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```html
<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C storage</td><td></td><td></td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>0.1% gelatina in acqua</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Unità di filtrazione a 0,2 &micro;m</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>0,5% tripsina-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7,5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>Opzionale: per l'inserimento di FTA in un locus ribosomiale endogena</td></tr><tr><td>Tubi per microcentrifuga da 1,5 e 2 mL, autoclavati</td><td></td><td></td><td>Per trasfezione</td></tr><tr><td>Tubi per microcentrifuga da 1,5, 2 e 5 mL a basso legame proteico</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Piatti per coltura tissutale da 10 cm</td><td></td><td></td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Concentrato di buffer di corsa 10x Tris/glicina/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>Incubatore per coltura tissutale a 37 &deg;C x 2</td><td></td><td></td><td>Per coltura cellulare. Uno di questi serve come incubatore principale per la coltura cellulare e l'illuminazione delle cellule trasfettate. È necessario spazio temporaneo in un secondo incubatore il giorno dell'attivazione di ALIBi per ospitare le cellule trasfettate durante la configurazione del transilluminatore nell'incubatore principale.</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua a 37 &deg;C</td><td></td><td></td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>50 mM biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Buffer Laemmli 6x</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td></td><td></td><td>Per disinfezione</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa</td></tr><tr><td>Kit proteasi AcTEV</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Plasmidi C-fragment ALIBi</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>È richiesto il midi-prep per la trasfezione</td></tr><tr><td>Plasmidi N-fragment ALIBi</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>È richiesto il midi-prep per la trasfezione</td></tr><tr><td>Carta stagnola</td><td></td><td></td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>bicarbonato di ammonio</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa</td></tr><tr><td>anticorpo anti-FLAG</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo secondario anti-mouse</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo secondario anti-rabbit</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Rpl12</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Rpl31</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Rpl5</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>anticorpo anti-V5</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>Apirase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Transilluminatore a luce blu</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (piccolo) o DR196 (grande)</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>Punta C18 (punte OMIX C18)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa</td></tr><tr><td>Contenitore per congelamento cellulare</td><td></td><td></td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Centrifugatrice adatta per tubi conici da 15 mL e/o 50 mL</td><td></td><td></td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Centrifugatrice per tubi per microcentrifuga da 1,5-2 mL</td><td></td><td></td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità. Dovrebbe essere in grado di essere refrigerato fino a 4 C e velocità fino a 17.000 g. Idealmente, si trova in una stanza che può essere temporaneamente oscurata durante il trasferimento di tubi dentro e fuori.</td></tr><tr><td>Kit Clarity ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>Vaschetta gel Criterion</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>Gel pre-cast Criterion TGX, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>Per Western blot. Sono disponibili dimensioni e layout di pozzetti aggiuntivi</td></tr><tr><td>Cicloesimide</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Deossicolato</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>Per lisi &amp; purificazione per affinità</td></tr><tr><td>Dittiotreitolo</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>FBS qualificato ES</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-009-B</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Gold Shield</td><td>412828</td><td>Per Western blot</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>MilliporeSigma</td><td>459828</td><td>Opzionale: per la preparazione del campione per spettrometria di massa</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>MilliporeSigma</td><td>A117</td><td>Opzionale: per

isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis buffer, and wash buffers. Using a pipette, mix buffers containing dense or viscous components to ensure even mixing. Chill the prepared buffers on ice before use.Re-suspend the stock bottle of streptavidin beads by gentle pipetting or rocking. Transfer 450 microliters of beads into a protein low binding tube for each 10 centimeter plate of cells. Place the re-suspended beads on the magnetic rack for one minute, or until the beads have fully migrated.Aspirate and discard the bead storage buffer without touching the bead pellet. Wash the beads two times with 900 microliters of RNAs removal buffer. Wash the beads once with 900 microliters of salt wash.Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer. Store the beads in the wash I buffer at four degrees Celsius while performing activation and cell lysis. Add biotin and CHX to the warmed aliquot of media and keep at 37 degrees Celsius until use.Add CHX to the cold DPBS aliquot and keep it chilled until use. Aspirate the media from the transfected plates. Immediately add 10 milliliters of warm media containing CHX with or without Biotin to each plate.Place negative control plates in a dark incubator. Place the remaining plates directly on top of the transilluminator. Turn on the transilluminator and incubate the plates for 15 minutes.Wash each plate two times with the 10 milliliters of cold DPBS containing CHX. Place the plates on ice between and after washes. After aspirating the second wash, tilt the plate and aspirate any residual DPBS.Keeping the plate flat on ice, add two milliliters of ice-cold lysis buffer and incubate the plate on ice for five minutes. Tap the plate two to three times during incubation to dislodge cells. Using a micropipette, pipette the lysate up and down across the plate surface to dislodge any remaining cells.Transfer the lysate to a chilled labeled protein low binding tube. In difficult to lyse organelles, sonicate all samples for 45 seconds at four degrees Celsius. And if required, transfer the lysate into a larger tube before sonication.Transfer the sonicated lysate into a two-milliliter tube. Incubate the lysate on ice for 15 minutes. Centrifuge the lysate at 17, 000 G for three minutes at four degrees Celsius.Transfer the supernatant into a chilled protein low binding tube without disturbing the pellet. Using a magnetic rack, pellet the washed strepped avident beads. Aspirate the wash one buffer.Transfer 1, 200 microliters of clarified lysate to the tube containing the washed beads. Pipette up and down gently to re-suspend the beads. Store the remaining clarified lysate at minus 80 degrees Celsius.Incubate the lysate with the beads at four degrees Celsius in the dark on a tube rotator for one hour. During the incubation, prepare the Tobacco Etch Virus, or TEV elution buffer. Pellet the beads on a magnetic rack.Transfer the supernatant to a chilled protein low binding tube. Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius. Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer and once with 900 microliters of wash II buffer.Add 450 microliters of TEV elution buffer to the beads. Incubate the beads in TEV elution buffer for one hour at room temperature on a tube rotator. Pellet the beads on the magnetic rack.Transfer the elute to a protein low binding tube. Store the eluate at minus 80 degrees Celsius if proteomics analysis or Western blot is intended. Cells containing all system components showed a L31-FTA band, which was stronger with full length burray and faint or absent when components were omitted.Endogenous biotinilated carboxylase proteins were detected in all lysates at 70 to 80 kilodaltons and 120 to 130 kilodaltons. ANTV5 probing confirmed expression of the split bore fragments. Biotinillated L31FTA decreased in the flow through relative to the lysate.No biotinillated L31-FTA was present in the eluate following TEV-mediated elution. Anti-flag probing showed a cleaved L31-FTA band at a lower molecular weight than intact L31-FTA ribosomal protein. S12 probing demonstrated the presence of the small ribosomal subunit in the eluate.Anti-V5 probing showed that proteins that do not bind the ribosome were absent from the eluate. When 2.5 fold more lysate was used with the same 450 microliters of streptavidin coated beads, a substantial amount of biotinilated L31-FTA remained in the flow through. Endogenous biotinilated proteins were partially depleted in the flow through.Endogenous biotinillated proteins were absent from the eluet, but were recovered after heating post-dilution beads in lambly buffer. Anti-flag probing detected cleaved L31-FTA at a lower molecular weight than intact L31-FTA. Anti-V5 probing showed that the split burray fragments were absent from the eluate.ALIBi enables the identification of ribosome-bound proteins and mRNAs in specific subcellular regions, revealing differences in translation regulation. The key challenge is maintaining specific proximity labeling through careful control of targeting construct expression and illumination conditions. Following this protocol, affinity purified ribosomes and associated mRNAs can be analyzed using quantitative proteomic and transcriptomic approaches.

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Biologia

Un ostacolo importante per le analisi biochimiche dei ribosomi contenente nascente peptidil-tRNA è stata la presenza di ribosomi altri nei medesimi campioni, i ribosomi non coinvolti nella traduzione della sequenza di mRNA specifico oggetto di analisi. Abbiamo sviluppato una metodologia semplice per purificare, esclusivamente, i ribosomi contenente il nascente peptidil-tRNA di interesse.

Isolamento dei ribosomi Tradurre contenenti peptidil-tRNA per le analisi funzionali e strutturali

Una tecnica per identificare i siti di pausa traslabile su mRNA viene descritto. Questa procedura è basata su isolamento di polipeptidi nascenti accumulano sui ribosomi durante traduzione in vitro di un mRNA bersaglio, seguita dall'analisi dimensione delle catene nascenti elettroforesi utilizzando un gel denaturante.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

Descriviamo qui una tecnica che viene ora utilizzato di routine per isolare complessi ribosoma stabilmente legati a catena nascente (RNC). Questa tecnica sfrutta la scoperta che un 17 aminoacidi lungo "sequenza di arresto" SECM può fermare l'allungamento traduzione in un procariota...

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati ​​dalla Nef e trasfezione di proteine ​​sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.

Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Questo protocollo illustra le modifiche essenziali della polyribosome frazionamento, al fine di studiare la translatome di vivo campioni SNC in. Permette valutazione globale della regolamentazione traduzione e trascrizione attraverso l'isolamento e il confronto di RNA totale di ribosoma frazioni di RNA legati.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Qui, descriviamo l'immunoprecipitazioni dei ribosomi e dell'RNA associato da popolazioni selezionate di cellule germinali maschili adulte utilizzando il sistema RiboTag. L'allevamento strategico e un'attenta immunoprecipitazioni si traducono in risultati puliti e riproducibili che informano sul translatoma delle cellule germinali e forniscono informazioni sui meccanismi dei fenotipi mutanti.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

Il trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola è un metodo che traccia la dinamica del tRNA durante la sintesi proteica ribosomiale. Tracciando i singoli ribosomi, vengono identificate popolazioni disomogenee, che fanno luce sui meccanismi. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare i cambiamenti conformazionali biologici in generale per rivelare relazioni dinamico-funzionali in molti altri biosistemi complessi. I metodi a singola molecola possono osservare passaggi non...

Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma

Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle modifiche della catena nascente, nel targeting, nella piegatura e nei percorsi di assemblaggio. Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo per l'analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

Presentiamo un protocollo in due fasi per l'isolamento dei mitocondri di alta qualità che è compatibile con la scoperta e la quantificazione delle proteine su scala proteoma. Il nostro protocollo non richiede ingegneria genetica ed è quindi adatto per studiare i mitocondri da qualsiasi cellula e tessuto primario.

Isolamento dei mitocondri senza tag in due fasi per migliorare la scoperta e la quantificazione delle proteine

Stanford School of Medicine.  La Biotinilazione potenziata per illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi) è un nuovo metodo optogeneticamente attivato sviluppato per il marcatore e la purificazione di affinità delle popolazioni subcellulari di ribosomi per sequenziamento a valle e analisi proteomiche.

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

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