Name: Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dellippocampo nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Scopri l'imaging del calcio in vivo delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi. Questo metodo combina iniezione virale e impianto di lente GRIN per studiare l'attività neuronale e le rappresentazioni spaziali.

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Questo lavoro è supportato dal Programma Pilota di Shanghai per la Ricerca di Base - Fudan University 21TQ1400100 (22TQ019), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project, il Lingang Laboratory (sovvenzione n. LG-QS-202203-09) e la Fondazione nazionale cinese per le scienze naturali (32371036).

Imaging in tempo reale per l'attività neuronale nelle cellule del giro dentato dei topi 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui abbiamo descritto una procedura per l'imaging del calcio in vivo nel DG dei topi. Riteniamo che questo protocollo sarà utile per i ricercatori che mirano a studiare le funzioni della DG in vari processi cognitivi, in particolare nei casi in cui una sottopopolazione geneticamente identificata è di interesse. Qui spieghiamo i vantaggi del nostro protocollo, sottolineando alcuni punti chiave della chirurgia, e discutiamo i limiti di questo metodo.
Abbiamo testato varie procedure per l'imaging DG dalla letteratura disponibile e ottimizzato le procedure sperimentali come descritto in questo protocollo. A nostro avviso, le seguenti tre modifiche chiave hanno notevolmente migliorato il tasso di successo del nostro protocollo. In primo luogo, abbiamo combinato tutte le procedure chirurgiche in un'unica seduta, mentre molti studi di imaging del calcio per le regioni sottocorticali hanno eseguito l'iniezione del virus e l'impianto di lenti in due interventi chirurgici separati. Un vantaggio chiave del nostro approccio è che l'espressione del virus e il recupero del tessuto cerebrale avvengono ora nello stesso periodo, riducendo della metà il tempo di attesa per la preparazione del topo, che di solito richiede mesi21. Inoltre, interventi chirurgici separati richiedono un riposizionamento accurato del mouse, poiché lievi inclinazioni con una mancata corrispondenza nell'intervallo di 100 μm porteranno al fallimento della procedura. Per evitare di smarrire l'obiettivo, alcuni gruppi hanno sviluppato un approccio che attacca il miniscopio all'obiettivo e hanno cercato di visualizzare l'espressione neuronale del sensore durante l'intervento chirurgico di impianto. Questa soluzione richiede un'ingegneria non banale dell'apparato stereotassico comunemente usato ed è complessa da usare a causa della soppressione delle attività dei neuroni durante l'anestesia. Il nostro metodo non richiede il riposizionamento del mouse, riducendo così notevolmente il tempo e lo stress associati alla procedura.
Il secondo punto chiave del nostro approccio è che iniettiamo ripetutamente piccole quantità di virus nell'area bersaglio22. Questo porta a un maggior numero di cellule che vengono infettate. È importante sottolineare che, rispetto all'aumento della carica virale in un singolo sito di iniezione, questo approccio ha prodotto risultati superiori in quanto le posizioni delle cellule infette si diffondono uniformemente nel campo visivo. Un altro punto chiave correlato è che la diluizione del titolo virale migliora la qualità dell'imaging del calcio. Nella nostra esperienza, una quantità eccessiva di virus è associata alla comparsa di cluster di attività simili a onde, il che è coerente con un precedente rapporto23. Sebbene inizialmente sospettassimo che l'aspirazione dei tessuti potesse portare a una rimozione prematura del virus nel sito di iniezione e a un'espressione insufficiente, non abbiamo osservato un tale fenomeno e il nostro protocollo ha generalmente prodotto una robusta infezione della regione bersaglio. Rispetto ai topi transgenici che esprimono GCaMP, l'approccio virale è inevitabilmente meno coerente ma offre un uso più flessibile perché non richiede un allevamento complicato. Tuttavia, poiché l'espressione del GCaMP può riversarsi nelle strutture cerebrali adiacenti o distribuirsi in modo non uniforme nella regione del cervello bersaglio, un attento esame delle posizioni anatomiche del virus e del cristallino dal tessuto fissato è fondamentale per l'interpretazione dei risultati. La combinazione di linee Cre specifiche per regione o tipo di cellula con l'espressione di GCaMP Cre-dipendente potrebbe migliorare la specificità dei segnali visualizzati.
Il terzo punto chiave del nostro protocollo è che durante l'impianto della lente, abbiamo ripetuto l'inserimento e il risciacquo della lente più volte per assicurarci che non ci fossero residui di sangue nell'area dell'impianto. Questa è un'operazione chiave per facilitare il recupero dei tessuti e migliorare il tasso di successo della procedura. Sebbene il meccanismo esatto non sia noto, ipotizziamo che l'inserimento della lente causerà inevitabilmente alcuni danni al tessuto e la fase di risciacquo eliminerebbe il sanguinamento associato a questo danno. In caso contrario, il sanguinamento associato all'inserzione può richiedere molto tempo per la guarigione del cervello, il che aumenta la probabilità di infiammazione locale e infiltrazione di macrofagi, entrambi i quali ridurrebbero la qualità ottica. Inoltre, alle coordinate che abbiamo fornito in questo protocollo, abbiamo scoperto che posizionare la lente un po' più vicino alla sutura sagittale di solito comporta un aumento del numero di cellule visibili, anche se è importante evitare di perforare il terzo ventricolo. Abbiamo anche fornito un elenco di problemi comuni per una migliore risoluzione dei problemi di questo passaggio (Tabella 1).
Il topo deve essere addestrato a indossare il miniscopio fittizio prima degli esperimenti comportamentali per ridurre al minimo l'impatto del peso aggiunto sulla testa. In genere, questo allenamento si svolge ~3 giorni, con ogni sessione della durata di 20 minuti. Durante gli esperimenti comportamentali, le condizioni fisiche del topo devono essere monitorate regolarmente. Le prestazioni comportamentali del topo saranno fortemente influenzate dalla sua salute.
Questo protocollo contiene diverse limitazioni. Innanzitutto, va notato che l'imaging del calcio è un surrogato dell'attività neurale, che può essere influenzata dall'espressione dei sensori. I metodi di imaging a un fotone che utilizzano un miniscopio possono portare a segnali sovrapposti dalle cellule vicine, che richiedono la demiscelazione dall'analisi successiva. Inoltre, il nostro protocollo prevede interventi chirurgici invasivi. Durante la fase di impianto della lente GRIN viene rimosso un pezzo di tessuto cerebrale, che di solito include parte della regione CA1, la corteccia retrospleniale e la corteccia visiva associativa. Ciò è necessario a causa della limitazione della profondità di imaging offerta dall'illuminazione a un fotone. Nelle nostre osservazioni, non abbiamo notato alcun deficit comportamentale apparente nei topi dopo la procedura chirurgica, né nei loro comportamenti generali e senza restrizioni né nell'apprendimento dei compiti del percorso lineare (Figura supplementare S1). In alternativa, l'uso di strumenti chirurgici automatizzati per l'aspirazione del tessuto cerebrale può ridurre gli errori associati all'operazione manuale, migliorando così la precisione della procedura chirurgica24. Inoltre, i nostri dati di imaging del calcio in generale hanno prodotto una normale dinamica del calcio. L'effetto su funzioni cognitive più complesse necessita di ulteriori caratterizzazioni. Un metodo alternativo per l'inserimento della lente senza aspirazione tissutale è stato descritto prima di25. Ciò si ottiene praticando un taglio nel tessuto cerebrale lungo il tratto di inserimento previsto e posizionando la lente direttamente attraverso l'apertura. Nella nostra esperienza, questo approccio porta al ripiegamento o ad altre deformazioni del tessuto cerebrale lungo il tratto di inserzione, che possono ancora essere invasive. L'elevata variabilità della deformazione rende questo approccio meno affidabile rispetto al protocollo che abbiamo descritto. Un altro potenziale avvertimento del nostro protocollo è che le prestazioni comportamentali del mouse sono leggermente influenzate dal cavo coassiale che collega il miniscopio e la scatola di acquisizione dati (DAQ) del miniscopio. Ciò non è dovuto solo al fatto che i fili si avvolgono insieme dopo numerosi giri, ma anche perché il filo può essere un distrattore per il mouse durante l'attività. L'utilizzo di un miniscopewireless 26 risolverebbe efficacemente questo problema. 
Nonostante le limitazioni esistenti, riteniamo che questa metodologia possa essere molto utile per i ricercatori interessati a utilizzare l'imaging del calcio in vivo per studiare i modelli di attività neuronale all'interno del giro dentato dell'ippocampo. Ad esempio, questo approccio di imaging del calcio in vivo può essere applicato per studiare le cellule di posizione specificamente all'interno della regione del giro dentato. Ciò consentirebbe l'esplorazione di come le cellule di posizione codificano le informazioni in diverse aree cerebrali10,27. La nostra convalida indica che questo protocollo è ragionevolmente riproducibile, con alti tassi di successo e può essere applicato a diverse regioni del cervello.

Studi precedenti hanno scoperto che l'ippocampo è una struttura cerebrale essenziale per l'elaborazione e il recupero dei ricordi 1,2. Dagli anni '50, i circuiti neurali dell'ippocampo nei roditori sono stati al centro dello studio della formazione, dell'archiviazione e del recupero della memoria3. Le strutture anatomiche all'interno dell'ippocampo includono le sottoregioni del giro dentato (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 e il subiculum4. Esistono complesse connessioni bidirezionali tra queste sottoregioni, di cui DG, CA1 e CA3 formano un circuito trisinaptico prominente costituito da cellule granulari e cellule piramidali5. Questo circuito riceve il suo input primario dalla corteccia entorinale (EC) ed è stato un modello classico per lo studio della plasticità sinaptica. Precedenti ricerche in vivo sulla funzione dell'ippocampo si sono concentrate principalmente sul CA1 6,7 a causa del suo più facile accesso. Mentre i neuroni CA1 svolgono un ruolo importante nella formazione, nel consolidamento e nel recupero della memoria, in particolare nelle cellule di posizione per la memoria spaziale, anche altre sottoregioni dell'ippocampo sono vitali 8,9. In particolare, recenti studi hanno evidenziato le funzioni della DG nella formazione della memoria. È stato riportato che le cellule di posizione in DG sono più stabili di quelle in CA110 e le loro attività riflettono informazioni specifiche del contesto11. Inoltre, la marcatura dipendente dall'attività delle cellule granulari DG può essere riattivata per indurre comportamenti correlati alla memoria12. Pertanto, per ottenere una comprensione più profonda della codifica delle informazioni in DG, è fondamentale studiare le attività della sottoregione DG mentre l'animale svolge compiti dipendenti dalla memoria.
Studi precedenti sulle attività della DG hanno utilizzato principalmente l'elettrofisiologia in vivo 13. Tuttavia, questa tecnica presenta alcuni inconvenienti: in primo luogo, nelle registrazioni elettriche, può essere difficile identificare direttamente i vari tipi di cellule che generano il segnale. I segnali registrati provengono sia da cellule inibitorie che eccitatorie. Pertanto, sono necessari ulteriori metodi di elaborazione dei dati per separare questi due tipi di celle. Inoltre, è difficile combinare altre informazioni sul tipo di cellula, come i sottogruppi specifici della proiezione o l'etichettatura dipendente dall'attività, con le registrazioni elettriche. Inoltre, a causa della morfologia anatomica del DG, gli elettrodi di registrazione sono spesso impiantati in una direzione ortogonale, il che limita notevolmente il numero di neuroni che possono essere registrati. Pertanto, è difficile per le registrazioni elettriche ottenere il monitoraggio di centinaia di singoli neuroni dalla struttura DG nello stesso animale14.
Una tecnica complementare di registrazione delle attività dei neuroni in DG consiste nell'utilizzare l'imaging del calcio in vivo 15. Gli ioni calcio sono fondamentali per i processi di segnalazione cellulare negli organismi, svolgendo un ruolo cruciale in molte funzioni fisiologiche, soprattutto all'interno del sistema nervoso dei mammiferi. Quando i neuroni sono attivi, la concentrazione intracellulare di calcio aumenta rapidamente, riflettendo la natura dinamica dell'attività neuronale e della trasmissione del segnale. Pertanto, la registrazione in tempo reale dei cambiamenti nei livelli intracellulari di calcio nei neuroni fornisce importanti informazioni sui meccanismi di codifica neurale.
La tecnologia di imaging del calcio utilizza coloranti fluorescenti specializzati o indicatori di calcio geneticamente modificati (GECI) per monitorare le concentrazioni di ioni calcio nei neuroni rilevando i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza, che possono quindi essere catturati attraverso l'imaging microscopico16. Comunemente, viene impiegata la famiglia GCaMP di geni indicatori del calcio, che comprende la proteina fluorescente verde (GFP), la calmodulina e le sequenze polipeptidiche M13. GCaMP può emettere fluorescenza verde quando si lega agli ioni calcio17, consentendo di registrare le fluttuazioni della fluorescenza verde tramite imaging18. Inoltre, per ottenere immagini chiare della regione del cervello bersaglio, una lente con indice di gradiente (lente GRIN) viene tipicamente impiantata sopra la regione di interesse. La lente GRIN consente l'imaging della regione profonda del cervello a cui non è possibile accedere direttamente dalla superficie.
Questa tecnica è relativamente facile da combinare con altri strumenti genetici per marcare diversi tipi di cellule. Inoltre, poiché il piano di imaging è parallelo all'orientamento delle cellule in DG, centinaia di neuroni sono accessibili per l'imaging con ogni intervento chirurgico riuscito. In questo lavoro, presentiamo un protocollo chirurgico completo e dettagliato per l'imaging in vivo del calcio nel giro dentato nei topi (Figura 1). La procedura prevede due operazioni principali. Il primo è quello di iniettare il virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f nel DG. La seconda operazione consiste nell'impiantare una lente GRIN sopra il sito di iniezione del virus. Queste due procedure vengono eseguite nella stessa seduta. Dopo il recupero da questi interventi chirurgici, il passo successivo è quello di controllare la qualità dell'imaging con microscopi miniaturizzati (miniscopi). Se il campo di imaging ha centinaia di cellule attive, la procedura successiva consiste nel fissare la piastra di base del miniscopio al cranio del topo utilizzando cemento dentale; Il mouse può quindi essere utilizzato per esperimenti di imaging. Presentiamo anche una pipeline di pre-elaborazione basata su MATLAB per semplificare l'analisi dei dati raccolti sul calcio.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L puntali per pipette universali</td><td>Pipette Transcat</td><td>1030-260-000-9</td><td>Per la rimozione del sangue e della soluzione salina</td></tr><tr><td>25 G luer lock blunt needle (punte di dispensazione prepiegate)</td> <td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Per la rimozione del tessuto cerebrale</td></tr><tr><td>Cappuccio protettivo stampato in 3D</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per proteggere la lente GRIN 75</td></tr><tr><td>% etanolo</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co., Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Per la disinfezione e la pulizia della superficie della lente GRIN</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f virus</td><td>Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Per iniezione virale</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 versione 22.1</td><td>Per disegnare figure</td></tr><tr><td>Pompa dell'aria per anestesia</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-30</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Software di controllo della fotocamera</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>Per la registrazione dei dati comportamentali</td></tr><tr><td>Supporti per cannula/ghiere in ceramica (supporto per lenti GRIN)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68214</td><td>Per tenere la lente GRIN</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>Per ridurre il dolore postoperatorio del topo&nbsp;</td></tr><tr><td>Cavo coassiale</td><td>Open ephys</td><td>CW8251</td><td>Per collegare il miniscopio e la scatola DAQ del miniscopio</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>Per osservare le fette di cervello</td></tr><tr><td>Batuffolo di cotone</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>Per la disinfezione</td></tr><tr><td>Piastra di testa personalizzata</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per tenere il mouse sulla ruota di corsa</td></tr><tr><td>Supporto per piastra di testa personalizzato</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per tenere la piastra di testa del mouse</td></tr><tr><td>Base per protesi (autopolimerizzante)</td><td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>Per attaccare il miniscopio Crema</td></tr><tr><td>depilatoria</td><td>Veet</td><td>ASIN: B001DUUPQ0</td><td>Per rimuovere i peli del mouse</td></tr><tr><td>Desktop in strumento stereotassico digitale, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>Per l'iniezione virale e l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Per prevenire l'infiammazione postoperatoria del topo</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Per osservare le condizioni durante gli interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Contenitore del filtro del gas, grande, confezione da 6</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Lente GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Lente</td> <td>GRINInFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Per l'impianto di lenti GRIN</td></tr><tr><td>Induzione camera-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Telecamera industriale</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Per l'acquisizione dei dati comportamentali</td></tr><tr><td>Disinfettante Iodophor</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Per la disinfezione</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Tubo di raccolta di campioni liquidi (micropipetta per capillari in vetro per Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Per iniezione virale</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Per l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>Per craniotomia</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Per estrarre la provetta di raccolta del campione liquido</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Per iniezione virale</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Per la registrazione dei dati di imaging del calcio</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>Per acquisire i dati di imaging del calcio</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Per l'imaging del calcio in vivo</td></tr><tr><td>Piastra di base Miniscope V4 (Variante 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variante 2</td><td>Per contenere il miniscope</td></tr><tr><td>nanoject III Iniettore programmabile di nanolitri</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Per iniezione virale</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H37022025</td><td>Per mantenere gli occhi umidi</td></tr><tr><td>Provetta PCR</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Per diluire il virus</td></tr><tr><td>Personal Computer (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Per registrare i dati di imaging del calcio e i dati comportamentali</td></tr><tr><td>Ruota da corsa</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Per tenere il mouse quando si fissa la piastra di base</td></tr><tr><td>Cacciavite (viti M1.6)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>60902</td><td>Per svitare le viti M1.6</td></tr><tr><td>Cacciavite (viti di fermo)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>S2</td><td>Per svitare le viti di fermo</td></tr><tr><td>Vite di fermo</td><td>TBD</td><td>2-56 vite di fermo a punta conica</td><td>Per fissare il miniscopio alla sua piastra di base</td></tr><tr><td>Macchina per anestesia per piccoli animali</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R500</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Siringa sterile</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Per risciacquare il sangue</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Per tagliare i capelli e il cuoio capelluto</td></tr><tr><td>Termoregolatore ThermoStar, 69025 pad incl.</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>69027</td><td>Per mantenere la temperatura corporea dell'animale</td></tr><tr><td>Pinze ultra fini</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Per rimuovere i detriti ossei e il</td></tr><tr><td>cavo USB 3.0</td><td>Aprire ephys</td><td>N / A</td><td>Per collegare la scatola DAQ del miniscopio e la</td></tr><tr><td>luce UV</td><td>del computer Jinshida</td><td>66105854002</td><td>Per fissare la lente GRIN sul cranio</td></tr><tr><td>Resina UV (adesivo fotopolimerizzabile)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>Per fissare la lente GRIN sul cranio</td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Per rimuovere il sangue, la soluzione salina e il tessuto cerebrale</td></tr></tbody></table>

imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Gli approcci in tempo reale sono tipicamente necessari negli studi sull'apprendimento e la memoria, e l'imaging del calcio in vivo offre la possibilità di studiare l'attività neuronale negli animali svegli durante i compiti comportamentali. Poiché l'ippocampo è strettamente associato alla memoria episodica e spaziale, è diventato una regione cerebrale essenziale nella ricerca in questo campo. In una recente ricerca, le cellule engram e le cellule di posizione sono state studiate registrando le attività neurali nella regione CA1 dell'ippocampo utilizzando il microscopio in miniatura nei topi durante l'esecuzione di compiti comportamentali tra cui il campo aperto e la pista lineare. Sebbene il giro dentato sia un'altra regione importante dell'ippocampo, è stato raramente studiato con l'imaging in vivo a causa della sua maggiore profondità e della difficoltà per l'imaging. In questo protocollo, presentiamo in dettaglio un processo di imaging del calcio, incluso come iniettare il virus, impiantare una lente GRIN (indice di gradiente) e collegare una piastra di base per l'imaging del giro dentato dell'ippocampo. Descriviamo inoltre come pre-elaborare i dati di imaging del calcio utilizzando MATLAB. Inoltre, gli studi su altre regioni cerebrali profonde che richiedono l'imaging possono trarre vantaggio da questo metodo.

La Figura 1 mostra lo schema della procedura sperimentale, compresa l'iniezione del virus, l'impianto della lente GRIN, l'apposizione della piastra di base, l'imaging del calcio in vivo tramite un miniscopio e l'elaborazione dei dati. Generalmente, l'intera procedura dura 1 mese. La Figura 2 mostra esempi di procedure di iniezione del virus, incluso il posizionamento del foro praticato sul cranio e le condizioni del tessuto cerebrale prima dell'impianto della lente GRIN.
La Figura 3 mostra il processo di rimozione del tessuto cerebrale, che è fondamentale per il successo di questo intervento chirurgico. Man mano che viene aspirato più tessuto, diventano visibili diversi strati di tessuto. Questa fase di aspirazione può essere interrotta una volta osservato uno strato grigio riflettente.
La Figura 4 mostra la procedura dell'impianto GRIN, compreso l'inserimento della lente GRIN, l'adesione della piastra sulla piastra sul cranio e la copertura della lente GRIN con un cappuccio personalizzato. La qualità dell'imaging del calcio in vivo dipende dal successo dell'iniezione del virus e dell'impianto della lente GRIN.
La Figura 5 mostra quattro tipi di risultatidell'imaging del calcio in vivo.La Figura 5A è il risultato non riuscito; Non sono state osservate cellule attive nel campo visivo dell'imaging. Figure 5B-D sono risultati positivi. La Figura 5B ha meno di 10 cellule attive, ma non ci sono vasi sanguigni evidenti. La Figura 5C ha più di 50 cellule attive e vasi sanguigni visibili. Nella Figura 5D, ci sono centinaia di cellule attive nel campo visivo dell'imaging; Allo stesso tempo, abbiamo osservato vasi sanguigni puliti. L'imaging del calcio in vivo di alta qualità ha in genere centinaia di cellule attivate. Si ritiene che meno di una dozzina di cellule attivate non siano ottimali per i risultati dell'imaging. Di solito, il numero di cellule è correlato al diametro della lente GRIN e alla parte della regione del cervello. Un diametro della lente GRIN più grande e una regione cerebrale più vicina al lato dorsale aumenteranno la probabilità di osservare più cellule attive. È anche fondamentale notare che maggiore è il diametro della lente GRIN, maggiore è il danno che provoca al cervello del topo; Pertanto, la selezione della taglia appropriata è fondamentale. L'impianto di una lente GRIN di 1 mm di diametro non influisce sulla capacità dell'animale di acquisire il comportamento della traccia lineare (Figura supplementare S1).
I dati comportamentali e i dati di imaging del calcio vengono solitamente elaborati separatamente. I dati comportamentali dei topi possono essere etichettati manualmente o elaborati utilizzando un software di analisi open source. I dati di imaging del calcio vengono elaborati utilizzando la correzione del movimento non rigido (NoRMCorre) ed EXTRACT in MATLAB. La Figura 6 mostra le singole cellule estratte sovrapposte al campo visivo e mostra cinque tracce di calcio rappresentative da una registrazione di imaging del calcio in vivo riuscita. Vedere il video supplementare S1 per un video rappresentativo dei dati non elaborati.
Verificare che l'impianto della lente GRIN e l'iniezione virale avvengano nella regione cerebrale prevista è l'ultimo passo ed è anche molto importante per l'interpretazione dei dati. La Figura 7 è una fetta di cervello di topo che mostra la posizione dell'espressione di GCaMP6f (la regione di fluorescenza verde) e la traccia della lente GRIN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> Figura 1: Schema delle procedure di iniezione del virus e impianto della lente GRIN. (A) Iniettare il virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f nel giro dentato. (B) Impiantare la lente GRIN sopra il giro dentato. (C) Controllare la qualità dell'imaging dopo l'intervento chirurgico. (D) Fissare la piastra di base del miniscopio dopo il controllo. (E) La tempistica e il processo dell'intero protocollo. Abbreviazione: GRIN = Indice di gradiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> Figura 2: Vista chirurgica rappresentativa durante l'iniezione del virus. (A) Posizionare il topo sull'apparato stereotassico. (B) Contrassegnare l'area di impianto della lente GRIN (la regione nera). (C) Craniotomia sull'area bersaglio. (D) Iniettare 240 nL di virus nel giro dentato. (E) Rimuovere la micropipetta dopo l'iniezione. (F) Rimuovere la corteccia e parte del tessuto cerebrale CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> Figura 3: Vista chirurgica rappresentativa durante l'aspirazione del tessuto cerebrale. (A) La regione racchiusa dal marcatore nero viene lucidata utilizzando un microtrapano, lasciando dietro di sé (B) tessuto corticale parzialmente esposto. La parte sinistra mostra una corteccia esposta e la parte destra è coperta dalla dura madre e dal tessuto cranico. (C) Immagine rappresentativa durante l'aspirazione del tessuto cerebrale corticale. Il tessuto rimane rosa pallido. (D) La materia bianca è visibile all'interno del campo visivo, come indicato dalla freccia bianca. (E) Un'ulteriore aspirazione ha rivelato una superficie riflettente grigio-rossa scura sotto la sostanza bianca. Si pensa che la regione (freccia nera) sia la superficie del CA1 e l'aspirazione non dovrebbe andare più in profondità. (F) Non è più visibile sanguinamento dalla regione dopo aver risciacquato più volte con soluzione fisiologica. In tutti i pannelli, gli asterischi indicano gli strumenti chirurgici: un ago smussato da 30 G per la soluzione fisiologica e un ago smussato da 25 G per l'aspirazione del tessuto cerebrale. Barre di scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> Figura 4: Un esempio di procedura per l'impianto della lente GRIN e il fissaggio della piastra di base. (A) Impiantare la lente GRIN nel tessuto cerebrale utilizzando un supporto per lenti GRIN. (B) Far aderire la lente GRIN nella posizione corretta con resina UV; la parte riflettente rappresenta la resina UV. (C) Fissare la piastra sul cranio del topo utilizzando la resina UV. (D) Coprire la lente GRIN con un cappuccio protettivo stampato in 3D. (E) Controllare la qualità dell'intervento. Il miniscopio era fissato da un supporto. (F) Applicare i materiali della base della protesi attorno alla piastra di base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> Figura 5: Risultati di imaging riusciti e non riusciti. (A) Risultato di imaging del calcio in vivo non riuscito. Non ci sono cellule attive in A e più regioni hanno macchie di sangue scuro come indicato dalle frecce nere. (B-D) Risultati di imaging del calcio in vivo di successo. (B) Si possono osservare meno di 10 cellule attive, ma nessun vaso sanguigno significativo nel campo di imaging. (C) Si possono osservare più di 50 cellule attive e vasi sanguigni significativi. (D) Si possono osservare centinaia di cellule attive e vasi sanguigni più significativi. I cerchi tratteggiati rappresentano il campo visivo dell'imaging. Le frecce verdi rappresentano le celle che esprimono GCaMP6f. Le frecce rosse rappresentano i vasi sanguigni. Barre di scala = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> Figura 6: Dati rappresentativi di imaging del calcio in vivo da un topo che corre sulla pista lineare. (A) La registrazione del campo visivo dell'imaging da parte del miniscopio, numero totale di celle = 227. (B) Tracce rappresentative di calcio. Le posizioni della cella sono mostrate con lo stesso colore in A. (C) Compito comportamentale: Percorso lineare con ricompense d'acqua ad entrambe le estremità. (D) Risultato rappresentativo dell'analisi comportamentale dell'attività del topo; tempo totale = 100 s. Le linee verticali blu indicano i punti temporali del comportamento di leccamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> Figura 7: Sezioni di tessuto cerebrale di topi dopo l'intervento chirurgico. (A,B) Due esempi di tessuti cerebrali di topo. Le aree rettangolari tratteggiate indicano il percorso di impianto della lente GRIN. Le linee curve rappresentano il giro dentato nell'ippocampo. Barre di scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problema</td>
			<td>Possibile causa</td>
			<td>Soluzione</td>
		</tr><tr><td>Il campo di imaging appare scuro o nero.</td>
			<td>C'è una quantità significativa di sangue residuo sul lato inferiore della lente GRIN.</td>
			<td>Prima di impiantare la lente GRIN, la soluzione salina viene utilizzata per lavare continuamente la superficie del sito chirurgico fino a quando non vi è più alcun sanguinamento osservabile.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Ci sono vasi sanguigni chiaramente visibili presenti nel campo di imaging, ma nessuna attività neuronale distinguibile.</td>
			<td>1. L'espressione del virus era subottimale o scarsa.</td>
			<td>1. Si consiglia di verificare quanto segue:</td>
		</tr><tr><td>2. La posizione dell'espressione virale osservata non corrisponde alla posizione in cui è stata impiantata la lente GRIN (generalmente, la posizione di impianto della lente GRIN è troppo bassa rispetto alla posizione desiderata).</td>
			<td>un. Assicurarsi che le condizioni di conservazione dei virus siano appropriate.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. Verificare che la posizione di iniezione del virus sia corretta.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. Verificare che la concentrazione del virus sia adatta.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. Durante la successiva procedura chirurgica, la profondità dell'impianto della lente GRIN può essere aumentata in modo appropriato e la profondità esatta deve essere registrata attentamente ogni volta che viene condotto l'esperimento.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Il campo di imaging mostra alcuni modelli regionali di attività neuronale, ma non c'è un'attività chiaramente visibile a livello di singola cellula.</td>
			<td>1. Il volume del virus iniettato era eccessivamente alto.</td>
			<td>1. Diluire il virus o ridurre il volume dell'iniezione del virus.</td>
		</tr><tr><td>2. La posizione dell'espressione del virus non si allinea con la posizione della lente GRIN (in genere, la lente GRIN viene impiantata a una profondità inferiore rispetto alla posizione ottimale per l'espressione del virus).</td>
			<td>2. Durante la successiva procedura chirurgica, la profondità dell'impianto della lente GRIN può essere aumentata in modo appropriato e la profondità esatta deve essere registrata attentamente ogni volta che viene condotto l'esperimento.</td>
		</tr><tr><td>Ci sono alcune cellule all'interno del campo di imaging che mantengono un segnale di fluorescenza costantemente luminoso in ogni momento e non vi è alcun cambiamento nell'intensità di questa fluorescenza.</td>
			<td>Il virus è sovraespresso all'interno di una singola cellula.</td>
			<td>Diluire il virus o ridurre il volume dell'iniezione del virus.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Tabella di risoluzione dei problemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Figura supplementare S1: Acquisizione normale del compito di memoria spaziale da parte di topi che hanno subito un intervento chirurgico. Il grafico mostra la quantificazione del numero di prove completate nella sessione di 20 minuti ogni giorno. I dati sono rappresentati come media ± SEM. N = 3 topi nel gruppo con intervento chirurgico e 4 nel gruppo senza intervento chirurgico. L'ANOVA bidirezionale è stata utilizzata per il confronto statistico. Abbreviazione: ns = non significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Video supplementare S1: Dati grezzi rappresentativi dell'imaging del calcio in DG. Questo video mostra l'attività del calcio per un periodo di 5 minuti. Il video viene riprodotto a 10 volte la velocità originale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: Il design della piastra di testa. Questo file delinea il disegno 2D del design della piastra di testa. La produzione della piastra di testa prevede il taglio dell'acciaio inox secondo il disegno. I due piccoli fori sulla barra laterale devono essere filettati con filettature M1.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Il design del cappuccio protettivo stampato in 3D. Questo file fornisce il gcode delle fette del cappuccio protettivo che possono essere utilizzate con una stampante 3D. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la plastica dell'acido polilattico come materia prima per la stampa. I piccoli fori sul lato corrispondono alle posizioni dei fori filettati sulla piastra di testa per l'installazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Il design del supporto del miniscopio. Questo file fornisce il gcode delle fette del porta miniscopio che possono essere utilizzate con una stampante 3D. Il foro cilindrico viene utilizzato per l'installazione su un supporto stereotassico con una vite M4. I fori sul lato hanno lo scopo di aggiungere viti per il serraggio, ma il supporto può essere utilizzato senza questa funzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: codice di controllo Arduino e script per la pre-elaborazione video dell'imaging del calcio grezzo. Questo file contiene gli script per il controllo di Arduino e il codice per la pre-elaborazione dei dati di imaging del calcio. Il codice Arduino controlla l'impostazione del comportamento in cui il mouse impara a leccare per ottenere ricompense d'acqua alle estremità alternate di un binario lineare. Dopo aver appreso il compito, i topi correranno ripetutamente avanti e indietro sulla pista. Il codice di pre-elaborazione dell'imaging del calcio esegue la conversione del formato del file, la correzione del movimento, il down-sampling spaziale e l'estrazione del segnale cellulare dai dati raccolti dal miniscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Il giro dentato dell'ippocampo svolge funzioni essenziali e distinte nell'apprendimento e nella memoria. Questo protocollo descrive una serie di procedure robuste ed efficienti per l'imaging in vivo del calcio di cellule granulari nel giro dentato in topi che si muovono liberamente.

Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

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Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli radicali dorsali intatti. J. Vis. Exp. (2023). Il video mostra una tecnica di imaging del calcio in vivo per monitorare l'attività neuronale nei gangli della radice dorsale (DRG) di un topo transgenico. I neuroni DRG esprimono un indicatore di calcio che aumenta l'intensità della fluorescenza dopo il legame con il calcio. Gli stimoli meccanici o termici applicati a una...

Imaging del calcio in vivo di insiemi neuronali nei gangli della radice dorsale intatti di un topo

Fonte: Calvo-Rodríguez, et al. Imaging a fluorescenza e bioluminescenza di Ca2+ in neuroni ippocampali invecchiati. J. Vis. Exp. (2015).  Questo video dimostra l'uso dell'imaging a fluorescenza per misurare i livelli di calcio citosolico in colture ippocampali di ratto a breve e lungo termine. Confrontando i neuroni giovani e quelli invecchiati, evidenzia come l'aumento della densità dei canali del calcio voltaggio-dipendente di tipo L e l'attivazione prolungata nei neuroni anziani provochino...

Imaging in vitro del calcio in colture di ippocampi di ratto a breve e lungo termine

Fonte: Lee, H. et. al., Imaging di calcio in vivo riuscito con un microscopio miniaturizzato montato sulla testa nell'amigdala di un topo che si comporta liberamente. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra l'imaging del calcio in vivo in un topo utilizzando un indice di rifrazione a gradiente, o lente GRIN, e un microscopio miniaturizzato. La configurazione combina la fissazione della testa all'interno di un sistema di gabbie mobili senza attrito, stimolando i neuroni e innescando l'afflusso di...

Imaging microendoscopico del calcio in tempo reale in un topo che si muove liberamente

Qui presentiamo come esporre il ganglio genicolato di un topo da laboratorio vivo e anestetizzato e come utilizzare l'imaging del calcio per misurare le risposte degli insiemi di questi neuroni agli stimoli del gusto, consentendo prove multiple con diversi stimolanti. Ciò consente confronti approfonditi di quali neuroni rispondono a quali tastants.

Imaging in vivo del calcio delle risposte del neurone ganglio genicolato di topo agli stimoli del gusto

Presentiamo un protocollo per esporre il tronco encefalico del topo adulto dal lato ventrale. Utilizzando una lente indice gradient-rifrazione con un microscopio in miniatura, l'imaging di calcio può essere utilizzato per esaminare l'attività dei somata neurali olivari inferiori in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Miniscope in vivo calcium imaging è una potente tecnica per studiare le dinamiche neuronali e i microcircuiti in topi che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive l'esecuzione di interventi chirurgici al cervello per ottenere una buona imaging del calcio in vivo utilizzando un miniscopio.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Il presente protocollo delinea l'imaging del calcio in vivo per misurare le risposte di insiemi di neuroni DRG lombari-6 a stimoli somatici e viscerali. Confronti approfonditi possono essere effettuati tra i neuroni che rispondono a diversi stimoli. Questo protocollo è prezioso per studiare i meccanismi del dolore viscerale e della stimolazione somatica, come l'agopuntura.

in vivo Imaging del calcio della risposta dei neuroni dei gangli della radice dorsale a stimoli somatici e viscerali

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono una solida analisi a livello di popolazione della segnalazione sensoriale dei neuroni. Qui, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che consente la visualizzazione GECI in vivo dell'attività dei neuroni dei gangli trigeminali del ratto.

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

Questo protocollo descrive l'imaging in vivo del calcio GCaMP di neuroni del ganglio trigemino (TG) intatti. Questa descrizione include la chirurgia dell'esposizione ai TG, l'imaging al microscopio confocale in vivo dei neuroni TG, l'applicazione di stimoli somatici durante l'imaging microscopico dei neuroni TG e l'analisi dei dati di imaging del calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli trigeminali intatti

Scopri l'imaging del calcio in vivo delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi. Questo metodo combina iniezione virale e impianto di lente GRIN per studiare l'attività neuronale e le rappresentazioni spaziali.

Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi

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