'acquisizione di blastocisti di topo e la preparazione di cellule di adenocarcinoma endometriale umano (Ishikawa) per l'impianto, seguita dal metodo di co-coltura per embrioni di topo e cellule di Ishikawa. Infine, abbiamo condotto uno studio per valutare l'impatto di concentrazioni variabili di 17-β-estradiolo (E2) e progesterone (P4) sui tassi di adesione degli embrioni sulla base di questo modello. I nostri risultati hanno rivelato che alte concentrazioni di E2 riducono significativamente l'adesione dell'embrione, mentre l'aggiunta di progesterone potrebbe ripristinare il tasso di adesione. Questo modello offre una piattaforma semplice e veloce per la valutazione e lo screening delle molecole coinvolte nel processo di adesione, come citochine, farmaci e fattori di trascrizione che controllano l'impianto e la ricettività endometriale.

Nel processo delle tecniche di riproduzione assistita, l'iperstimolazione ovarica controllata (COH) è un passaggio cruciale, che porta a livelli di estrogeni significativamente elevati nelle pazienti di oltre 10-20 volte rispetto ai cicli naturali11. Dato questo contesto, ci siamo chiesti se alte concentrazioni sieriche di estrogeni influiscano sull'impianto dell'embrione durante il trasferimento di embrioni freschi. Sulla base di questo modello di impianto embrionale, abbiamo studiato gli effetti di varie concentrazioni di E2 e P4 sui tassi di impianto embrionale12. Dopo il trattamento di fame, le cellule di Ishikawa sono state incubate con E2 (0, 0,1, 1, 10 e 100 nM) o una combinazione di E2 e P4 (0-0, 100-0, 100-10 e 100-100 nM) per 48 ore. Le cellule sono state quindi trasferite in piastre a 12 pozzetti rivestite di gelatina e 5-15 blastocisti sono state aggiunte a ciascun pozzetto. Ogni gruppo è stato replicato 3 volte e i tassi di impianto sono stati determinati dopo 48 ore.
I risultati hanno dimostrato che concentrazioni quasi fisiologiche di E2 (10 nM) hanno aumentato i tassi di impianto dell'embrione rispetto a 0 nM E2. Tuttavia, le concentrazioni ultra-elevate di E2 (100 nM) hanno ridotto significativamente i tassi di impianto degli embrioni. L'aggiunta di P4 dose-dipendente ha alleviato gli effetti negativi dell'ultra-alto E2 sull'impianto (Figura 6). Sulla base di questo modello in vitro , illustriamo gli effetti negativi di concentrazioni ultra-elevate non fisiologiche di estrogeni sull'impianto dell'embrione e introduciamo ulteriormente l'applicazione di questo modello nella ricerca scientifica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg"> Figura 1: Escissione dell'ovidotto di topo. Allunga l'ovidotto, l'ovaio e i cuscinetti adiposi con una pinza, taglia prima l'ovidotto e l'ovaio con le forbici, quindi asporta l'ovidotto dall'utero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg"> Figura 2: Recupero dello zigote. L'ampolla di ingrandimento delle tube di Falloppio viene perforata con una pinza per rilasciare il complesso cumulo-zigote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg"> Figura 3: Isolamento di zigoti nudi con digestione con ialuronidasi. Usando una pinza, trasferire con cautela il complesso cumulo-zigote in una soluzione M2 contenente 0,5 mg/mL di ialuronidasi e lasciarlo agire per alcuni minuti fino a quando le cellule del cumulo non si staccano dagli zigoti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg"> Figura 4: Coltura in vitro di embrione di topo. Preparare 12 microgoccioline di terreno KSOM, ciascuna con un volume di 20 μL. Coprire le microgoccioline con 3-5 mL di olio minerale. Trasferire gli embrioni di topo dal terreno M2 alla metà superiore delle microgoccioline KSOM per un lavaggio accurato, posizionare gli embrioni lavati nella metà inferiore e incubarli a 37 °C con il 5% di CO2 per 4 giorni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg"> Figura 5: Impianto dell'embrione. Posizionare delicatamente 5-15 blastocisti fresche in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti contenente le cellule di Ishikawa per la co-coltura. Dopo 48 ore di incubazione, spostare rapidamente la piastra 3 volte. Gli embrioni non attaccati mostreranno un movimento fluttuante o rotolante sulla superficie delle cellule di Ishikawa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg"> Figura 6: Effetto dell'estrogeno ad altissima concentrazione sul tasso di impianto dell'embrione. L'asterisco indica una differenza statisticamente significativa, P &lt; 0,05. Abbreviazioni: E2 = estradiolo; P4 = progesterone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire un modello di impianto embrionale in vitro semplice ed efficiente per valutare le molecole rilevanti che influenzano il processo di impianto dell'embrione.

Istituzione di un modello di impianto embrionale in vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

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