Name: Elettropenetragrafia AC-DC per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri l'elettropenetrografia AC-DC per analizzare i comportamenti di sondaggio e ingestione di Culex tarsalis sulle mani umane. Questo metodo non invasivo rivela meccanismi di trasmissione patogena.

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Siamo grati al Prof. Astri Wayadande dell'Oklahoma State University per aver aperto la strada alla procedura di cablaggio per le zanzare, e al Dr. Elaine Backus dell'USDA-ARS di Parlier, CA, e al Sig. Andrew Dowell della EPG Technologies Inc. di Gainesville, FL, per l'assistenza nella risoluzione dei problemi dell'apparecchiatura EPG. Ringraziamo anche il Dr. Dustin Swanson e il Sig. William Yarnell dell'USDA-ARS Insectary di Manhattan, KS, per aver fornito le zanzare, e la signorina Miriam Ruhinda della Kansas State University di Manhattan, KS per la sua assistenza nelle riprese dei video procedurali. Questo lavoro è stato reso possibile dall'accesso all'Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) presso la Kansas State University. Questa ricerca è stata supportata dall'USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) e dall'Hatch Multistate Project (NE1943). Questo manoscritto è il contributo n. 24-194-J della Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, USA.

Non-invasive Electropenetrography to Study Mosquito Probing Behaviors

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha il solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica una raccomandazione o un'approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni dell'USDA.

Quando si utilizza l'EPG AC-DC, è fondamentale avere una conoscenza di base del funzionamento hardware e software30 e seguire attentamente i protocolli qui descritti per evitare di danneggiare l'apparecchiatura. In particolare, evitare di toccare l'head amp quando è acceso a meno che non sia collegato a terra sulla gabbia di Faraday. Si consiglia di registrare il più indietro possibile nella gabbia di Faraday30. Le porte della gabbia non devono necessariamente essere chiuse per ottenere forme d'onda interpretabili, a meno che non si registri in un ambiente con rumore elettrico ambientale eccessivo. Nulla di motorizzato può essere nella gabbia di Faraday. È importante notare che la gabbia di Faraday stessa deve essere collegata a terra elettricamente esclusivamente attraverso l'head amp affinché funzioni correttamente. Ciò si ottiene collegando l'head amp a un supporto da laboratorio in metallo con la vernice levigata da un piede del supporto per consentire un percorso conduttivo per l'elettricità catturata dalla gabbia di Faraday per fluire verso il supporto da laboratorio, nell'involucro metallico dell'head amp, lungo il cavo fino alla scatola di controllo, attraverso l'alimentatore in una presa a muro adeguatamente messa a terra e nella terra attraverso il terreno dell'edificio30. Un multimetro può essere utilizzato per verificare la qualità della connessione tra i componenti all'interno della gabbia misurando la resistività (che è l'inverso della conducibilità) tra i vari punti. Una radio AM wireless può anche essere posizionata all'interno della gabbia di Faraday per verificare che il suono sia significativamente ridotto (o idealmente eliminato) quando le porte sono chiuse, confermando che la gabbia di Faraday stia catturando adeguatamente i segnali elettrici presenti nell'aria (E. Backus per. Comm.).
La preparazione corretta e standardizzata della colla d'argento e l'attaccamento degli elettrodi di registrazione agli insetti sono fondamentali per ottenere registrazioni utilizzabili. La cuticola dell'insetto è un isolante e funge da condensatore se la colla d'argento non penetra adeguatamente nei pori della cuticola per creare un percorso per l'elettricità che viaggia dall'interno dell'insetto al filo d'oro sulla superficie del pronoto30. Preparare la colla d'argento contemporaneamente prima di ogni sessione EPG, lavorare con colla d'argento fresca dal tubo e sostituirla frequentemente con colla d'argento a vortice vigoroso durante la procedura di cablaggio. Assicurati che l'anello d'oro sia posizionato contro il torace in modo che l'intero anello sia a contatto con la cuticola e non inclinato da un lato o separato da uno spesso strato di colla d'argento e squame per aiutare a formare una forte connessione elettrica e prevenire il distacco e la fuga della zanzara dal filo.
I protocolli qui descritti devono essere ottimizzati quando si lavora con diverse specie di zanzare. Le impostazioni EPG ottimali (livello Ri, tensione, tipo di corrente e guadagno hardware) per la registrazione su un determinato artropode devono essere determinate sperimentalmente12,30. Tuttavia, una volta regolato l'offset, non sarà necessario regolarlo nuovamente quando si lavora con zanzare simili. Sono state determinate le impostazioni ottimali per l'EPG AC-DC con Ae. aegypti26 e Cx. tarsalis27. Le librerie di forme d'onda (definite nella Tabella 2) per altre specie faciliteranno l'adozione dell'EPG per le zanzare. È inoltre necessario ottimizzare l'anestesia per la zanzara di interesse, poiché il comportamento di alimentazione del sangue può essere influenzato in modo differenziale in base alle specie di zanzara e alla scelta dell'anestesia. Ad esempio, Cx. tarsalis richiede un periodo di recupero di 4 ore dopo 15 minuti di anestesia con CO2, mentre per Ae. aegypti, un periodo di recupero di 15 minuti è sufficiente dopo un periodo di anestesia di 15 minuti con ghiaccio. I culex tarsalis, tuttavia, sono difficili da abbattere con l'esposizione al freddo, quindi la CO2 viene utilizzata prevalentemente nonostante il lungo periodo di recupero.
Sebbene il monitor EPG AC-DC sia semplice da usare dopo aver esaminato le risorse online30,31 o la formazione con un utente esperto, è necessaria una risoluzione dei problemi. Inizialmente, le registrazioni EPG dell'autore delle sonde di zanzara avevano un'onda inaspettata di 11 Hz nel pre-segnale che non era stata osservata o riportata da Wayadande e colleghi26. La consultazione con E. Backus ha indicato che la gabbia di Faraday era probabilmente il problema a causa dell'interferenza dei loop di terra. Una nuova gabbia di Faraday costruita con uno schermo di rame altamente conduttivo collegato a un telaio in alluminio imbullonato a una grande piastra di alluminio sostenuta da piedini in gomma per isolarla dalla tabella sottostante (Figura 1B), ha risolto il segnale di rumore a 11 Hz (Figura 3C,C'). Inoltre, occasionalmente, quando l'alimentatore EPG veniva acceso per la prima volta, i segnali pre e post-rettifica apparivano come linee spesse e sfocate invece che linee rette, lisce e sottili. Questo problema veniva solitamente risolto spegnendo lo strumento e controllando tutti i collegamenti dei cavi. In caso di errore, di solito è stato utile scollegare lo strumento per 1-3 minuti. Molto raramente, i segnali pre e post diventano spessi e sfocati durante il funzionamento, il che è stato risolto spegnendo lo strumento e collegandolo a una presa diversa o utilizzando un regolatore di tensione e un condizionatore di alimentazione per collegare l'EPG prima di collegarlo alla parete. Idealmente, una linea dedicata per il monitor EPG eliminerebbe il rumore di linea proveniente da frigoriferi e altre apparecchiature collegate allo stesso circuito elettrico dell'EPG30.
Attualmente, ci sono due limitazioni principali all'uso dell'EPG per studiare le zanzare. In primo luogo, sono stati eseguiti pochi studi di correlazione per verificare quali comportamenti di sondaggio corrispondono alle forme d'onda. Mentre ci sono forti ipotesi su ciò che sta accadendo durante ciascuna famiglia di forme d'onda (Tabella 1) e alcuni dei tipi di forme d'onda (M1 e M2), poche di queste ipotesi sono state confermate sperimentalmente, tranne che l'ingestione di sangue è correlata con la famiglia di forme d'onda M26,27. Ancora più importante, le forme d'onda corrispondenti agli eventi di salivazione devono essere identificate perché molti agenti patogeni vengono trasmessi nella saliva. La correlazione delle forme d'onda EPG con le attività biologiche nelle zanzare sarà necessaria per interpretare in modo significativo le differenze significative nella durata e nel conteggio delle forme d'onda tra i gruppi di trattamento. In secondo luogo, i tassi di sondaggio e di ingestione durante l'EPG possono essere molto più bassi del previsto27. Legare individualmente le zanzare a fili corti e posizionarle direttamente sull'ospite potrebbe prevenire comportamenti di ricerca dell'ospite e di alimentazione sociale a lunga distanza, che possono influenzare i comportamenti di sondaggio e ingestione. Gli insetti correttamente cablati possono camminare e volare normalmente. Tuttavia, le zanzare spesso tirano contro i fili e talvolta si aggrovigliano o si tengono ad angoli innaturali, indicando che essere cablate influisce in una certa misura sul loro comportamento. Gli autori hanno testato molte strategie per migliorare i tassi di sondaggio durante l'EPG e il digiuno delle zanzare durante la notte, utilizzando individui più anziani, esponendoli al respiro umano immediatamente prima di metterli sulla mano e applicando saliva umana alla mano sono stati i più efficaci, oltre a utilizzare ospiti che hanno costantemente apportato regolazioni su larga scala alla posizione della loro mano per garantire che la zanzara fosse nella posizione ideale per sondare27.
Nonostante queste limitazioni, l'EPG AC-DC presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri approcci per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione. Sistemi come il BiteOScope11, il flyPAD15 e l'Automated Biomaterial Platform14, progettati per quantificare i comportamenti di sondaggio e ingestione e le secrezioni salivari durante l'alimentazione del sangue, utilizzano substrati artificiali trasparenti e diete liquide prive dei normali sistemi tissutali dell'ospite e dei segnali dell'ospite. Sebbene queste piattaforme sintetiche siano utili per molti scopi sperimentali, un chiaro vantaggio dell'EPG AC-DC è la capacità di studiare questi comportamenti degli artropodi e le variabili di interesse all'interno dei sistemi ospiti naturali. Inoltre, l'adattabilità definita dall'utente del sistema EPG AC-DC offre un ulteriore vantaggio rispetto ad altri strumenti EPG22,33 e dispositivi di monitoraggio elettronico simili all'EPG 16,21, che non hanno livelli di Ri regolabili, tipi di corrente e livelli di tensione necessari per ottenere forme d'onda con la massima quantità di informazioni e ridurre al minimo gli effetti negativi su un'ampia gamma di ospiti e artropodi22, 23. Le tecniche di elettromiografia (EMG) vengono utilizzate anche per studiare l'alimentazione del sangue. Tuttavia, il circuito elettrico di solito include solo l'artropode e vengono registrati solo i potenziali muscolari più vicini all'elettrodo di registrazione, quindi le forme d'onda non forniscono informazioni sulle attività dettagliate che si verificano all'interfaccia ospite-insetto come rotture cellulari, posizioni e attività dello stiletto e potenziali di flusso attraverso l'apparato boccale28,34. Le tecniche di microscopia intravitale possono essere utilizzate per visualizzare direttamente i movimenti dettagliati dell'apparato boccale e le attività nei tessuti ospiti viventi, ma queste tecniche comportano procedure invasive su modelli animali vivi9. Solo il monitor EPG AC-DC è in grado di fornire informazioni altamente dettagliate in tempo reale sui comportamenti di sondaggio, ingestione e salivazione che si verificano nei tessuti ospiti opachi viventi senza la necessità di procedure invasive ed è adattabile per l'uso in un'ampia varietà di artropodi 10,12.
Questa è la prima procedura dettagliata passo dopo passo per il cablaggio delle zanzare, la costruzione di un aspiratore di insetti e l'esecuzione di EPG su ospiti umani. Si prevede che questi protocolli faciliteranno l'adozione dell'EPG AC-DC sulle zanzare che si nutrono di ospiti umani. Esempi di futuri sforzi di ricerca che impiegano l'EPG AC-DC possono includere studi sui meccanismi fondamentali dell'alimentazione del sangue e del danno tissutaledell'ospite 10, tra cui l'identificazione di sequenze stereotipate di comportamenti di sondaggio che precedono l'ingestione di sangue, lo studio del flusso sanguigno attraverso l'apparato boccale e il confronto della plasticità dell'alimentazione all'interno e tra le specie di artropodi/gli stadi di sviluppo26. L'EPG può anche essere utilizzato per quantificare gli effetti di insetticidi, antifeedant e repellenti12. Le procedure qui presentate per l'utilizzo dell'EPG AC-DC per studiare le zanzare sulle mani umane accelereranno questi studi e consentiranno nuove intuizioni sulla biologia dell'alimentatore di sangue delle zanzare.

Le zanzare causano sofferenze e perdite economiche in tutto il mondo a causa del loro ruolo di vettori di malattie e fastidiosi parassiti1. Le zanzare anopheles trasmettono la malaria, che ogni anno causa circa 219 milioni di casi in tutto il mondo, più di 400.000 decessi2 e 12 miliardi di dollari USA in costi diretti3. Le zanzare Aedes sono i vettori più importanti di importanza per la salute pubblica perché hanno una presenza quasi globale e trasmettono agenti di Chikungunya, febbre dengue, filariosi linfatica, febbre della Rift Valley, febbre gialla e Zika, che mietono vittime, travolgono i sistemi sanitari e provocano sofferenza cronica, morbilità permanente e disabilità4,5. Inoltre, le zanzare Culex trasmettono agenti di encefalite equina, encefalite giapponese, filariosi linfatica, encefalite di Saint Louis e febbre del Nilo occidentale, che hanno un impatto sulla salute umana e animale3,4.
Il controllo dei vettori con approcci basati su insetticidi è il metodo principale per il controllo delle malattie trasmesse da vettori a livello globale6,7. Tuttavia, il numero di insetticidi disponibili per il controllo delle zanzare è limitato. Inoltre, la resistenza agli insetticidi si sta evolvendo in molte specie, specialmente nelle zanzare Aedes, influenzando la nostra capacità di combattere le malattie trasmesse da vettori e determinando la necessità di nuove strategie di controllo6,8. Una migliore comprensione della biologia delle zanzare, delle interazioni zanzara-ospite-patogeno e dei processi che regolano la trasmissione dei patogeni può facilitare lo sviluppo di nuovi strumenti per il controllo dei vettori6.
I comportamenti di sondaggio e ingestione nei tessuti dell'ospite possono influenzare la trasmissione di agenti patogeni e la patologia della malattia9,10,11,12. Ad esempio, sono state ingerite più microfilarie quando Aedes aegypti si nutriva direttamente dai capillari piuttosto che raccogliere sangue all'esterno dei vasi rotti13. Pertanto, la ricerca di base e applicata su questo argomento può aiutare a sviluppare, perfezionare e valutare le strategie di controllo delle zanzare e altre contromisure per la trasmissione di agenti patogeni. Tuttavia, esistono significative lacune di conoscenza nei dettagli dei comportamenti criptici di alimentazione del sangue che si verificano sotto la superficie della pelle dell'ospite perché questi comportamenti spesso richiedono procedure invasive su modelli animali vivi o impiegano substrati artificiali trasparenti o diete liquide9,11,14,15. Le tecniche di elettropenetragrafia non invasiva (EPG; chiamata anche grafo di penetrazione elettrica) sono state utilizzate per studiare i comportamenti alimentari degli insetti che si nutrono di piante correlate alla trasmissione di patogeni delle piante, alla resistenza delle piante ospiti e alle modalità d'azione degli insetticidi perché consentono ai ricercatori di osservare, registrare e quantificare indirettamente i movimenti e i comportamenti dell'apparato boccale che si verificano all'interno dei tessuti ospiti10,12.
Dagli anni '50, le tecniche di monitoraggio elettronico della penetrazione sono state applicate agli artropodi che si nutrono di sangue, comprese le zanzare16,17,18,19,20. Tuttavia, l'EPG non è mai stato ampiamente adottato per gli artropodi che si nutrono di sangue perché le attività biologiche corrispondenti alle forme d'onda non sono mai state verificate21. Inoltre, i progetti e l'elettronica dei primi strumenti hanno portato a un'eccessiva enfasi di alcuni segnali elettrici, ad alti rapporti rumore/segnale, bassa risoluzione e distorsione delle forme d'onda e irritazione per gli ospiti vertebrati12,22. Uno strumento più recente, il monitor AC-DC EPG23, ha impostazioni variabili e una migliore elaborazione del segnale, rendendolo più adatto per registrare artropodi che si nutrono di sangue e decifrare le origini biologiche delle forme d'onda negli studi di correlazione sperimentale10,12.
Per l'EPG, un segnale elettrico viene applicato all'host attraverso una sonda di tensione del substrato (ad esempio, un elettrodo di riferimento). L'artropode è attaccato a un elettrodo di registrazione e posizionato sull'ospite. Quando l'artropode inserisce il suo apparato boccale (cioè gli stiletti) nell'ospite, il segnale elettrico viene trasmesso al monitor AC-DC EPG per l'elaborazione del segnale. I segnali elettrici vengono quindi visualizzati su un computer come "forme d'onda" corrispondenti a comportamenti specifici come i movimenti dell'apparato boccale, l'ingestione, la salivazione e l'acquisizione/inoculazione di agenti patogeni10,12. Le variabili di risposta sequenziali e non sequenziali relative alla durata e al conteggio delle forme d'onda24,25 a diversi livelli gerarchici (famiglie, tipi e sottotipi) possono quindi essere calcolate in base alla frequenza e alla durata delle forme d'onda per ottenere informazioni sui comportamenti alimentari che si verificano all'interno e tra le specie e in risposta a fattori biotici e abiotici, come ospiti, agenti patogeni, pesticidi e condizioni ambientali10,12.
Finora, il monitor EPG AC-DC è stato utilizzato per caratterizzare i comportamenti di sondaggio e ingestione di Ae. aegypti26 e Culex tarsalis27 zanzare che si nutrono di mani umane e zecche Dermacentor variabilis e Amblyomma americanum che si nutrono di vitelli bovini28. Inoltre, è stato recentemente sviluppato un modello murino per EPG29 per facilitare gli studi sui patogeni utilizzando questo strumento. Le mani umane sono ideali per la caratterizzazione iniziale della forma d'onda della zanzara perché gli ospiti umani possono segnalare quando sentono il sondaggio della zanzara e altri comportamenti, rendendo più facile la correlazione delle forme d'onda con i comportamenti (Tabella 1). Inoltre, una migliore comprensione della plasticità nei comportamenti alimentari tra le zanzare in diverse popolazioni umane potrebbe contribuire allo sviluppo di interventi di gestione più specializzati per le zanzare e i patogeni che trasmettono.
Tabella 1: Descrizione delle famiglie di forme d'onda utilizzate per classificare i segnali elettrici registrati da Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando AC-DC EPG. La fase di sondaggio e le attività biologiche corrispondenti a ciascuna famiglia di forme d'onda. Vedi Cooper et al.27 per maggiori informazioni. Abbreviazione: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/Table1_31July2024.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa Tabella.</a>
Per facilitare l'uso dell'EPG per studiare la biologia delle zanzare e le interazioni ospite-vettore, qui viene presentata la metodologia per quantificare i comportamenti alimentari delle zanzare Cx. tarsalis sulle mani umane utilizzando il monitor EPG AC-DC. Questi protocolli si basano sulle procedure fondamentali AC-DC EPG descritte nelle risorse online30 e presuppongono che gli utenti abbiano una conoscenza operativa di base di AC-DC EPG e del software associato31. Le procedure descritte possono essere modificate per altre specie di zanzare e ospiti e forniscono una base per facilitare la ricerca basata su ipotesi sui comportamenti alimentari delle zanzare.
Tabella 2: Definizioni della terminologia comune AC-DC EPG. Le definizioni si basano su quelle fornite nelle risorse online30,31 e nella letteratura scientifica32. Abbreviazione: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/66877_Table 2.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

<table><tbody><tr><td>Strumentazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettropenetrografo a 4 canali AC-DC</td><td>EPG Technologies, Inc.</td><td></td><td>Per l'EPG, include l'alimentatore, la scatola di controllo, la scatola di interfaccia dell'interruttore, quattro amplificatori dello stadio principale, quattro sonde di tensione del substrato e i relativi cavi I</td></tr><tr><td>cuscini d'aria</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>consentire all'ospite umano di appoggiare la mano/il braccio durante l'EPG</td></tr><tr><td>DI-710 Hardware di acquisizione dati (AD Board)</td><td>DATAQ Instruments Inc.</td><td></td><td>per digitalizzare i segnali EPG analogici in modo che possano essere visualizzati su un computer</td></tr><tr><td>Lampada d'ingrandimento a LED dimmerabile, grande lente d'ingrandimento a mani libere 5X con luce e supporto per la lettura Hobby Artigianato Cucito Banco da lavoro</td> Amazon.com <td>per l'osservazione comportamentale durante l'EPG; utilizzare solo scollegato durante l'EPG o potrebbero verificarsi rumori</td><td></td> Microscopio digitale Dino-Lite Edge (ingrandimento 250x)Dino-Lite AF4915ZT <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>per l'osservazione comportamentale durante l'EPG</td></tr><tr><td>Dino-Lite Flex-arm Desktop Stand</td><td>Dino-Lite</td><td>MS22B</td><td>per tenere e manipolare la telecamera</td></tr><tr><td>Eisco Steel Retort Base Stand and Rod Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>S41740</td><td>per tenere l'amplificatore dello stadio principale e mettere a terra la gabbia di Faraday (deve essere in metallo)</td></tr><tr><td>EPG Online Workshop</td><td>UF IFAS Extension</td><td>https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022</td><td>AKA, "risorse online" per l'apprendimento dell'EPG (configurazione dello strumento, raccolta e analisi dei dati, costruzione di Faraday, preparazione della colla d'argento, costruzione di tronchi di insetti, ecc.)</td></tr><tr><td>Furman P-1800 AR Regolatore di potenza/Condizionatore di potenza</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per ridurre il rumore di linea</td></tr><tr>Piccolo <td>Amazon.com</td><td></td><td>di imbottitura a bolle</td><td>d'aria da utilizzare come barriera tra l'ospite e la gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp Holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-121</td><td>per contenere l'amplificatore dello stadio principale e mettere a terra la gabbia di Faraday (deve essere in metallo e non rivestita in plastica)</td></tr><tr><td>Computer Windows</td><td>Best Buy</td><td></td><td>per EPG e analisi statistiche</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backus 2.0 Programma SAS per l'analisi dei dati&nbsp;</td><td>UF IFAS Extension</td><td>https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/</td> <td>per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda</td></tr><tr><td>Ebert 1.0 File Manipulator e Error Checker Programmi SAS</td><td>UF IFAS Extension https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/</td><td></td> <td>per la preparazione di file per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda</td></tr><tr><td>SAS versione 9.4</td><td>SAS Institute Inc.</td><td></td><td>per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda</td></tr><tr><td>WinDaq Lite&nbsp;</td><td>Strumenti DATAQ Inc.</td><td></td><td>per la registrazione e la revisione dei dati EPG. Include il software WinDaq Hardware Manager (AKA, "software di gestione hardware") e il software WinDaq Waveform Browser (AKA, "software di revisione delle forme d'onda"). Per l'uso solo su computer Windows.</td></tr><tr><td>gabbia di Faraday</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>telaio dello schermo in alluminio</td><td>Home Depot</td><td>MSCF5167</td><td>per le pareti della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio, 0,125 (1/8) spessore 3003-H14</td><td>Deposito metalli</td><td>S318</td><td>per la base della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Bretelle angolari, 1"&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>339547</td><td>per&nbsp; le pareti della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Viti a macchina Phillips a testa piatta, #6-32 x 1"</td><td>Home Depot</td><td>459999</td><td>per la costruzione della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Rondelle piatte, #6&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>638977</td><td>per la costruzione di gabbie di Faraday</td></tr><tr><td>Multimetro digitale Fluke 15B+, per applicazioni elettriche, misura misure di tensione e corrente CA/CC fino a 1000 V e 10 A, insieme a capacità di resistenza, continuità, diodo e capacità</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per testare la gabbia</td></tr> <tr><td>di FaradayRadio portatile AM FM, radio a transistor Goodes con altoparlante, jack per cuffie, radio a batteria 2AA per la ricezione a lungo raggio, radio tascabile per uso interno, esterno e di emergenza</td><td>Amazon.com</td><td></td> per testare lo schermo in rame puro <td>della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>, maglia 16 x 16 con diametro del filo 0,11, 36 "x 12'Metro</td> <td>Screenworks</td><td></td><td>per le pareti della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Viti a macchina combinate a testa tonda, #6-32 x 3/4 "</td><td>Home Depot</td><td>528466</td><td>per la costruzione della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Carta vetrata, 1/2" per 1", 150 Grit</td><td>Home Depot</td><td>19036-20-CC</td><td>per la rimozione della vernice dal fondo del supporto da laboratorio Angoli del</td></tr><tr><td>telaio dello schermo, 5/16"&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>WCORN516</td><td>per le pareti della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Scanalatura dello schermo, 0,14"</td><td>Home Depot</td><td>3034719</td><td>per le pareti della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Insect Stubs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brass Escutcheon Pins Home</td><td>Depot</td><td></td><td>801294 per la costruzione di stub di insetti... &nbsp;</td></tr><tr><td>Filo di rame, 20 AWG</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per la costruzione di tronconi di insetti &nbsp;</td></tr><tr><td>Influenza idrosolubile di Harris</td><td>Home Depot</td><td>355398</td><td>per aiutare a saldare, rivestire il filo di fusto degli insetti e formare una forte connessione</td></tr><tr><td>Pinze ad ago</td><td>Home Depot</td><td></td><td>per piegare il filo durante la costruzione di tronchetti di insetti Kit</td></tr><tr><td>Pro 900-015 Helping Hands Aiuto per la saldatura</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per tenere i perni della rosetta durante la saldatura</td></tr><tr><td>Saldatura (con nucleo di colofonia)</td><td>Home Depot</td><td>296497</td><td>per la costruzione di stub di insetti&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Home Depot</td><td></td><td>per spelare e tagliare il filo di rame durante la costruzione di tronconi di insetti</td></tr><tr><td>YIHUA 928D-III, saldatore ad alta potenza da 110 W,</td><td>Amazon.com</td><td></td> di saldatura completamente digitale <td>per la costruzione di tronconi di insetti; viene fornito con un supporto, una spugna e lana d'acciaio per la pulizia</td></tr><tr><td>Aspiratore di insetti</td><td></td><td></td><td></td></tr> Strumenti <tr><td>Accuris</td><td></td><td>V0020</td><td>per l'applicazione dell'aspirazione all'aspiratore per insetti; include il controller del vuoto portatile, l'adattatore in acciaio inossidabile a punta fine (40 mm) e l'adattatore per puntali per pipette</td></tr><tr><td>Pipette Chemglass Life Sciences Pasteur, lunghe 5 3/4</td>" <td>Fisher Scientific</td><td>NC0230004</td><td>per l'uso come aspiratore di insetti durante il cablaggio delle zanzare</td></tr><tr><td>Nastro isolante in vinile colorato elettrico commerciale</td><td>Home Depot</td><td></td><td>per il fissaggio della pipetta Pasteur modificata alla linea del vuoto</td></tr><tr><td>Tessuto multiuso per zanzariere, 10 x 10 cm quadrati</td><td>Joann Fabrics</td><td>16651622</td><td>per evitare che le zanzare vengano aspirate nella pompa del vuoto</td></tr><tr><td>Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-206-8914</td><td>per passare in modo rapido e semplice tra diverse pipette Pasteur modificate</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene HDPE Sganciatine rapide (da 3/8 a 7/16 in. I.D.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-315B</td><td>per passare rapidamente e facilmente da una pipetta Pasteur all'altra</td></tr><tr><td>Silver Glue&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elmer's Glue-All Multi Purpose White Glue</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per la preparazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Silver Flake 99,9% puro,&nbsp; 4-8 &; m</td><td>ThermoFisher</td><td>786.09</td><td>per la preparazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Fiocco d'argento puro al 99,95%, 8-10 &micro; m</td><td>Inframat Advanced Materials</td><td>47MR-12F</td><td>per la preparazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Insect Anesthesia</td>CO2<<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>/sub> bubbler kit, 1000 mL, #9 Tappo in gomma</td><td>FlyStuff</td><td>59-181</td><td>per prevenire l'essiccazione degli insetti durante l'utilizzo del</td></tr><tr><td>flypad Flypad&nbsp; telaio, misura standard</td><td>FlyStuff</td><td>59-118</td><td>per evitare che le zanzare cadano dal flypad</td></tr><tr><td>Flystation Brush</td><td>FlyStuff</td><td>59-205</td><td>per ridurre l'elettricità statica quando si lavora su un fly pad</td></tr><tr><td>Flystuff&nbsp; Flypad&nbsp; dimensioni standard</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td>AKA "tappetino per anestesia" per l'anestesia delle zanzare</td></tr><tr><td>Imbuto (diametro 4 pollici)</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per gassare le tazze di zanzare prima del trasferimento sul flypad</td></tr><tr><td>Vetro plexi o un coperchio piatto in plastica (tagliato a misura)</td><td>Home Depot</td><td>MC-27</td><td>per coprire il flypad se le zanzare iniziano a svegliarsi</td></tr><tr><td>Chiusura dei tubi in plastica Fascette stringitubo Posizione singola e apertura regolabile (varietà da 1/8" a 1/2")</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per deviare il gas tra il flypad e l'imbuto</td></tr><tr><td>Regolatore CO2</td><td>monostadio FlyStuff</td><td>59-142</td><td>per la regolazione del flusso di gas dal </sotto>serbatoio CO2</td></tr><tr><td>" T&rdquo; Raccordo per tubo ID da 1/8</td>" <td>FlyStuff</td><td>59-123</td><td>per collegare sia il flypad che l'imbuto al serbatoio CO2</td></tr><tr><td>Tubo, trasparente&nbsp;</td><td>FlyStuff</td><td>59-124C</td><td>per il collegamento dell'imbuto e del flypad al regolatore sul serbatoio CO2</td></tr><tr><td>Insect Wiring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartoncino nero, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"</td><td>s Michael's Stores Inc.</td><td>327826</td><td>per rendere il filo d'oro più facile da visualizzare</td></tr> Carta <tr><td>da costruzione nera quadrata 3,5 "x 4,0"</td> <td>Graffette</td><td>956221</td><td>per rendere il filo d'oro più facile da visualizzare</td></tr><tr><td>Batuffoli di cotone</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per le zanzare a digiuno</td></tr><tr><td>Schiuma artigianale # 12 blocco (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)</td><td>Joann Fabric and Craft Store</td><td>1941079</td><td>per tenere le zanzare cablate</td></tr><tr><td>Nastro deflesso Dispenser,</td><td>Amazon.com</td><td></td> trasparente <td>per la conservazione del filo d'oro</td></tr><tr><td>Pinze per entomologia Featherweight</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72110</td><td>per la manipolazione degli insetti</td></tr><tr><td>Pinze fini (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>per creare un anello d'oro durante il cablaggio delle zanzare</td></tr><tr><td>Pennello a punta fine</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per manipolare le zanzare durante il cablaggio e l'EPG; deve avere un manico in plastica o legno se utilizzato per EPG</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento standard a punta fine, strette, 5,8 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>7761D21</td><td>per la preparazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Filo d'oro, puro al 99,99%, spessore 0,025 mm</td><td>Goodfellow</td><td>AU005121</td><td>per il cablaggio delle zanzare</td></tr><tr><td>Spille minuziose, punta 0,2 mm, 1 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681411</td><td>per applicare la colla alle zanzare Bicchieri</td></tr> di <tr><td>carta&nbsp;</td>Tubo <td></td><td>di carta rigido</td><td>per zanzare a digiuno&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Morsa a spillo</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-996-811</td><td>per tenere il perno minuzioso durante il cablaggio degli insetti</td></tr><tr><td>Scatola di stoccaggio in plastica con coperchio (7 pollici x 9 pollici x 14 pollici)</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per il trasporto di zanzare cablate</td></tr><tr><td>Vetro plexi o un coperchio piatto in plastica (tagliato a misura)</td><td>Home Depot</td><td>MC-27</td><td>per coprire il cuscinetto antimosche se le zanzare iniziano a svegliarsi</td></tr><tr><td>Pinze a chiusura automatica</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-906</td><td>per contenere e manipolare filo d'oro</td></tr><tr><td>Gas compresso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 gas serbatoio</td><td>Gas Matheson</td><td></td><td>per anestetizzare le zanzare con un flypad</td></tr><tr><td>Common Lab Items</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacchetti monouso per autoclave a rischio biologico, 8 1/2" x 11"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>03-410-591</td><td>per lo smaltimento delle zanzare alimentate con sangue</td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen o torcia a propano</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per la modifica delle pipette Pasteur</td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio colorato</td><td>Daigger Fornisce</td><td>EF9763R</td><td>per l'etichettatura, la preparazione della colla d'argento e le pinze per mascheratura</td></tr><tr><td>Puntali per pipette monouso, 1000 e micro; L</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>per aliquotare l'acqua durante la produzione di colla d'argento</td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>per il cablaggio delle zanzare Sonda</td></tr> di <tr><td>dissezione</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9109673</td><td>per agitare e applicare la colla d'argento</td></tr><tr><td>Pallone di Erlenmeyer, 1000 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>per prevenire l'essiccazione degli insetti durante l'utilizzo del flypad</td></tr><tr><td>Etanolo, 70%&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td>per il recupero delle zanzare fuggite Piastre</td></tr> di <tr><td>Petri in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td>per l'anestetizzazione delle zanzare con ghiaccio</td></tr><tr><td>Guanti</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>per la protezione personale</td></tr><tr><td>Kimwipes Tergicristalli delicati per attività a marchio KimTech Science</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>per schiacciare le zanzare</td></tr><tr><td>Camici da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>per la protezione personale</td></tr><tr><td>Flaconi spray LiBa, flaconi spray vuoti ricaricabili (sicuri per l'alcol denaturato)</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per il recupero delle zanzare fuggite</td></tr><tr><td>Barra di agitazione magnetica, lunga 2 cm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>per la miscelazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Pipetta meccanica monocanale, 1000 &; L</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-690-032</td><td>per l'aliquotazione dell'acqua durante la produzione di colla d'argento</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>780420</td><td>per la conservazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Parafilm M&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-944</td><td>per sigillare provette di colla d'argento</td></tr><tr><td>Involucro di plastica</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>per coprire il blocco di schiuma</td></tr><tr><td>Pyrex 20 mL becher</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>07-250-051</td><td>per mescolare la colla d'argento</td></tr><tr><td>Semi-Micro Balance</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10-919-370</td><td>per pesare colla e scaglie d'argento</td></tr><tr><td>Penna pennarello,</td><td>Amazon.com</td><td></td> a punta fine <td>per l'etichettatura</td></tr><tr><td>Lama di rasoio a filo singolo</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>71980</td><td>per la pulizia di mozziconi di insetti</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso standard</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>133-711-7mL</td><td>per il trasferimento di colla d'argento in una provetta di stoccaggio&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra di agitazione</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>per la miscelazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Timer/cronometro</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>per cronometrare per quanto tempo l'ospite è esposto a ciascun insetto</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura (18 M&Omega;)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>per la preparazione della colla d'argento</td></tr><tr><td>Forbici multiuso</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td>per il taglio del filo d'oro</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>per la miscelazione di colla d'argento</td></tr><tr><td>Study Organisms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culex tarsalis zanzare</td><td>USDA ARS Center for Grain and Animal Health Research a Manhattan KS</td><td></td><td>per l'uso come soggetti di studio</td></tr></tbody></table>

elettropenetragrafia ac-dc per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare culex tarsalis sulle mani umane

AC-DC Electropenetrography for the Study of Probing and Ingestion Behaviors of Culex tarsalis Mosquitoes on Human Hands

Le zanzare trasmettono agenti patogeni che influenzano negativamente la salute umana e animale. Una maggiore comprensione della loro biologia dell'alimentazione del sangue e delle interazioni con ospiti e agenti patogeni potrebbe essere sfruttata per sviluppare nuovi bersagli per il controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare. Sfortunatamente, i comportamenti di sondaggio (cioè puntura) delle zanzare sono poco compresi perché si verificano all'interno dei tessuti dell'ospite. Qui, viene descritta una procedura non invasiva per l'utilizzo dell'elettropenetragrafia AC-DC (EPG) per visualizzare e quantificare indirettamente i comportamenti alimentari delle zanzare registrando i cambiamenti nei segnali elettrici generati durante il sondaggio e l'ingestione sulle mani umane. Sottili fili d'oro sono attaccati alle zanzare utilizzando colla d'argento conduttiva e collegati allo strumento EPG. L'ospite umano tiene in mano una sonda di tensione del substrato. L'indagine dell'ospite da parte della zanzara cablata completa il circuito elettrico e i segnali elettrici vengono registrati su un computer come "forme d'onda" che possono quindi essere misurate ed enumerate per l'analisi. Questa metodologia è stata utilizzata per caratterizzare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Aedes aegypti e Culex tarsalis e può essere applicata ad altre specie di zanzare. L'EPG può essere utilizzato per studiare gli effetti di agenti patogeni, insetticidi e altri fattori sui comportamenti alimentari delle zanzare.

Le registrazioni EPG AC-DC della alimentazione ematica di zanzare Cx. tarsalis su mani umane (Figura 4) hanno generato forme d'onda interpretabili, adatte all'analisi e alla pubblicazione27. Le forme d'onda interpretabili presentavano schemi ripetuti distinti e distinguibili, classificabili in famiglie (Tabella 1 e Figura 4), tipi e sottotipi, una volta regolati la compressione (definita nella Tabella 2) e il guadagno del software nel programma di revisione delle forme d'onda27,31. Tutte le famiglie di forme d'onda (J, K, L, M, N) e i tipi (L1, L2, M1, M2) precedentemente descritti in Ae. aegypti durante l'alimentazione su mani umane26 sono stati identificati anche nelle forme d'onda prodotte da Cx. tarsalis che si nutrono su mani umane, confermando la validità dei metodi qui descritti. Inoltre, sono stati identificati tre nuovi tipi di forme d'onda (M3, N1, N2) e numerosi sottotipi di L1, L2, M1 e M227. In aggiunta, la caduta di tensione al valore di base al ritiro delle parti boccali dall'ospite è stata denominata famiglia di forme d'onda W27.
La variazione sistematica delle impostazioni dello strumento (tipo di corrente e livelli di Ri) seguendo le procedure descritte qui ha permesso di determinare le impostazioni ottimali per la registrazione dell'alimentazione di Cx. tarsalis su mani umane, le origini elettriche di ciascun tracciato, la durata media in secondi delle punture complete e incomplete per zanzara e il confronto statistico della durata del tracciato in secondi per insetto (WDI), del numero di eventi di tracciato per insetto (NWEI) e della durata del tracciato in secondi per evento per insetto (WDEI) tra le diverse impostazioni27. Le zanzare sono state inoltre interrotte durante diversi tracciati ed esaminate mediante dissezione per determinare quale tracciato fosse correlato all'ingestione di sangue27. Un'indagine simile è stata condotta per Ae. aegypti utilizzando una metodologia comparabile26.
A causa della natura sensibile e complessa dell'EPG, non tutte le registrazioni erano altrettanto nitide rispetto a quelle mostrate in Figura 4. Picchi (Figura 3A,C), variazioni del guadagno hardware (Figura 3A,C), collegamenti elettrici scadenti (Figura 3B), inversione del raddrizzatore nella forma d'onda J (Figura 3C,C') e rumore elettrico (Figura 3C,C') hanno occasionalmente distorto e mascherato le forme d'onda, rendendole inadatte per figure di qualità pubblicabile e complicando la valutazione e l'analisi. Pertanto, si raccomanda un impegno iniziale per perfezionare le tecniche di cablaggio, ottimizzare le impostazioni di guadagno e tensione, regolare l'offset e controllare il rumore elettrico. Curiosamente, l'inversione del raddrizzatore è stata osservata soltanto nella famiglia di forme d'onda J per Cx. tarsalis (Figura 3C,C') e non si è più verificata una volta regolato inizialmente l'offset, anche quando sono state utilizzate altre specie di zanzare (Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus) (dati non mostrati). Inoltre, il controllo diagnostico ha rivelato che il rumore elettrico incontrollato mostrato in Figura 3 (pannelli C e C') era dovuto a una gabbia di Faraday difettosa. Le registrazioni effettuate nella gabbia di Faraday difettosa erano comunque utilizzabili, ma i problemi di rumore sono stati risolti costruendo una gabbia di Faraday migliorata (Figura 1B).
Anche quando sono state adottate tutte le precauzioni e le ottimizzazioni iniziali, lievi variazioni nella qualità dell'attacco dell'elettrodo al morso e altri fattori sconosciuti che alteravano il segnale e modificavano periodicamente il rapporto segnale-rumore rendevano necessario regolare il guadagno hardware durante la registrazione, al fine di mantenere il segnale entro un intervallo visibile e garantire una risoluzione sufficiente dei picchi in ogni forma d'onda per l'identificazione e la caratterizzazione. Purtroppo, regolare il guadagno hardware durante la registrazione può causare bruschi spostamenti di tensione (Figura 3A, C), rendendo le forme d'onda poco adatte per la pubblicazione, ma comunque utilizzabili (totalmente o parzialmente) per misurazioni e analisi.
<img alt="Diagrammi di equilibrio statico che mostrano l'analisi delle forze; i grafici evidenziano le equazioni ΣFx=0, ΣFy=0." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66877/66877fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4: Forme d'onda rappresentative registrate da una sonda di Culex tarsalis su una mano umana, utilizzando un Ri di 107 Ω e un segnale applicato di 250 mV AC. I nomi delle forme d'onda a livello familiare (NP, J, K, L, M, W) sono indicati nella parte superiore di ciascun pannello. I pannelli inferiori mostrano ingrandimenti di alcune regioni del pannello A. I pannelli inseriti mostrano ingrandimenti delle regioni indicate. Le scale temporali e i guadagni del software sono: (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Abbreviazioni: AC = corrente alternata, Ri = resistenza di ingresso, mV = millivolt, Ω = Ohm, s/div = secondi per divisione. Questa figura è stata preparata utilizzando dati di Cooper et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/66877fig04large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Sono descritte le procedure per studiare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando l'elettropenetragrafia AC-DC.

Elettropenetragrafia AC-DC per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane

Mosquitoes transmit pathogens that negatively affect human and animal health. A greater understanding of their blood-feeding biology and interactions with ...

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