Elettropenetragrafia AC-DC per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane

Il nostro gruppo sta utilizzando l'EPG per studiare come gli arbovirus e altri fattori influenzano i comportamenti di sondaggio e ingestione che si verificano durante l'alimentazione del sangue, poiché molti agenti patogeni manipolano il comportamento del vettore per migliorare la trasmissione. Fondamentalmente, stiamo studiando cosa succede durante una puntura di zanzara e come questi comportamenti influenzano la trasmissione di agenti patogeni e la patologia della malattia. Storicamente, l'EPG è stato utilizzato prevalentemente per studiare gli insetti che si nutrono di piante.

Il recente sviluppo delle procedure EPG AC-DC per gli artropodi che si nutrono di sangue ci consente di studiare i comportamenti di sondaggio e ingestione che si verificano durante l'alimentazione del sangue con un dettaglio senza precedenti senza la necessità di procedure invasive, consentendo eventualmente lo sviluppo di nuove strategie di gestione. La sfida più grande dell'utilizzo dell'EPG sugli artropodi che si nutrono di sangue è correlare le forme d'onda con attività biologiche come la salivazione e la trasmissione di agenti patogeni. Abbiamo forti ipotesi basate sulle origini elettriche delle forme d'onda e sulla letteratura, ma abbiamo ancora bisogno di prove empiriche.

Per iniziare, passare la punta di una pipetta di vetro da pascolo attraverso una fiamma, ruotando leggermente la pipetta. Ispezionare il diametro e ripetere il processo per portare la pipetta alla dimensione desiderata. Per realizzare un aspiratore per insetti, coprire l'estremità grande della pipetta da pascolo modificata con una zanzariera e inserirla nel tubo di silicone collegato a un aspiratore da laboratorio che fissa la giunzione con nastro isolante.

Per gli elettrodi di registrazione, avvolgere un blocco di schiuma con pellicola di plastica fresca per contenere i mozziconi di insetti preparati e le zanzare cablate. Raschiare il centimetro superiore del filo di rame con una lama di rasoio fino a renderlo lucido su tutti i lati. Quindi tagliare il filo d'oro di 0,025 millimetri di diametro in pezzi lunghi da quattro a cinque centimetri.

Tenere il filo in una pinza a chiusura automatica mascherata con nastro adesivo per evitare di ammaccare il filo, avvolgere delicatamente il filo d'oro tre volte attorno al filo di rame del tronchetto dell'insetto iniziando lungo la punta pulita del filo di rame. Utilizzare una sonda di dissezione per applicare la colla d'argento per tenere in posizione il filo d'oro. Dopo esserti assicurato che non ci siano estremità libere, posiziona il mozzicone di insetti nella schiuma fino a quando la colla non si asciuga.

Quindi accarezza delicatamente il filo d'oro attaccato al tronchetto dell'insetto per modellarlo in un arco lungo e delicato e taglia il filo a circa 2,5-3 centimetri di lunghezza. Lavorando sotto un microscopio di dissezione, tenere il tronco dell'insetto per il chiodo di ottone con la mano non dominante mentre il filo d'oro tocca il tavolino del microscopio di dissezione e afferrare l'estremità del filo d'oro con una pinza a punta fine usando la mano dominante, utilizzare la pinza a punta fine per incrociare la punta del filo d'oro sul filo di rame del tronchetto dell'insetto vicino all'area incollata. Quindi tirare delicatamente il mozzicone dell'insetto fino a quando il filo d'oro non forma un piccolo anello d'oro attorno alla pinza a punta fine.

Rilasciare il filo d'oro e rimuovere con cautela la pinza. Tenendo il mozzicone dell'insetto nella mano non dominante, afferra l'anello d'oro con una pinza a punta fine. Tirare il tronchetto dell'insetto mentre si ruota leggermente la pinza lontano dal tronchetto fino a quando l'anello non si piega con un angolo di 90 gradi rispetto al collo del filo.

Assicurati che l'anello d'oro sia completamente chiuso prima di rimettere il mozzicone di insetto nel blocco di schiuma. Per iniziare, prepara l'aspiratore di insetti e gli elettrodi di registrazione per il cablaggio delle zanzare. Posizionare le zanzare anestetizzate sulla schiena sul cuscinetto per anestesia con l'addome rivolto verso il ricercatore.

Dopo aver posizionato un nastro da laboratorio, applicare una goccia di 0,5 centimetri di colla d'argento appena miscelata sul nastro. Quindi aspirare l'addome di una zanzara anestetizzata nell'aspiratore. Usando l'aspirazione solo il tempo necessario per posizionare l'addome in posizione e tenere la zanzara sotto il cannocchiale da dissezione sopra la colla d'argento usando l'aspiratore.

Dopo aver immerso uno spillo da minuchin nella colla d'argento, applicare uno strato sottile sul pronoto della zanzara. Immergi rapidamente l'anello d'oro sulla punta dell'elettrodo di registrazione nella colla d'argento. Posizionalo sul punto di colla argentata sul pronoto della zanzara e fai oscillare l'anello avanti e indietro per assicurarti che sia a filo.

Quindi, sostituisci il mozzicone dell'insetto nella schiuma con un angolo che consenta alla zanzara cablata di stare comodamente in piedi quando si sveglia. Una volta cablato il numero desiderato di zanzare, posizionare il blocco di schiuma in una scatola di immagazzinaggio e mantenerlo. Per iniziare, collegare gli elettrodi di registrazione alle zanzare il giorno dell'elettropenetography o dell'esperimento EPG.

Una volta che l'host è in posizione, ruotare la testa amplifier di lato. Dopo aver rimosso una zanzara cablata, inserire il perno di ottone del tronchetto dell'insetto nella porta dell'amplificatore principale. Avviare la registrazione utilizzando il software di gestione hardware.

Posizionare l'amplificatore per la testa sopra la mano in modo che la zanzara possa stare comodamente in piedi e sondare. Accendere l'amplificatore principale mentre è collegato a terra. Regolare la posizione della mano dell'ospite secondo necessità per facilitare il successo della sonda.

Utilizzare il software di gestione hardware per effettuare osservazioni con timestamp relative alle risposte dell'host, ai comportamenti delle zanzare, alle modifiche del guadagno e ad altri eventi rilevanti durante la registrazione. Regola la posizione dei segnali sullo schermo e il guadagno del software utilizzando il software di gestione hardware per mantenere entrambi i segnali chiaramente visibili. Per regolare il guadagno hardware, capovolgere l'intervallo di un canale e gli interruttori del moltiplicatore.

Se tale regolazione non è sufficiente, ruotare la manopola del guadagno per il canale uno verso destra o verso sinistra per aumentare o diminuire rispettivamente il guadagno per evitare picchi o picchi poco chiari. Per regolare l'offset, spostare l'interruttore di offset del canale di uno sulla scatola di controllo su neg. Quindi ruotare la manopola di offset del canale fino a quando i picchi nei segnali pre e post si verificano nella stessa direzione sullo schermo del computer.

Se la zanzara si trova nel mezzo di una sonda, lasciala finire. Se non sonda entro 10 minuti, spegnere l'amplificatore principale. Chiedi all'ospite di rimuovere con cura la mano, quindi rimuovi la zanzara con il mozzicone di insetto attaccato.

Infine, sostituisci la zanzara nella scatola di immagazzinaggio. Le registrazioni EPG AC-DC delle zanzare Culex tarsalis che si nutrono sulle mani umane hanno generato forme d'onda interpretabili adatte alla classificazione in famiglie, tipi e sottotipi.