Name: Procedure per la coltivazione in vitro di Treponema pallidum, la spirocheta della sifilide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri la coltivazione in vitro di Treponema pallidum in co-cultura con cellule Sf1Ep. Questo metodo scalabile consente la produzione di grandi quantità di batteri e la generazione di colture clonali per la ricerca sulla sifilide.

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<meta charset="utf8"></head><body>Coltivazione in vitro scalabile di T. pallidum utilizzando la co-coltura di cellule di mammifero

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 m EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E8008</td><td></td></tr><tr><td>10x Earle' s Sali bilanciati, senza Mg2+, Ca2+</td><td>Gibco</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>15 e 50 mL di provette da centrifuga sterili coniche monouso&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>fiale criogeniche da 2 mL&nbsp;</td><td>Piastre</td><td></td> per colture cellulari a 6 pozzetti Corning 430659 <td></td></tr><tr><td>per la coltivazione di T. pallidum&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Le piastre devono avere coperchi a bassa evaporazione.</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 palloni per colture tissutali con tappi ventilati</td><td>Corning</td><td>43061U</td><td></td></tr><tr><td>93,5% azoto, 5% CO2 e 1,5% ossigeno per terreno di pre-equilibratura e colture</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>95% azoto e 5% CO2 per terreno di pre-equilibratura e colture</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre trasparenti a fondo piatto trattate con coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Corning Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale regolabile con capacità di 200 ul&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Opzionale, ma molto utile per la clonazione</td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066 senza L-Glutammina o Rosso Fenolo</td><td>US Biological</td><td>C5900-03A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 per incubatori tri-gas e per colture tissutali&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio criogenico per colture cellulari di azoto liquido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti monouso, 0,2 &micro; m , > capacità di 100 mL</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipette monouso: 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspirante</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (grado di coltura cellulare sterile)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, inattivato a caldo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Consigliamo vivamente questo prodotto. È necessario effettuare un pre-screening per verificare la compatibilità delle culture T. pallidum se si utilizza una marca o un numero di catalogo diverso.</td></tr><tr><td>Congelatore con capacità di mantenere -70 gradi C o -80 &deg; C</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per lo stoccaggio di T. pallidum; può essere utilizzato lo stoccaggio di azoto liquido</td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento (Sf1Ep medio + 10% [v/v] DMSO)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bombole di gas con raccordi appropriati</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo anaerobico ventilato GasPak 150 (Brewer Jar)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-816</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camere di conteggio Helber con sentenze Thoma</td><td>Hawksley Attrezzature</td><td></td> mediche e di laboratorio <td>Per quantificare T. pallidum</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Per la quantificazione cellulare Sf1Ep</td></tr><tr><td>Interruttore del serbatoio dell'incubatore</td><td>NuAire&nbsp;</td><td>NU-1550 TankGuard Interruttore automatico del serbatoio dell'incubatore di CO2</td><td>Opzionale, ma molto utile per mantenere condizioni di O2 adeguate.</td></tr><tr><td>Microscopio invertito con ottica a contrasto di fase</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per la visualizzazione di colture cellulari Sf1Ep</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>L-Istidina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio con condensatore a campo scuro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Il microscopio dovrebbe avere un obiettivo 40x e oculari 15x.</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore multicanale per aspiratore</td><td>Integra</td><td>155520</td><td>Opzionale, ma utile per la clonazione di</td></tr><tr><td>NaHCO3 (7,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Azoto per incubatore tri-gas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>Sf1Ep (NBL-11) cellule</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-68</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td> <td>di sodioSigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterile (senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti sterili, 50 o 100 mL di dimensioni</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T. pallidum campione, congelato o fresco&nbsp;</td><td></td><td></td><td>da un'infezione di coniglio o da coltura in vitro</td></tr><tr><td>Incubatrice per colture tissutali mantenuta a 37 ° C, 5% CO2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali tri-gas mantenuto a 34 &deg; C, 5% CO2, 1,5% O2</td><td>Thermofisher</td><td>Heracell&trade; Incubatore a CO2 tri-gas VIOS 160i</td><td>Opzionale; al suo posto possono essere utilizzati barattoli anaerobici (vedi Rif. 17)</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Fonte di vuoto (ad es. vuoto domestico), tubo per vuoto, vacuometro e connettori</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, adatto per colture cellulari, sterilizzato con filtro, purificato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>Consigliato per la preparazione di terreni; riduce la variabilità della coltura</td></tr></tbody></table>

procedure per la coltivazione in vitro di treponema pallidum, la spirocheta della sifilide

Procedures for In Vitro Cultivation of Treponema pallidum, the Syphilis Spirochete

Utilizzando le condizioni descritte, T. pallidum mantiene tipicamente &gt;90% di motilità e si moltiplica logaritmicamente con un tempo di raddoppio da 33 ore a 45 ore per circa 7 giorni prima di entrare nella fase stazionaria (Figura 3). Nel corso di 1 settimana, le spirochete subiscono circa 4-5 raddoppi (Figura 4). ). Inoltre, diversi ceppi di T. pallidum possono crescere a ritmi diversi. I ceppi del gruppo SS14 di T. pallidum tendono ad avere tempi di raddoppio più lenti rispetto a quelli del gruppo di Nichols17.
L'alimentazione delle colture può prolungare il tempo di coltura di diversi giorni, ma lo strato cellulare Sf1Ep spesso fallisce dopo una settimana di coltura. Inoltre, i treponemici raggiungono un limite superiore di organismi di circa 5 x 107/mL. Le colture trasferite a intervalli di 7 giorni in genere continuano la moltiplicazione logaritmica con una fase di ritardo minima o nulla. Gli organismi in fase stazionaria spesso diventano difficili da trasmettere.
La maggior parte dei T. pallidum sono attaccati alle cellule Sf1Ep. Tuttavia, nel surnatante rimane una quantità sufficiente di T. pallidum che i campioni di terreno possono essere rimossi periodicamente per verificarne la vitalità e la moltiplicazione. Se è necessaria un'attenta quantificazione, il volume del terreno rimosso deve essere misurato, il numero di T. pallidum quantificato e il numero totale di organismi rimossi deve essere aggiunto ai conteggi finali al momento del raccolto.
In studi precedenti, l'efficienza di clonazione (numero di colture positive per organismo inoculato) era del 12,5% per 2 T. pallidum inoculati per pozzetto e del 6,7% per 0,5 T. pallidum inoculati perpozzetto 27. Pertanto, è probabile che qualsiasi pozzo positivo rappresenti la crescita di un singolo organismo in uno di questi inoculi. Tuttavia, la clonalità delle popolazioni risultanti deve essere verificata esaminando la coltura per l'omogeneità in siti eterogenei nella coltura madre. Il modo più definitivo per dimostrare che la coltura è isogenica è attraverso il sequenziamento dell'intero genoma27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso della procedura di coltivazione in vitro di T. pallidumin . Questa figura è stata ristampata con il permesso di Edmondson e Norris (2021)19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig02.jpg"> Figura 2: Diagramma del sistema per equilibrare i reagenti di coltura di T. pallidum in un ambiente a basso contenuto di ossigeno. Uno sfiato del barattolo di birra è collegato tramite un giunto a T a una fonte di vuoto (come un aspirapolvere domestico) e a bombole di gas contenenti miscele di gas personalizzate (5% CO2, azoto bilanciato e 1,5% O2, 5% CO2, azoto bilanciato). Un vacuometro in linea misura il vuoto aspirato nel barattolo. Il vuoto viene aspirato nel barattolo a circa -58 kPa. Il barattolo evacuato viene quindi riempito lentamente con le miscele di gas. Il barattolo Brewer viene riempito tre volte con il 5% di CO2, l'azoto bilanciato prima di un'evacuazione finale e riempito con il 95% di N2, il 5% di CO2, l'1,5% di O2. Le colture o i terreni vengono quindi rimossi dal barattolo e trasferiti rapidamente nell'incubatore a basso contenuto di ossigeno. In alternativa, il tubo tra il vaso Brewer e il primo giunto a T può essere bloccato saldamente, il tubo scollegato dal giunto a T e l'intero vaso Brewer può essere trasferito in un incubatore a 34 °C. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Edmondson e Norris (2021)19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig03.jpg"> Figura 3: Curve di crescita di T. pallidum coltivate con cellule Sf1Ep con terreno TpCM-2. Colture parallele triplicate sono state seminate con T. pallidum. Le repliche sono state raccolte in ogni momento; i risultati rappresentano la media + SEM per queste culture. (A) Sono mostrate le variazioni di T. pallidum per coltura e (B) la percentuale di motilità. Questa figura è stata adattata con il permesso di Edmondson et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig04.jpg"> Figura 4: Esempio di passaggio di coltura in vitro di T. pallidum, ceppo di Nichols. Le colture parallele di triplicato sono state seminate con T. pallidum e passate settimanalmente utilizzando una diluizione 1:20. Il grafico a dente di sega mostra il numero di T. pallidum per coltura e il numero trasferito a nuove colture in ogni momento. I risultati rappresentano la media ± SEM per tre repliche biologiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Volume medio e rapporti di semina per recipienti di coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Terreni per la coltivazione di T. pallidum . Tutti i mezzi devono essere sterilizzati con filtro dopo la preparazione. Il terreno Sf1Ep può essere conservato a 4 °C per un massimo di due mesi. TpCM-2 viene in genere prodotto un giorno prima dell'uso. Il mezzo di dissociazione deve essere aliquotato e congelato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Procedure per la coltivazione in vitro di Treponema pallidum, la spirocheta della sifilide

For over a century, Treponema pallidum subsp. pallidum, the spiral-shaped bacterium that causes syphilis, could only be propagated by inoculation and ...

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Preparazione e induzione di colture di Borrelia burgdorferi per la produzione di particelle virali

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Cultivation of Pathogenic Spirochetes to Investigate Skin Infection

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Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

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