Name: Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Scopri un metodo automatizzato ad alto rendimento per isolare cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) da buffy coats. Questa tecnica migliora l'efficienza della biobanca mantenendo un'elevata vitalità cellulare.

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La NSW Health Statewide Biobank riconosce con gratitudine il sostegno di NSW Health Pathology, dell'Ufficio per la salute e la ricerca medica del NSW e del Sydney Local Health District. Inoltre, gli autori ringraziano Omico e altri studi di ricerca supportati dalla NSW Health Statewide Biobank per aver concesso il permesso di pubblicare dati generati internamente e di utilizzare campioni inutilizzati per scopi di ricerca. Gli autori ringraziano la professoressa Jennifer Bryne (NSW Health Pathology, Università di Sydney) per la leadership critica e le discussioni. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

I campioni di sangue per il controllo di qualità e i dati generati internamente (come la conta cellulare, la vitalità e l'età del campione al momento dell'elaborazione) sono stati ottenuti da studi di ricerca autorizzati presso la NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (approvazione HREC: 2019/ETH06776). In provette EDTA sono stati raccolti campioni di sangue umano adulto processati (cioè impoveriti di plasma), non sottoposti a screening e de-identificati. Questi campioni di sangue per il controllo di qualità sono stati elaborati meno di 72 ore dopo la raccolta e sono stati utilizzati per esperimenti di isolamento PBMC confrontando il gradiente di densità e i metodi basati su microsfere. Per il metodo di separazione del gradiente di densità utilizzato nei risultati rappresentativi, vedere la procedura nel File supplementare 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione del sangue intero
<ol><li>Capovolgere delicatamente 10 mL di provette di sangue intero (rivestite con acido etilendiamminotetraacetico [EDTA], acido-citrato-destrosio [ACD] o litio eparina) 10 volte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Opzionale: se il sangue intero deve essere conservato, aliquotarlo in provette criogeniche per una conservazione a -80 °C.</li>
	<li>Centrifugare le provette con rotore a secchiello oscillante a 800 x g per 10 minuti a 22 °C con il freno inserito (9 accelerazioni/ 9 decelerazioni).</li>
</ol>2. Collezione di cappotti Buffy
<ol><li>Dopo la centrifugazione, collocare i campioni in una cabina di sicurezza biologica e verificare la presenza dei tre strati distinti (come mostrato nella Figura 1). NOTA: I globuli rossi si trovano nello strato inferiore rosso scuro della provetta da centrifuga. Uno strato bianco opaco contenente globuli bianchi e piastrine si trova sopra lo strato di globuli rossi, noto come buffy coat. Lo strato giallo superiore contiene plasma.</li>
	<li>Opzionale: se il plasma deve essere conservato, aliquotare il plasma in provette criogeniche per la conservazione a -80 °C.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di buffy coat (materiale di partenza) da una provetta di sangue da 10 mL e trasferirla nella provetta specificata ed etichettata nei passaggi 3.1 e 4.1 rispettivamente per i metodi manuale e automatizzato. Agitare il buffy coat (strato bianco opaco) utilizzando la punta della pipetta e raccogliere il buffy coat aspirando. NOTA: Durante l'aspirazione sono accettabili meno di 100 μL di plasma e globuli rossi. Se vengono raccolte più provette di sangue per un partecipante, i buffy coat possono essere raggruppati; Tuttavia, ciò può influire sulla concentrazione piastrinica13.</li>
	<li>Per l'elaborazione manuale, passare alla sezione 3. Per l'elaborazione automatizzata, passare alla sezione 4.</li>
	<li>Opzionale: se i globuli rossi devono essere conservati, aliquotare i globuli rossi in provette criogeniche per la conservazione a -80 °C.</li>
</ol>3. Purificazione PBMC - Metodo manuale
NOTA: Un singolo operatore può elaborare fino a 8 campioni per supporto magnetico.
<ol><li>Etichettare 3 provette di polistirolo da 5 ml con le lettere A-C. NOTA: Utilizzare la numerazione sequenziale se si esegue più di un campione, ad esempio 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Aggiungere 60 μl di EDTA 0,1 M (per una concentrazione finale di EDTA di 6 mM, pH 8,0, vedere il file supplementare 2 per la ricetta) alla provetta A contenente il buffy coat trasferito nella fase 2.3.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl della provetta per cocktail (vedere la Tabella dei materiali) alla provetta A, miscelare pipettando su e giù almeno 3 volte e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 890 μl di PBS alla provetta A e mescolare pipettando su e giù almeno 3 volte.</li>
	<li>Agitare il tubo della perlina magnetica (vedi Tabella dei materiali) per 30 s.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di biglie magnetiche alla provetta A e mescolare pipettando su e giù almeno 3 volte.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la provetta A nel supporto magnetico e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita nella provetta B, raccogliendo la frazione chiara con globuli rossi nulli/minimi (<100 μl) per un recupero ottimale della PBMC. NOTA: Non disturbare le perline legate al magnete. Si consiglia una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Rimuovere il tubo A dal supporto magnetico e smaltirlo.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di microsfere magnetiche alla sospensione cellulare nella provetta B e mescolare pipettando su e giù almeno 3 volte.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la provetta B nel supporto magnetico e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita nella provetta C, raccogliendo solo la frazione chiara. NOTA: Non disturbare le perline legate al magnete. Si consiglia una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Rimuovere il tubo B dal supporto magnetico e smaltirlo.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la provetta C nel supporto magnetico e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita in una provetta da centrifuga marcata e rabboccare fino a 2 mL con PBS.</li>
	<li>Trasferire 50 μl della sospensione cellulare in una tazza per campioni del contatore di cellule automatizzato. Per una conta delle cellule di diluizione 1:10, aggiungere 450 μL di PBS. Procedere alla sezione 5 per le fasi di conteggio delle cellule.</li>
</ol>4. Purificazione PBMC - Metodo automatizzato
NOTA: È possibile elaborare fino a 4 campioni da un singolo strumento PBMC automatizzato. Più strumenti possono essere eseguiti in parallelo da un singolo operatore.
<ol><li>Etichettare 2 provette da 14 ml con le lettere A e B, 1 provetta da centrifuga da 50 ml con la lettera C e 1 provetta da centrifuga da 50 ml con la dicitura "scarto". NOTA: È necessario un solo contenitore per i rifiuti per ogni seduta sullo strumento PBMC automatizzato. Utilizzare la numerazione sequenziale se si esegue più di un campione, ad esempio 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Aggiungere 60 μl di EDTA 0,1 M (per una concentrazione finale di EDTA di 6 mM) alla provetta A contenente il buffy coat trasferito nella fase 2.3.</li>
	<li>Agitare il tubo a perline magnetiche (vedi Tabella dei materiali)  per 30 s.</li>
	<li>Accendere lo strumento PBMC automatizzato accendendo l'alimentazione nella parte anteriore dello strumento.</li>
	<li>Nella schermata iniziale dello strumento PBMC automatizzato , selezionare profile e selezionare il protocollo desiderato. NOTA: EasySep Direct Human PBMC isolation 19654 - buffy coat è stato il profilo di protocollo selezionato per questo isolamento PBMC. Vedere la procedura standard del produttore per questo profilo nel rapporto di protocollo14.</li>
	<li>Inserire il volume iniziale (la quantità di buffy coat aspirata nella provetta A) e ripetere per ogni campione.</li>
	<li>Selezionare tutti i quadranti che utilizzeranno lo stesso kit di reagenti. NOTA: Se lo stesso protocollo viene utilizzato per più di un quadrante, lo strumento PBMC automatizzato suggerirà di utilizzare lo stesso kit di reagenti per tutti i quadranti14.</li>
	<li>Caricare il carosello dello strumento con i materiali di consumo etichettati, i puntali del filtro e il contenitore del tampone. Il kit di reagenti contenente la provetta magnetica e la provetta per cocktail deve essere caricato nel quadrante 1. NOTA: Lo strumento chiederà se l'utente desidera utilizzare 1 kit di reagenti per tutti i quadranti. Seleziona "sì" ed evidenzia tutti i quadranti utilizzando il kit di reagenti.</li>
	<li>Una volta completato il caricamento, rimuovere i coperchi dai materiali di consumo e dai reagenti e selezionare Esegui sullo schermo dello strumento.</li>
	<li>Al termine della seduta , selezionare scarica e rimuovi i campioni (contenenti la sospensione PBMC etichettata nel tubo C) dal carosello dello strumento. Conservare il tubo magnetico per perline, il tubo per cocktail e il contenitore tampone a 4 °C. Eliminare i tubi etichettati come A, B e i rifiuti (vedere il passaggio 4.1) e i puntali del filtro. NOTA: Per il metodo automatizzato non è necessario alcun rabbocco con PBS, poiché la sospensione di PBMC produce un volume finale di 7 mL.</li>
	<li>Trasferire 500 μl di cellule in una coppa per campioni per una conta cellulare senza diluizione. Procedere alla sezione 5 per il conteggio delle cellule.</li>
</ol>5. Conteggio delle cellule
<ol><li>Eseguire il conteggio delle cellule e la vitalità utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano seguendo le istruzioni del produttore15. NOTA: Per i processi interni dell'autore, l'analisi delle cellule viene eseguita utilizzando un contatore di celle automatizzato con le seguenti impostazioni per acquisire le PBMC. Fattore di diluizione = 10 (per il protocollo manuale, se la sospensione cellulare è in un volume basso) o 1 (per il protocollo automatizzato) Tipo di cella: PBMC Intervallo di concentrazione = da 5 x 104 a 1 x 107 cellule/mL Intervallo dimensionale (diametro) = da 8 μm a 50 μm Numero di immagini = 50</li>
</ol>6. Preparazione alla crioconservazione
<ol><li>Centrifugare (utilizzando un rotore a secchiello oscillante) le provette del campione a 300 x g per 8 minuti a 22 °C con il freno inserito (9 accelerazione/ 9 decelerazione).</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, riposizionare i campioni nella cabina di sicurezza biologica.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere con cautela il surnatante. Una piccola quantità di surnatante può essere lasciata con il pellet PBMC per assicurarsi che non venga disturbato.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 3 mL di terreno di crioconservazione freddo. Mescolare lentamente e delicatamente la sospensione su e giù fino a renderla omogenea. NOTA: Il volume del terreno di ciroconservazione può essere regolato in base alla concentrazione finale di PBMC desiderata.</li>
	<li>Erogare 1 mL di PBMC risospeso in una crioprovetta preassegnata e posizionarlo all'interno di un contenitore di congelamento a velocità di controllo per un minimo di 4 ore a -80 °C. NOTA: Il volume di PBMC aliquotato in ciascuna crioprovetta può essere regolato in base alle preferenze dello sperimentatore.</li>
	<li>Dopo aver conservato le crioprovette a -80 °C per un minimo di 4 ore, trasferire le crioprovette in un serbatoio in fase di vapore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>7. Analisi statistica dei dati
<ol><li>I dati rappresentativi dei risultati sono stati analizzati utilizzando software statistici e grafici come specificato nel File supplementare 3.</li>
</ol>

Isolamento di PBMC ad alto rendimento mediante biglie immunomagnetiche

<ol><li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+A+review+of+recent+proteomic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026(2022).</li>
<li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48(2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li>
<li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li>
<li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMC%29+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li>
<li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).</li>
<li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371(2019).</li>
<li> Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vol.+27156%5BTitle%5D)+AND+%22STEMCELL+TECHNOLOGIES%22%5BJournal%5D)">Vol. 27156.</a> STEMCELL TECHNOLOGIES. , 1-4 (2020).</li>
<li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583(2022).</li>
<li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045(2017).</li>
<li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates%3A+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li>
<li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Stemcell Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022).</li>
<li>Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use. Beckman Coulter. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017).</li>
<li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biobanking%3A+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li>
<li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology%2C+white+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls+Publishing%22%5BJournal%5D)">Histology, white blood cell.</a> StatPearls Publishing. , (2024).</li>
<li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+buffy+coat+extract+on%3A+Methodology%2C+feasibility%2C+optimization%2C+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li>
<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield%2C+but+severly+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
<li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514(2023).</li>
<li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+processing+of+blood+increases+the+frequency+of+activated+CD11b%2B+CD15%2B+granulocytes+which+inhibit+t-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function.</a> J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+t-cell+responses%3A+Position+statement+of+the+t-cell+workshop+committee+of+the+immunology+of+diabetes+society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society.</a> Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).</li>
<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Le PBMC umane sono tipi cellulari versatili utilizzati per numerosi saggi; Tuttavia, la produttività dell'isolamento è spesso un limite in molti laboratori, comprese le biobanche16. In precedenza, la NSW Health Statewide Biobank ha isolato le PBMC utilizzando il metodo del gradiente di densità. L'automazione è stata studiata per il metodo di separazione a gradiente di densità per aumentare la capacità di elaborazione, ma sono stati identificati ostacoli all'implementazione, tra cui (i) il costo di un gestore di liquidi con un'unità di centrifugazione completamente automatizzata, con l'aggiunta del requisito di un'unità HEPA per produrre un prodotto sterile, (ii) personale addestrato per la programmazione e (iii) tempo necessario per i test del protocollo. Pertanto, questo studio ha esplorato metodi alternativi e ha identificato il kit PBMC umano ottenuto commercialmente che potrebbe essere utilizzato per l'elaborazione manuale e automatizzata. La sterilità è garantita in quanto l'attrezzatura necessaria per la lavorazione si inserisce all'interno di una cabina di sicurezza biologica standard (lunghezza di 1,2 m). Questo documento descrive in dettaglio le modifiche apportate al protocollo14 raccomandato dal produttore, per aumentare l'efficienza e ridurre i costi dei reagenti senza sacrificare la qualità. Inoltre, il protocollo del produttore è stato esteso per dettagliare i passaggi dei campioni della biobanca per la ricerca futura, tra cui il sangue intero (fase 1.2), il plasma (fase 2.2) e i globuli rossi (fase 2.5) che vengono aliquotati dalla provetta di sangue originale, nonché il conteggio delle cellule e la crioconservazione.
In questo studio, sono stati confrontati tre protocolli di isolamento PBMC: separazione del gradiente di densità, isolamento manuale e automatizzato basato su perline. Sono state apportate modifiche al protocollo manuale basato su microsfere del produttore, tra cui la rimozione della diluizione del buffy coat prima dell'isolamento della PBMC e l'eliminazione della necessità di interruzione per le centrifugazioni, consentendo ai ricercatori di seguire un protocollo di isolamento PBMC adattabile, economico e ad alto rendimento. In primo luogo, sono stati utilizzati otto campioni di sangue intero abbinati per isolare le PBMC per confrontare la separazione in gradiente di densità e la tecnica manuale basata su microsfere. È importante sottolineare che le distribuzioni della popolazione cellulare, la vitalità cellulare e il recupero delle PBMC non erano significativamente diversi tra i due metodi confrontati, come mostrato rispettivamente nella Figura 2A-F, nella Figura 3A e nella Figura 1 supplementare. Nei dati rappresentativi, la conta cellulare era più alta per il metodo di separazione in gradiente di densità utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano, ma non quando è stato utilizzato un analizzatore cellulare ematologico. Le impostazioni del tipo di cellula PBMC sul contatore di cellule utilizzavano un intervallo di diametro cellulare di 8-50 μm e, pertanto, i conteggi includeranno PBMC e granulociti (circa 12-15 μm di diametro) quando si utilizza il metodo di esclusione del blu di tripano17. Sebbene il contatore di cellule ematologiche offrisse una specificità più elevata rispetto al metodo di esclusione del blu di tripano, alcuni calcoli di recupero erano superiori al 100%, riflettendo il margine di errore dello strumento (vedere la Figura 1 supplementare). Si raccomanda pertanto agli investigatori di applicare una combinazione di tecniche di conteggio cellulare quando confrontano i rendimenti dei protocolli di isolamento PBMC, poiché la maggior parte delle tecniche non offre conteggi cellulari differenziali sia specifici che altamente sensibili. Inoltre, non sono stati eseguiti saggi per confrontare l'attività funzionale delle PBMC prodotte da entrambe le tecniche, il che è una limitazione della nostra analisi.
Successivamente, sono stati confrontati i metodi manuali e automatizzati basati su perline e non sono state identificate differenze significative tra la resa o la vitalità della PBMC da 8 campioni abbinati (Figura 4A, B). Le popolazioni cellulari non sono state confrontate individualmente, poiché per entrambi i metodi è stato utilizzato lo stesso cocktail di isolamento anticorpale. È importante sottolineare che il tempo di elaborazione manuale di 8 campioni è stato ridotto da 43 minuti a 22 minuti utilizzando il protocollo automatizzato (Figura 4C). Mentre la produttività, la prevenzione del burnout dei tecnici e la coerenza dell'elaborazione dei campioni sono garantite dall'automazione, il costo dei reagenti e dei materiali di consumo è significativamente più elevato, 3-4 volte superiore rispetto al metodo manuale basato su microsfere. Questo dopo aver apportato modifiche al protocollo del produttore per utilizzare 1 mL di buffy coat (da un volume di sangue intero di 10 mL) invece dell'intervallo raccomandato di 2-5 mL (da un volume di sangue intero di 10 mL e/o superiore). Se il budget è un limite, optare per il metodo manuale può ridurre i tempi di lavorazione del ~25%, mantenendo i costi dei reagenti e dei materiali di consumo paragonabili a quelli del metodo di separazione per densità. Si consiglia di elaborare non più di 8 campioni alla volta per tecnico per garantire un adeguato scaglionamento dei campioni (~30 s/campione) entro i periodi di incubazione di 5 minuti (passaggi 3.7, 3.11 e 3.14).
Sia nei metodi manuali che in quelli automatizzati basati su microsfere, la rimozione del buffy coat è un passaggio fondamentale per garantire un isolamento ottimale della PBMC. È importante notare che in questo protocollo viene utilizzato un buffy coat piuttosto che sangue intero poiché il volume dei reagenti si basa sui volumi del materiale di partenza10. Rimuovere efficacemente l'intero volume del buffy coat può essere tecnicamente impegnativo. Inizialmente, questo metodo prevedeva la rimozione di 0,5 ml di buffy coat, ma è stato aumentato a 1 ml per migliorare il recupero. Per garantire un recupero adeguato e coerente del buffy coat, la descrizione dettagliata di questo processo è importante nella documentazione del protocollo e nella formazione. Si raccomanda di agitare il puntale di una pipetta durante l'aspirazione del buffy coat, facendo attenzione a non aspirare troppi globuli rossi dallo strato sottostante (passaggio 2.3). È importante non saturare il cocktail di anticorpi che lega le cellule indesiderate (cioè i granulociti e i globuli rossi), che possono influire sulla resa e sulla purezza10. Per ridurre al minimo i globuli rossi raccolti durante l'estrazione del buffy coat, la punta della pipetta deve trovarsi tra il plasma e lo strato di buffy coat. Il volume del buffy coat può essere aumentato da 1 mL; tuttavia, è necessario prestare attenzione come descritto sopra per garantire che non più del 10% del volume raccolto contenga globuli rossi. In alternativa, è possibile utilizzare un manipolatore automatico di liquidi per raccogliere i buffy coat in modo coerente18. Tuttavia, le ore dedicate necessarie per calibrare e risolvere i problemi relativi ai protocolli degli strumenti per la manipolazione dei liquidi, soprattutto considerando la spesa, potrebbero non essere fattibili per la maggior parte dei laboratori.
La transizione e l'applicazione del protocollo basato su microsfere di automazione è stata essenziale dato l'obiettivo della NSW Health Statewide Biobank di elaborare 23.000 PBMC nei prossimi 3 anni. Qui, è stato dimostrato che le PBMC possono essere isolate da provette ACD fino a 9 giorni dalla raccolta con vitalità medie >70%. Sebbene le rese siano state ottimali 24 ore dopo la raccolta, l'elaborazione entro questo lasso di tempo non è sempre fattibile in quanto potrebbe essere necessario trasportare i campioni. È stato dimostrato che le PBMC isolate con il metodo manuale o automatizzato basato su microsfere possono avere rese di >3 x 105 cellule/mL di sangue intero se isolate entro 4 giorni dalla raccolta e di >1 x 105 cellule/mL di sangue intero se isolate entro 10 giorni dalla raccolta. Numeri bassi per campioni superiori a 5 giorni sono considerati una limitazione di questa analisi. Inoltre, i dati non sono stati separati in base all'età, al sesso e alla storia clinica dei partecipanti, poiché queste informazioni non sono state rese disponibili. Sebbene sia necessaria un'analisi comparativa per esaminare gli effetti dei ritardi nei tempi di elaborazione per entrambi i metodi, è stato precedentemente riportato che i ritardi nell'isolamento delle PBMC utilizzando il metodo del gradiente di densità riducono la qualità delle cellule e aumentano significativamente la contaminazione da globuli rossi19,20. Inoltre, le proporzioni dei granulociti aumentano se l'elaborazione viene ritardata e, quindi, i campioni di "età" simili dovrebbero essere raggruppati per le analisi a valle 20,21,22. Da notare che questo esperimento è stato eseguito utilizzando sangue anticoagulato con destrosio citrico acido (cioè citrato trisodico, acido citrico e destrosio); tuttavia, la resa e/o la proporzione dei tipi di cellule possono variare se vengono utilizzati altri anticoagulanti23; pertanto, si consiglia agli investigatori di scegliere un anticoagulante appropriato in base alle analisi PBMC a valle previste.
In sintesi, un protocollo per l'isolamento di PBMC che utilizza biglie magnetiche adattabile a flussi di lavoro ad alta produttività è dettagliato per soddisfare i requisiti di scalabilità senza compromettere la vitalità cellulare. Sia il metodo manuale che quello automatizzato possono essere ottimizzati per produrre concentrazioni cellulari specifiche modificando i volumi di avviamento e di risospensione. La NSW Health Statewide Biobank è passata dall'estrazione di ~60 PBMC al mese utilizzando la tradizionale tecnica di separazione a gradiente di densità a ~300 PBMC al mese utilizzando questo metodo basato su microsfere compatibile con l'automazione. Il prossimo obiettivo degli autori è quello di utilizzare la piattaforma automatizzata per elaborare fino a 1200 PBMC al mese e confrontare ulteriormente le PBMC isolate sia con tecniche basate su biglie magnetiche (manuali e automatizzate) che con tecniche di gradiente di densità per guidare l'implementazione di questa tecnica in altri laboratori con particolare attenzione alle biobanche.

L'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è una tecnica che separa e isola i linfociti e i monociti da altri costituenti del sangue intero. Le PBMC sono un tipo di cellula versatile utilizzato per numerose applicazioni, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'immunoterapia, lo sviluppo di vaccini, l'identificazione di bersagli o biomarcatori e lo sviluppo di farmaci anticorpi/piccole molecole 1,2. Queste cellule possono essere isolate da individui sani o malati e possono essere utilizzate immediatamente nei processi a valle o crioconservate per ricerche future3. In alcuni casi, lo scopo a valle è noto, mentre in altri, come è comune nel biobanking, le PBMC vengono isolate e conservateper future applicazioni non specificate.
La centrifugazione in gradiente di densità è la tecnica tradizionale per isolare le PBMC 5,6,7 dal sangue intero, utilizzando la separazione differenziale dei tipi di cellule costituenti in base alla densità cellulare durante la centrifugazione. Sebbene ci possano essere alcune variazioni in questo metodo, il sangue intero viene generalmente diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), stratificato su un mezzo a gradiente di densità in una provetta da centrifuga specializzata o standard e quindi filato. Ne risultano quattro strati distinti: lo strato superiore del plasma è arricchito con piastrine, un sottile strato di PBMC è al di sopra del mezzo del gradiente di densità e, infine, lo strato inferiore è costituito da globuli rossi (RBC) e granulociti. Sebbene questo metodo sia stato precedentemente definito "il gold standard"8, ci sono limitazioni per lo scale-up, come il lungo tempo di elaborazione, la capacità della centrifuga, la difficoltà di aliquotare altri prodotti sanguigni (ad esempio, plasma e globuli rossi) e la laboriosità dell'automazione. Sebbene l'automazione sia possibile per questo metodo9, richiede una programmazione completa di un gestore di liquidi (con un modulo di centrifugazione completamente automatizzato) e rimarrebbe un processo lungo.
D'ora in poi, viene presentato un flusso di lavoro alternativo che utilizza la separazione di microsfere immunomagnetiche con un magnete a otto supporti per l'elaborazione manuale o uno strumento per l'elaborazione completamente automatizzata. Questo metodo utilizza un cocktail di anticorpi che viene aggiunto alle cellule e lega le popolazioni cellulari indesiderate, in questo caso piastrine, granulociti e globuli rossi. Queste popolazioni indesiderate vengono successivamente rimosse mediante separazione magnetica, lasciando le popolazioni di monociti e linfociti nella frazione negativa che sono pronte per l'elaborazione a valle10. Questo metodo di selezione negativa è più veloce dei metodi di selezione positiva che richiedono passaggi aggiuntivi per rimuovere l'anticorpo e il complesso di biglie magnetiche dalle PBMC. La selezione negativa è inoltre vantaggiosa in quanto è stata descritta come un modo per preservare la funzionalità cellulare11,12.

<table><tbody><tr><td>Terreno di crioconservazione cellulare CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td><td>StemCellTM Tecnologie</td><td>07930</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica di classe II</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>51033311</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 1 mL FX</td><td>BioTools</td><td>BCS-407P</td><td>Questo è il contenitore di congelamento del tasso di controllo utilizzato.</td></tr><tr><td>Acqua distillata&nbsp;</td><td>Bacto Laboratories</td><td>561832</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore ematologico DxH 500</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B40601</td><td>Indicato come contatore di celle automatizzato esterno.</td></tr><tr><td>EasyEightsTM EasySepTM Magnete</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>EasySepTM Kit di isolamento diretto per PBMC umano</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>19654</td><td>Il kit include il tubo a perline magnetiche e il tubo per cocktail</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>E6758-500G</td><td>Le istruzioni per preparare una soluzione EDTA 0.1M dal sale EDTA si trovano nel file supplementare 2.</td></tr><tr><td>LymphoprepTM Gradiente di densità Medio</td><td>Stem CellTM Technologies</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge ST4 Plus Centrifuga</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>THR75009903</td><td></td></tr><tr><td>Orion Star A211 Elettrodo pHmetro</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>Orion & commercio; ROSS Ultra&commercio; Triodo di vetro&commercio; Elettrodi combinati pH/ATC</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>8302BNURCA</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), soluzione, 1X, 500ml</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoboSepTM Buffer 1X</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>20104</td><td>Software utilizzato per analisi statistica.</td></tr><tr><td>RoboSepTM-S</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>21000</td><td>Strumento di separazione cellulare completamente automatizzato.</td></tr><tr><td>RoboSep&commercio; Puntali</td><td>filtranti StemCellTM Technologies</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>Provette SepMateTM-50 (IVD)</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>85460</td><td>IVD - Diagnostica in vitro. Conosciuto anche come provette SepMateTM-50</td></tr>, <tr><td>Vi-CELL XR, Anlayzer per celle</td>, <td>Beckman Coulter, Life Sciences</td><td></td><td>, Contatore di celle automatizzato interno. Strumento obsoleto e non più disponibile per l'acquisto (al 31 dicembre 2022). Uno strumento alternativo è l'analizzatore di vitalità cellulare ViCell BLU (prodotto n. C19196).</td></tr><tr><td>Kit di reagenti Vi-CELL XR Confezione quadrupla</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>383722</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da buffy coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono una popolazione eterogenea di monociti e linfociti. Le PBMC crioconservate hanno una vitalità stabile nella conservazione a lungo termine, il che le rende un tipo di cellula ideale per molti scopi di ricerca a valle, tra cui la citometria a flusso, i saggi immunologici e il sequenziamento del genoma. In genere, le PBMC vengono isolate tramite centrifugazione in gradiente di densità, tuttavia si tratta di un flusso di lavoro a basso rendimento che è difficile e costoso da scalare. Questo articolo presenta un flusso di lavoro ad alta produttività utilizzando un metodo di isolamento PBMC basato su biglie magnetiche che è rapido da implementare. Sono state confrontate la concentrazione totale delle cellule, la vitalità e la distribuzione della popolazione con le PBMC ottenute utilizzando l'isolamento del gradiente di densità, e la vitalità cellulare e la proporzione dei tipi di cellule erano comparabili per entrambe le tecniche. Le PBMC isolate hanno dimostrato una vitalità superiore al 70% fino a 9 giorni dopo il prelievo del sangue, sebbene la resa sia diminuita della metà dopo 5 giorni rispetto alle PBMC trattate entro 24 ore dal prelievo. In sintesi, questo articolo descrive un protocollo PBMC che utilizza un approccio basato su microsfere per adattarsi a un flusso di lavoro ad alta produttività e dimostra che sia i metodi manuali che quelli automatizzati basati su perline possono aumentare la capacità di elaborazione e fornire flessibilità per vari budget.

Le proporzioni di linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili e basofili pre- (cioè nel sangue intero) e post-isolamento di PBMC sono state misurate quando le PBMC sono state isolate utilizzando il metodo di separazione a gradiente di densità o basato su microsfere. Le proporzioni di linfociti e monociti sono state significativamente arricchite da entrambi i metodi (Figura 2A, B). Inoltre, le proporzioni di neutrofili, eosinofili e basofili (cioè granulociti) erano significativamente diminuite nelle PBMC isolate con il metodo basato su perline (Figura 2C-F). Non ci sono state differenze significative nelle proporzioni di linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili, basofili e granulociti tra i metodi basati sul gradiente di densità e quelli basati su perline (Figura 2). La percentuale di recupero è stata calcolata in aggiunta per i tipi di cellule sopra elencati (vedi Figura 1 supplementare). La vitalità cellulare media era superiore al 95% per entrambi i metodi e non era significativamente diversa (Figura 3A). Le PBMC sono state contate anche utilizzando un intervallo di dimensioni (diametro) compreso tra 8 μm e 50 μm, mentre il metodo di separazione in gradiente di densità ha prodotto un numero totale di cellule circa due volte superiore (Figura 3B). 
Successivamente, il metodo automatizzato basato su perline è stato confrontato con il metodo manuale. Non sono state identificate differenze significative per la vitalità cellulare (Figura 4A) o la conta cellulare totale (Figura 4B) utilizzando il metodo manuale o automatizzato. È stato confrontato il tempo necessario per elaborare questi 8 campioni, compreso il tempo di non intervento umano che non richiede alcun intervento umano. Il tempo totale di elaborazione di 8 campioni è stato di 43 minuti vs. 57 minuti per il manuale vs. il metodo automatizzato. Il metodo automatizzato includeva 35 minuti di elaborazione a mani libere (Figura 4C).
Il flusso di lavoro basato su microsfere di isolamento di PBMC (con aliquotazione di sangue intero e plasma) è stato testato per 9 mesi, in base al quale 1410 campioni di PBMC sono stati isolati da sangue umano non sottoposto a screening utilizzando la piattaforma manuale per i primi 820 partecipanti e quindi utilizzando il metodo automatizzato per i successivi 590 partecipanti. L'elaborazione è stata eseguita lo stesso giorno o fino a 10 giorni dopo la raccolta secondo i criteri di accettazione dello studio, con ritardi nell'elaborazione in gran parte dovuti ai tempi di transito del campione. Con il metodo manuale o automatizzato, le PBMC elaborate entro 24 ore dalla raccolta hanno avuto la massima vitalità e recupero (Figura 5). La vitalità cellulare media è stata del &gt;90% per le PBMC trattate entro 5 giorni e del &gt;70% per le PBMC trattate entro 10 giorni (Figura 5A). Le rese medie di PBMC sono diminuite del 50% dopo 5 giorni rispetto ai campioni processati entro 24 ore (Figura 5B).
<img alt="Processo di isolamento e crioconservazione delle cellule del sangue; centrifuga, grafico a microsfere magnetiche; stoccaggio cellulare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Flusso di lavoro schematico del protocollo di isolamento PBMC basato su perline da buffy coat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Confronto dell'isolamento delle cellule del sangue; grafici di linfociti, monociti, neutrofili; gradiente di densità, a base di perline." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Proporzioni di linfociti, monociti, neutrofili, eosinofili, basofili e granulociti nel sangue intero prima e dopo l'isolamento di PBMC mediante gradiente di densità e metodi basati su sfere. Percentuale di linfociti (A), monociti (B), neutrofili (C), eosinofili (D), basofili (E) e granulociti (F) nel sangue intero abbinato prima dell'isolamento (quadrati) e nelle PBMC dopo l'isolamento tramite il metodo del gradiente di densità (cerchi aperti) o basato su perline (cerchi chiusi) (n = 8). ns = non significativo e *p &lt; 0,05 come determinato dall'ANOVA unidirezionale (A e B) o dal test di Friedman (C- F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico della vitalità e della conta cellulare; gradiente di densità vs. basato su perline; analisi statistica dei metodi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Vitalità e conta totale delle cellule di PBMC isolate mediante gradiente di densità e metodi basati su microsfere. (A) Vitalità cellulare media (± SD) per campioni processati utilizzando il gradiente di densità (quadrati, barra scura) vs. Metodi basati su perline (cerchi, barra aperta) per 8 campioni accoppiati. ns = non significativo dal test t accoppiato. (B) Conta totale delle cellule per i campioni processati utilizzando il gradiente di densità (quadrati, barra scura) rispetto a Metodi basati su perline (cerchi, barra aperta) per 8 campioni accoppiati. *P &lt; 0,05 determinato utilizzando un test T accoppiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafici della vitalità cellulare e della conta totale delle cellule; metodo blu di tripano; Elaborazione manuale e automatizzata." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Confronto tra metodi manuali e automatizzati basati su microsfere. (A) Vitalità cellulare media (± SD) per campioni trattati manualmente (quadrati, barra scura) rispetto a Metodi automatizzati (cerchi, barra aperta) basati su perline per 8 campioni accoppiati. ns = non significativo secondo il test di Mann-Whitney. (B) Conteggio totale delle cellule per i campioni elaborati utilizzando i manuali (quadrati) vs. Metodi automatizzati (cerchi) basati su perline per 8 campioni accoppiati. ns = non significativo dal test t accoppiato. (C) Tempo di elaborazione per 8 campioni elaborati utilizzando il manuale vs. Metodi automatizzati, inclusi periodi di tempo hands-on (barra luminosa) e hands-off (barra scura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafici di vitalità cellulare e resa; elaborazione manuale vs automatizzata; Tabelle di analisi statistica incluse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Vitalità e resa della PBMC isolata dal metodo basato su microsfere manualmente o utilizzando l'automazione in base al tempo che intercorre tra la raccolta del campione e la conservazione della PBMC. (A) Vitalità cellulare media (± IC 95%) per i campioni partecipanti trattati utilizzando il manuale (barra scura) vs. Metodi automatizzati (barra aperta) basati su perline. Tabella con i numeri dei partecipanti. ns = non significativo. Na = non applicabile. *p &lt; 0,05 secondo il test di confronto multiplo di Tukey. (B) Conta totale delle cellule per i campioni dei partecipanti elaborati utilizzando il manuale (barra scura) rispetto a Metodi automatizzati (barra aperta) basati su perline. Tabella con i numeri dei partecipanti. ns = non significativo. Na = non applicabile. *p &lt; 0,05 secondo il test di confronto multiplo di Tukey. Nessun valore per il giorno 10 automatizzato a causa del numero di replica inferiore a 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Figura del recupero percentuale differenziale delle celle con il gradiente di densità e i metodi basati su perline. La percentuale è stata calcolata utilizzando la conta cellulare assoluta pre-isolamento nel sangue intero e la sospensione cellulare post-isolamento utilizzando il metodo del gradiente di densità (quadrati, barra scura) e il metodo basato su perline (cerchi, barra aperta) (n = 8). ns = non significativo e *p &lt; 0,05 come determinato dal test t non appaiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: Protocollo del gradiente di densità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Preparazione di EDTA 0,1 M, pH 8,0 in PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Procedure dettagliate eseguite per generare i dati rappresentativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo compatibile con l'automazione ad alto rendimento per isolare cellule mononucleate del sangue periferico umano per la biobanca e altri scopi.

Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

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Il video spiega un modo per purificare le cellule B mediante targeting immunomagnetico e separazione dalla sospensione di cellule mononucleate del sangue periferico. Il metodo prevede la marcatura di tipi di cellule indesiderate con anticorpi o ligandi specifici (legati a particelle magnetiche) che hanno come bersaglio specifiche proteine della superficie cellulare, da esaurire dalla sospensione cellulare eterogenea mediante separazione magnetica.

Selezione immunomagnetica negativa: un metodo per purificare le cellule B dalle cellule mononucleate del sangue periferico

In questo video, dimostriamo l'isolamento dei monociti dal sangue umano intero mediante separazione immunomagnetica negativa. I monociti isolati possono essere utilizzati per ulteriori analisi a valle.

Isolamento di monociti da sangue intero mediante selezione immunomagnetica negativa

In questo video, dimostriamo l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, contenenti monociti e linfociti da un buffy coat umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. Le PBMC isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi.

Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico da Buffy Coats umani

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule B dal sangue periferico umano utilizzando anticorpi biotinilati specifici per le cellule non B e microsfere magnetiche coniugate con streptavidina.

Isolamento e purificazione di cellule B da sangue periferico umano

Questo video dimostra una tecnica per generare topi del sistema immunitario umano (HIS). Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) CD34+ sono isolate dalle cellule del buffy coat del sangue del cordone ombelicale umano utilizzando perle magnetiche rivestite di anticorpi. Le HSC CD34+ vengono espanse in un terreno di crescita arricchito con citochine e crioconservate. Infine, le HSC scongelate vengono iniettate in un cucciolo di topo immunodeficiente per stabilire il modello murino HIS.

Isolamento delle cellule staminali ematopoietiche del sangue del cordone ombelicale per generare topi del sistema immunitario umano

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati mediante separazione di biglie magnetiche dalle cellule mononucleate del sangue periferico dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue umano anticoagulato. Dopo un'incubazione di 5 giorni, i monociti umani vengono differenziati in cellule dendritiche immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Presentiamo un semplice protocollo per l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico da sangue intero ottenuto da pazienti con diagnosi di Sindrome di Sézary, seguito dalla selezione di cellule T CD4+, dalla loro stimolazione con phorbol12-myristate13-acetato e A23187 ionoforo, e dalla preparazione dell'RNA per la profilazione trascrittomica.

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico umano e delle cellule T CD4+ da pazienti con sindrome di Sézary per la profilazione trascrittomica

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero, dai cappotti buffy o dalle membrane di leucaferesi, ottenendo una buona resa, un'elevata purezza e un'attivazione cellulare minima. Utilizziamo la purificazione a gradiente, la sedimentazione dei globuli rossi (RBC) e la lisi dei globuli rossi per ottenere una preparazione neutrofila di alta qualità / purezza.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Descriviamo un metodo che combina sfere immunomagnetiche e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per isolare e analizzare sottopopolazioni definite di cellule mononucleate del sangue periferico (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B e cellule natural killer). Utilizzando questo metodo, le cellule magnetiche e fluorescenti possono essere purificate e analizzate.

Separazione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nei campioni di sangue periferico da bambini con mononucleosi infettiva

Questo protocollo presenta una guida accessibile per la raccolta, la conservazione e lo scongelamento di cellule mononucleate del sangue periferico adatte per analisi e flussi di lavoro a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA. Vengono dimostrate anche le collezioni di plasma e buffy coat.

Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti

Scopri un metodo automatizzato ad alto rendimento per isolare cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) da buffy coats. Questa tecnica migliora l'efficienza della biobanca mantenendo un'elevata vitalità cellulare.

Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento (Video) | JoVE Journal

Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento

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