Name: Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Impara l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per misurare la rigidità mediante microscopia a forza atomica. Questo metodo aiuta a studiare la meccanobiologia vascolare nella retinopatia diabetica.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (a K.G.), dalla Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (a K.G.), dalla Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant dalla W.M. Keck Foundation (al Doheny Eye Institute) e dalla Ursula Mandel Fellowship e dall'UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (all'IST). Questo lavoro è stato anche sostenuto da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, Inc. al Dipartimento di Oftalmologia dell'UCLA. Il contenuto di questo articolo è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Misurazione della rigidità nei capillari retinici di topo e nella matrice subendoteliale

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<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
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<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'AFM è stato ampiamente utilizzato per misurare i cambiamenti associati alla malattia nella rigidità dei vasi più grandi, come l'aorta e le arterie16. Questi risultati hanno contribuito a stabilire il ruolo della meccanobiologia endoteliale nelle complicanze cardiovascolari come l'aterosclerosi17. Sulla base di questi risultati, abbiamo iniziato a studiare il ruolo precedentemente non riconosciuto della meccanobiologia endoteliale nello sviluppo di lesioni microvascolari r...

I capillari retinici sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi retinica e della funzione visiva. Infatti, la loro degenerazione nel diabete precoce è fortemente implicata nello sviluppo di complicanze potenzialmente visibili della retinopatia diabetica (DR), una condizione microvascolare che colpisce quasi il 40% di tutti gli individui con diabete1. L'infiammazione vascolare contribuisce in modo significativo alla degenerazione capillare retinica nella DR. Studi precedenti hanno dimostrato un ruolo importante per segnali molecolari e biochimici aberranti nell'infiammazione vascolare retinica indotta dal diabete 2,3. Tuttavia, lavori recenti hanno introdotto un nuovo paradigma per la patogenesi della DR che identifica l'irrigidimento capillare retinico come un determinante cruciale, ma precedentemente non riconosciuto, dell'infiammazione e della degenerazione vascolare retinica 4,5,6.
In particolare, l'aumento della rigidità capillare retinica indotto dal diabete è causato dalla sovraregolazione dell'enzima reticolante del collagene lisil ossidasi (LOX) nelle cellule endoteliali retiniche (EC), che irrigidisce la matrice subendoteliale (membrana basale)4,5,6. L'irrigidimento della matrice, a sua volta, irrigidisce le EC retiniche sovrastanti (a causa della reciprocità meccanica), portando così all'aumento complessivo della rigidità capillare retinica4. Fondamentalmente, questo irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete da solo può promuovere l'attivazione della EC retinica e la morte EC mediata dall'infiammazione. Questa regolazione meccanica dei difetti dell'EC retinica può essere attribuita all'alterata meccanotrasduzione endoteliale, il processo mediante il quale i segnali meccanici vengono convertiti in segnali biochimici per produrre una risposta biologica 7,8,9. È importante sottolineare che i segnali meccanici EC alterati e la struttura della matrice subendoteliale sono stati anche implicati nella degenerazione vascolare coroideale associata alla degenerazione maculare precoce legata all'età (AMD)10,11,12, il che attesta le implicazioni più ampie della meccanobiologia vascolare nelle malattie degenerative della retina.
In particolare, l'irrigidimento dei capillari retinici si verifica all'inizio del diabete, che coincide con l'insorgenza dell'infiammazione retinica. Pertanto, l'aumento della rigidità capillare retinica può fungere sia da bersaglio terapeutico che da marcatore diagnostico precoce per la DR. A tal fine, è importante ottenere misurazioni affidabili e dirette della rigidità dei capillari retinici e della matrice subendoteliale. Ciò può essere ottenuto utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM), che offre una tecnica unica, sensibile, accurata e affidabile per misurare direttamente la rigidità delle cellule, della matrice extracellulare e dei tessuti13. Un AFM applica una forza di indentazione minuta (livello di nanoNewton) sul campione la cui rigidità determina la misura in cui il cantilever AFM di indentazione si piega: più rigido è il campione, più il cantilever si piega e viceversa. Abbiamo utilizzato ampiamente l'AFM per misurare la rigidità delle cellule endoteliali in coltura, delle matrici subendoteliali e dei capillari retinici isolati di topo 4,5,6,11,12. Queste misurazioni della rigidità dell'AFM hanno contribuito a identificare la meccanobiologia endoteliale come un determinante chiave della patogenesi di DR e AMD. Per aiutare ad ampliare l'ambito della meccanobiologia nella ricerca sulla vista, qui forniamo una guida passo passo sull'uso dell'AFM per le misurazioni della rigidità dei capillari retinici isolati di topo e della matrice subendoteliale.

<table><tbody><tr><td><forte>Isolamento capillare retinico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro per siringa in PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>Durapore a basso legame proteico</td></tr><tr><td>10X Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio % magnesio</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>Concentrazione finale 1X, pH 7,4</td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provetta da centrifuga</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>senza RNASI, non pirogeno</td></tr><tr><td>20 mL Siringa Luer-Lok TIP</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 pollici monouso in vetro borosilicato/Pipetta Pasteur non sterile</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Piastra per coltura tissutale</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - Penna da 13 ml</td><td>Laboratorio di dispositivi scientifici</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica</td> in acciaio al carbonio <td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Cera dentale</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Soluzione di formalina Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, tampone neutro, 10%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>Concentrazione finale 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - panno tergicristallo</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Micro spatola</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 Acciaio inossidabile 115mm&nbsp; Pinzetta</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ Classe II, Tipo A2 Cabina di biosicurezza</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-Lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>AmScope</td><td>serie SM-3 Zoom Stereomicroscopio trinoculare 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopia Superfrost Plus - Linguetta bianca - Pre-pulito - 25x75x1,0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, soluzione 0,1M, pH 7,4 - Grado biotecnologico</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 per soluzione di tripsina</td></tr><tr><td>Tripsina 1:250 in polvere Grado per coltura tissutale</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10 % (p/v) soluzione di tripsina</td></tr><tr><td>Acqua Grado di biologia molecolare</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td><forte>matrice subendoteliale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS con calcio e magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Collagene IV anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro (12 mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td> a<td>base di glutaraldeide</td> Scienze <td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali retiniche umane (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 medium</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali retiniche di topo (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>AFM Misurazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &; m Sonda</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>Una sonda emisferica alta 19 micron con raggio finale di 1 micron, costante a molla 0,25 N/m</td></tr><tr><td>Sonda LC 70 nm</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>Una sonda emisferica alta 19 micron con raggio finale di 70 nm, &nbsp; Costante della molla 0,1 N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; fotocamera</td><td>famiglia XCAM</td><td>Toupcam</td><td>1080P</td></tr><tr><td>HDMI Desktop per eseguire la fotocamera</td><td></td><td>Asus Asus desktop</td><td>Intel i5-6600 CPU , 8GB di RAM</td></tr><tr><td>Portapiatti per vetrino coprioggetti</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm piatto fondo in vetro con &nbsp; Microscopio</td></tr> a <tr>forza atomica da 14 mm<td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>Bioscience montato su un microscopio ottico per la misurazione sensibile delle proprietà meccanostrutturali (rigidità e topografia) di campioni biologici morbidi</td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>Microscopio invertito con obiettivo 10X</td></tr></tbody></table>

isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

La degenerazione capillare retinica è un segno clinico distintivo delle prime fasi della retinopatia diabetica (DR). I nostri studi recenti hanno rivelato che l'irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete svolge un ruolo causale cruciale e precedentemente non riconosciuto nella degenerazione dei capillari retinici mediata dall'infiammazione. L'aumento della rigidità capillare retinica deriva dalla sovraespressione della lisil ossidasi, un enzima che lega e irrigidisce la matrice subendoteliale. Poiché si prevede che affrontare la DR nella fase iniziale prevenga o rallenti la progressione della DR e la perdita della vista associata, la matrice subendoteliale e la rigidità capillare rappresentano bersagli terapeutici rilevanti e nuovi per la gestione precoce della DR. Inoltre, la misurazione diretta della rigidità capillare retinica può fungere da fase cruciale per la convalida preclinica per lo sviluppo di nuove tecniche di imaging per la valutazione non invasiva della rigidità capillare retinica in soggetti animali e umani. Con questa visione in mente, forniamo qui un protocollo dettagliato per l'isolamento e la misurazione della rigidità dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale utilizzando la microscopia a forza atomica.

Capillari retinici di topo La misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici isolati comporta fasi di manipolazione del campione che potrebbero potenzialmente danneggiarne l'integrità meccanostrutturale. Per evitare che ciò accada e quindi garantire la fattibilità, l'affidabilità e la riproducibilità delle misure AFM, gli occhi enucleati vengono fissati in formalina al 5% durante la notte a 4 °C prima dell'isolamento del vaso. Questo protocollo di fissazione lieve con concentrazione di formalin...

Recentemente abbiamo identificato l'irrigidimento capillare retinico come un nuovo paradigma per la disfunzione retinica associata al diabete. Questo protocollo elabora le fasi per l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale da colture endoteliali retiniche, seguite da una descrizione della tecnica di misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica.

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that ...

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Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

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