Name: Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Impara l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per misurare la rigidità mediante microscopia a forza atomica. Questo metodo aiuta a studiare la meccanobiologia vascolare nella retinopatia diabetica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (a K.G.), dalla Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (a K.G.), dalla Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant dalla W.M. Keck Foundation (al Doheny Eye Institute) e dalla Ursula Mandel Fellowship e dall'UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (all'IST). Questo lavoro è stato anche sostenuto da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, Inc. al Dipartimento di Oftalmologia dell'UCLA. Il contenuto di questo articolo è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Misurazione della rigidità nei capillari retinici di topo e nella matrice subendoteliale

<ol><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+current+understanding%2C+mechanisms%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).</li>
<li>Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+pathological+changes+in+the+diabetic+retina%3A+Implications+for+targeting+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy.</a> Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+retinal+vascular+inflammation+and+degeneration+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes.</a> Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+matrix+stiffening+by+lysyl+oxidase+enhances+RAGE-mediated+retinal+endothelial+activation+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes.</a> Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+stiffening+promotes+retinal+endothelial+activation+associated+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes.</a> FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).</li>
<li>Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+Mechanotransduction+pathways+that+control+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology.</a> Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).</li>
<li>Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stresses+and+translational+distortion+of+the+nucleus+during+fibroblast+migration+on+a+physiologically+relevant+ECM+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic.</a> Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).</li>
<li>Ghosh, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell+and+tissue+development%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+cell+and+basement+membrane+architecture+contribute+to+sidestream+smoke-induced+choroidal+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+increases+choroidal+endothelial+stiffness+and+susceptibility+to+complement+injury%3A+Implications+for+choriocapillaris+loss+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. (76), e50489(2013).</li>
<li>Beacham, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+extracellular+matrices+produced+by+cultured+and+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).</li>
<li>Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+stiffness+of+ex+vivo+mouse+aortas+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (116), e54630(2016).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+intimal+stiffening+enhances+endothelial+permeability+and+leukocyte+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration.</a> Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).</li>
<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'AFM è stato ampiamente utilizzato per misurare i cambiamenti associati alla malattia nella rigidità dei vasi più grandi, come l'aorta e le arterie16. Questi risultati hanno contribuito a stabilire il ruolo della meccanobiologia endoteliale nelle complicanze cardiovascolari come l'aterosclerosi17. Sulla base di questi risultati, abbiamo iniziato a studiare il ruolo precedentemente non riconosciuto della meccanobiologia endoteliale nello sviluppo di lesioni microvascolari retiniche nella DR precoce. Il successo in questa ricerca, tuttavia, si basa sulla misurazione accurata dei cambiamenti indotti dal diabete nella rigidità capillare retinica. Studi recenti hanno rivelato che, in modo simile ai grandi vasi, anche la rigidità dei capillari retinici e la matrice subendoteliale retinica secernita dall'EC possono essere misurate direttamente, in modo accurato e affidabile utilizzando AFM 4,5,6.
Questo approccio prevede l'isolamento dei capillari retinici di topo dagli occhi lievemente fissati utilizzando la digestione della tripsina. Sulla base dell'esperienza, questa fase di fissazione lieve è necessaria poiché i capillari isolati dagli occhi non fissati (utilizzando il metodo ipotonico) sono fragili e si frammentano, rendendoli inadatti per la misurazione della rigidità AFM4. Al contrario, una fissazione più forte e la conseguente necessità di un'estesa digestione della tripsina, che è stata riportata in altri protocolli di digestione della tripsina retinica18, possono anche compromettere l'integrità strutturale dei capillari, come giudicato dalla rottura delle giunzioni strette. Pertanto, la lieve fissazione capillare e la delicata digestione della tripsina impiegate qui aiutano a ridurre gli artefatti di rigidità derivanti da un'eccessiva reticolazione indotta dalla formalina e garantiscono l'integrità strutturale dei capillari per una misurazione affidabile della rigidità AFM.
Come approccio alternativo, uno studio recente ha riportato la misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici da montature piatte retiniche leggermente fissate19. Eseguendo le rientranze della forza AFM sui capillari retinici all'interno della retina intatta, questo approccio consente la misurazione della rigidità in situ . Tuttavia, queste misurazioni della rigidità capillare probabilmente includono la rigidità della membrana limitante interna. Inoltre, questo approccio è limitato alla misurazione dei soli capillari superficiali accessibili su un supporto piatto retinico, tralasciando il plesso capillare più profondo che è specificamente interessato all'inizio della DR20. Questi problemi possono essere affrontati utilizzando questo approccio, che estrae i vasi in modo pulito (privi di tessuto retinico residuo) da tutti gli strati retinici. Attualmente stiamo ottimizzando questo protocollo per isolare i vasi coroideali da modelli animali di AMD precoce. Detto questo, ci rendiamo conto che la lieve fissazione in formalina impiegata nel protocollo può causare un artefatto di irrigidimento associato alla reticolazione nelle misurazioni AFM. Pertanto, sarebbe prudente interpretare i valori di rigidità vascolare ottenuti utilizzando questo approccio più in termini di variazioni relative della rigidità (tra diversi gruppi sperimentali) piuttosto che di rigidità assoluta.
A differenza dei capillari retinici che richiedono una fissazione lieve, la matrice subendoteliale ottenuta dalle colture di EC retinica può essere valutata senza alcuna modifica. Ciò è in gran parte dovuto alla robustezza della matrice depositata, che deriva da una combinazione di diversi fattori, tra cui l'aggiunta di acido ascorbico nel terreno di coltura (che migliora la sintesi del collagene15), la modifica chimica dei vetrini coprioggetti che impedisce il distacco della matrice durante la decellularizzazione e la durata prolungata della coltura (10-15 giorni). È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che l'aumento della rigidità della matrice subendoteliale indotto dall'iperglicemia in vitro è coerente con l'aumento della rigidità capillare retinica indotto dal diabete osservato in vivo4. Ciò non sorprende in quanto ci si aspetta che un aumento della rigidità della matrice aumenti la rigidità delle EC retiniche sovrastanti (a causa della reciprocità meccanica) che, insieme, aumentano la rigidità capillare complessiva. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato che le EC retiniche diventano più rigide quando cresciute in condizioni diabetiche4, probabilmente attraverso un aumento della tensione citoscheletrica dell'actina Rho/ROCK-dipendente21. Questi risultati implicano anche che l'irrigidimento coroideale dell'EC osservato nel modello di scimmia rhesus di AMD precoce riflette l'aumento della rigidità della matrice subendoteliale coroideale e dei vasi intatti12, un'idea che è in fase di test in studi in corso. Nel complesso, il fatto che le alterazioni della rigidità nella matrice subendoteliale retinica non fissata e nelle EC rispecchino l'andamento osservato nei vasi retinici intatti lievemente fissati testimonia la validità dell'approccio di fissazione lieve.
La misurazione diretta della rigidità dei capillari retinici da modelli animali di DR non solo aiuta a stabilire la meccanobiologia endoteliale come un nuovo bersaglio terapeutico per la gestione della DR, ma fornisce anche un forte razionale per sviluppare in futuro nuove tecniche di imaging sensibili per la valutazione non invasiva della rigidità capillare retinica nei pazienti con DR. Tali tecniche non invasive potrebbero potenzialmente rilevare sottili cambiamenti nel flusso sanguigno che si prevede derivino dall'irrigidimento capillare, simili ai cambiamenti nella velocità dell'onda del polso arterioso che sono comunemente rilevati nelle malattie cardiovascolari indotte dal diabete. Le misurazioni della rigidità AFM dei capillari retinici isolati da occhi umani post-mortem da donatori diabetici forniranno un'importante prova di concetto a questo proposito. Dato che la rigidità capillare retinica aumenta precocemente nel modello murino (streptozotocina) di diabete di tipo1 4, l'uso efficace dell'AFM nella convalida delle modalità di imaging per la misurazione della rigidità può portare all'identificazione della rigidità capillare retinica come biomarcatore clinico per la patogenesi precoce della DR.

I capillari retinici sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi retinica e della funzione visiva. Infatti, la loro degenerazione nel diabete precoce è fortemente implicata nello sviluppo di complicanze potenzialmente visibili della retinopatia diabetica (DR), una condizione microvascolare che colpisce quasi il 40% di tutti gli individui con diabete1. L'infiammazione vascolare contribuisce in modo significativo alla degenerazione capillare retinica nella DR. Studi precedenti hanno dimostrato un ruolo importante per segnali molecolari e biochimici aberranti nell'infiammazione vascolare retinica indotta dal diabete 2,3. Tuttavia, lavori recenti hanno introdotto un nuovo paradigma per la patogenesi della DR che identifica l'irrigidimento capillare retinico come un determinante cruciale, ma precedentemente non riconosciuto, dell'infiammazione e della degenerazione vascolare retinica 4,5,6.
In particolare, l'aumento della rigidità capillare retinica indotto dal diabete è causato dalla sovraregolazione dell'enzima reticolante del collagene lisil ossidasi (LOX) nelle cellule endoteliali retiniche (EC), che irrigidisce la matrice subendoteliale (membrana basale)4,5,6. L'irrigidimento della matrice, a sua volta, irrigidisce le EC retiniche sovrastanti (a causa della reciprocità meccanica), portando così all'aumento complessivo della rigidità capillare retinica4. Fondamentalmente, questo irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete da solo può promuovere l'attivazione della EC retinica e la morte EC mediata dall'infiammazione. Questa regolazione meccanica dei difetti dell'EC retinica può essere attribuita all'alterata meccanotrasduzione endoteliale, il processo mediante il quale i segnali meccanici vengono convertiti in segnali biochimici per produrre una risposta biologica 7,8,9. È importante sottolineare che i segnali meccanici EC alterati e la struttura della matrice subendoteliale sono stati anche implicati nella degenerazione vascolare coroideale associata alla degenerazione maculare precoce legata all'età (AMD)10,11,12, il che attesta le implicazioni più ampie della meccanobiologia vascolare nelle malattie degenerative della retina.
In particolare, l'irrigidimento dei capillari retinici si verifica all'inizio del diabete, che coincide con l'insorgenza dell'infiammazione retinica. Pertanto, l'aumento della rigidità capillare retinica può fungere sia da bersaglio terapeutico che da marcatore diagnostico precoce per la DR. A tal fine, è importante ottenere misurazioni affidabili e dirette della rigidità dei capillari retinici e della matrice subendoteliale. Ciò può essere ottenuto utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM), che offre una tecnica unica, sensibile, accurata e affidabile per misurare direttamente la rigidità delle cellule, della matrice extracellulare e dei tessuti13. Un AFM applica una forza di indentazione minuta (livello di nanoNewton) sul campione la cui rigidità determina la misura in cui il cantilever AFM di indentazione si piega: più rigido è il campione, più il cantilever si piega e viceversa. Abbiamo utilizzato ampiamente l'AFM per misurare la rigidità delle cellule endoteliali in coltura, delle matrici subendoteliali e dei capillari retinici isolati di topo 4,5,6,11,12. Queste misurazioni della rigidità dell'AFM hanno contribuito a identificare la meccanobiologia endoteliale come un determinante chiave della patogenesi di DR e AMD. Per aiutare ad ampliare l'ambito della meccanobiologia nella ricerca sulla vista, qui forniamo una guida passo passo sull'uso dell'AFM per le misurazioni della rigidità dei capillari retinici isolati di topo e della matrice subendoteliale.

<table><tbody><tr><td><forte>Isolamento capillare retinico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro per siringa in PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>Durapore a basso legame proteico</td></tr><tr><td>10X Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio % magnesio</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>Concentrazione finale 1X, pH 7,4</td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provetta da centrifuga</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>senza RNASI, non pirogeno</td></tr><tr><td>20 mL Siringa Luer-Lok TIP</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 pollici monouso in vetro borosilicato/Pipetta Pasteur non sterile</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Piastra per coltura tissutale</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - Penna da 13 ml</td><td>Laboratorio di dispositivi scientifici</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica</td> in acciaio al carbonio <td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Cera dentale</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Soluzione di formalina Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, tampone neutro, 10%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>Concentrazione finale 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - panno tergicristallo</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Micro spatola</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 Acciaio inossidabile 115mm&nbsp; Pinzetta</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ Classe II, Tipo A2 Cabina di biosicurezza</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-Lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>AmScope</td><td>serie SM-3 Zoom Stereomicroscopio trinoculare 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopia Superfrost Plus - Linguetta bianca - Pre-pulito - 25x75x1,0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, soluzione 0,1M, pH 7,4 - Grado biotecnologico</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 per soluzione di tripsina</td></tr><tr><td>Tripsina 1:250 in polvere Grado per coltura tissutale</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10 % (p/v) soluzione di tripsina</td></tr><tr><td>Acqua Grado di biologia molecolare</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td><forte>matrice subendoteliale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS con calcio e magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Collagene IV anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro (12 mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td> a<td>base di glutaraldeide</td> Scienze <td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali retiniche umane (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 medium</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali retiniche di topo (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>AFM Misurazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &; m Sonda</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>Una sonda emisferica alta 19 micron con raggio finale di 1 micron, costante a molla 0,25 N/m</td></tr><tr><td>Sonda LC 70 nm</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>Una sonda emisferica alta 19 micron con raggio finale di 70 nm, &nbsp; Costante della molla 0,1 N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; fotocamera</td><td>famiglia XCAM</td><td>Toupcam</td><td>1080P</td></tr><tr><td>HDMI Desktop per eseguire la fotocamera</td><td></td><td>Asus Asus desktop</td><td>Intel i5-6600 CPU , 8GB di RAM</td></tr><tr><td>Portapiatti per vetrino coprioggetti</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm piatto fondo in vetro con &nbsp; Microscopio</td></tr> a <tr>forza atomica da 14 mm<td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>Bioscience montato su un microscopio ottico per la misurazione sensibile delle proprietà meccanostrutturali (rigidità e topografia) di campioni biologici morbidi</td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>Microscopio invertito con obiettivo 10X</td></tr></tbody></table>

isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

La degenerazione capillare retinica è un segno clinico distintivo delle prime fasi della retinopatia diabetica (DR). I nostri studi recenti hanno rivelato che l'irrigidimento capillare retinico indotto dal diabete svolge un ruolo causale cruciale e precedentemente non riconosciuto nella degenerazione dei capillari retinici mediata dall'infiammazione. L'aumento della rigidità capillare retinica deriva dalla sovraespressione della lisil ossidasi, un enzima che lega e irrigidisce la matrice subendoteliale. Poiché si prevede che affrontare la DR nella fase iniziale prevenga o rallenti la progressione della DR e la perdita della vista associata, la matrice subendoteliale e la rigidità capillare rappresentano bersagli terapeutici rilevanti e nuovi per la gestione precoce della DR. Inoltre, la misurazione diretta della rigidità capillare retinica può fungere da fase cruciale per la convalida preclinica per lo sviluppo di nuove tecniche di imaging per la valutazione non invasiva della rigidità capillare retinica in soggetti animali e umani. Con questa visione in mente, forniamo qui un protocollo dettagliato per l'isolamento e la misurazione della rigidità dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale utilizzando la microscopia a forza atomica.

Capillari retinici di topo La misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici isolati comporta fasi di manipolazione del campione che potrebbero potenzialmente danneggiarne l'integrità meccanostrutturale. Per evitare che ciò accada e quindi garantire la fattibilità, l'affidabilità e la riproducibilità delle misure AFM, gli occhi enucleati vengono fissati in formalina al 5% durante la notte a 4 °C prima dell'isolamento del vaso. Questo protocollo di fissazione lieve con concentrazione di formalina ridotta, bassa temperatura di fissazione, tempo di fissazione limitato e assenza di puntura corneale è stato sviluppato per ridurre al minimo eventuali artefatti di reticolazione/irrigidimento causati dalla fissazione chimica. Come mostrato nella Figura 2B, C, questa fissazione relativamente lieve assicura che il sistema vascolare retinico isolato sia strutturalmente robusto e sufficientemente durevole per la misurazione dell'AFM. Al contrario, i vasi retinici isolati dagli occhi non fissati (utilizzando il metodo ipotonico)4 o gli occhi brevemente fissi (per 8 ore) si frammentano o collassano, rendendoli così inadatti per la misurazione dell'AFM (Figura 2B).
Matrice subendoteliale retinica La rigidità vascolare riflette la rigidità combinata delle cellule vascolari e della membrana basale (matrice subendoteliale)4. Poiché le cellule si adattano alla rigidità della matrice subendo un cambiamento simile nella propria rigidità, un processo chiamato reciprocità meccanica9, rigidità della matrice subendoteliale, diventa un importante determinante della rigidità vascolare complessiva. Per la misurazione della rigidità della matrice, è importante ottenere una matrice subendoteliale omogeneamente densa. Per le EC retiniche umane coltivate in terreno di coltura integrato con acido ascorbico, questo richiede solitamente 10-15 giorni (Figura 3A)4,5,6. Questa differenza nel periodo di coltura può derivare da differenze tra lotti di EC retiniche primarie disponibili in commercio. Inoltre, troviamo generalmente che le EC retiniche disponibili in commercio da topi C57BL/6 depositano una matrice più densa rispetto alla coltura primaria di EC retinica umana, indicando così differenze specie-specifiche. Come mostrato nella Figura 3A, le immagini a contrasto di fase forniscono solo una visione grossolana della matrice su scala macro. Tuttavia, la struttura fibrillare su scala nano-micrometrica diventa evidente nelle immagini a fluorescenza confocale ad alta risoluzione della matrice immunomarcate con anticorpi contro le proteine strutturali della matrice collagene IV e fibronectina (Figura 3B). Va notato che queste proteine della matrice forniscono anche spunti istruttivi alle cellule endoteliali legandosi a specifici recettori delle integrine9.
Misurazione della rigidità AFM La selezione della rigidità a sbalzo appropriata (costante della molla, k) e della dimensione della sonda è essenziale per misurazioni affidabili e sensibili. Questi parametri devono essere scelti in modo che corrispondano alla rigidità e alle dimensioni del campione biologico. Dopo che il cantilever selezionato è stato montato sull'AFM, il raggio laser a infrarossi deve essere focalizzato sulla punta del cantilever e il punto laser riflesso deve essere centrato sul fotorilevatore. Questo allineamento laser garantisce un rilevamento preciso e sensibile della deflessione a sbalzo e, di conseguenza, la misurazione della rigidità. Una misurazione della rigidità AFM inizia con il piezo z che sposta il cantilever verticalmente verso il basso verso il campione. In questo momento non c'è deflessione a sbalzo, il che produce una linea di base piatta della curva di avvicinamento (Figura 4A). Quando la sonda a sbalzo entra in contatto con il campione e lo rientra, il cantilever si piega, causando la deflessione del laser sul fotorivelatore, che è rappresentata dalla deflessione verticale della curva di avvicinamento. Dopo aver applicato una forza di indentazione preimpostata (forza di setpoint) sul campione, il cantilever si ritrae nella posizione iniziale (altezza target Z) lontano dal campione. La curva di retrazione deviata viene quindi adattata al modello di Hertz/Sneddon per calcolare il modulo di Young (rigidità) del campione.
Dalla misurazione rappresentativa dell'indentazione della forza mostrata nella Figura 4, è chiaro che le curve di avvicinamento e retrazione ottenute da un capillare retinico isolato da un topo diabetico (Figura 4B) sono sostanzialmente più ripide di quelle ottenute da un topo non diabetico (Figura 4A). La pendenza più ripida delle curve di indentazione della forza indica una maggiore deflessione a sbalzo causata da una maggiore resistenza del campione all'indentazione della forza, che riflette una maggiore rigidità del campione13. Infatti, la successiva analisi dei dati delle curve di indentazione delle forze multiple ha rivelato che i capillari retinici dei topi diventano significativamente più rigidi nel diabete4. Va inoltre notato che il contatto tra la sonda a sbalzo e i campioni biologici spesso provoca un'adesione superficiale aspecifica, che porta a una deflessione negativa a sbalzo durante la retrazione, come si vede dall'estensione della curva di retrazione oltre la linea di base (Figura 4B). Inoltre, i campioni biologici come cellule, matrice e vasi sanguigni sono viscoelastici per natura e quindi possono subire una deformazione permanente e/o un cambiamento nella rigidità apparente a seguito dell'indentazione della forza. In tal caso, ciò si rifletterà nel disallineamento delle curve di avvicinamento e di retrazione (isteresi). In effetti, il confronto tra la Figura 4A e la Figura 4B conferma la tendenza prevista in cui l'indentazione della forza dei capillari più morbidi nei topi non diabetici produce un'isteresi maggiore rispetto a quella osservata nelle loro controparti più rigide. Come precedentemente riportato 5,6, anche la rigidezza (modulo di Young) delle matrici subendoteliali ottenute da colture di EC retinica viene calcolata nel modo sopra menzionato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione schematica dell'incisione praticata su un occhio di topo per l'isolamento della retina. Usando una pinzetta per tenere il nervo ottico, un bisturi viene utilizzato per praticare un'incisione completa posteriormente al limbus per separare la retina del topo dal cristallino e dalla camera anteriore. La linea tratteggiata viola mostra la posizione dell'incisione verticale. Questo schema è stato disegnato utilizzando un software scientifico di immagini e illustrazioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> Figura 2: Ottimizzazione del protocollo per l'isolamento di vasi retinici di topo intatti per la misurazione dell'AFM. (A) L'immagine stereoscopica mostra una retina intatta isolata da un occhio di topo leggermente fissato prima delle fasi di isolamento capillare. Barra della scala: 2 mm. (B) Immagini rappresentative a contrasto di fase con ingrandimento 4x mostrano i vasi retinici di topo ottenuti utilizzando i diversi metodi di isolamento. Confrontando l'integrità strutturale e la durata dei vasi isolati, la digestione della tripsina delle retine da occhi enucleati fissati in formalina al 5% per 24 ore a 4 °C (riquadro rosso) è risultata produrre la vascolarizzazione retinica più adatta per la misurazione della rigidità AFM. I vasi retinici isolati con questo metodo mostravano una chiara rete vascolare che si diffondeva uniformemente lungo la superficie del vetro. Barra della scala: 500 μm. (C) La visione ad alto ingrandimento (20x) di una rete capillare retinica intatta, simile a quella mostrata in (B), conferma l'elevata integrità strutturale dei capillari ottenuti da occhi leggermente fissati. Barra di scala: 100 μm. Questa cifra è stata modificata da4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> Figura 3: Matrici decellularizzate ottenute da colture primarie di REC umane e muvine. (A) Immagini rappresentative a contrasto di fase con ingrandimento 20x che mostrano aggregati di matrice subendoteliale su vetrini coprioggetti dopo la decellularizzazione di colture di 10 giorni (10 giorni) o 15 giorni (15 giorni) di REC umane o tovine. Barra della scala: 100 μm. (B) Immagini rappresentative a fluorescenza confocale ad alto ingrandimento (100x) di matrici decellularizzate ottenute da colture di REC umane 15 giorni e marcate con anticorpi anti-collagene IV e anti-fibronectina rivelano un denso collagene nanofibrillare IV e matrice di fibronectina. Barra della scala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> Figura 4: Curve di distanza della forza dalla misurazione della rigidità AFM dei capillari retinici di topo. I grafici a linee indicano un approccio rappresentativo (colore chiaro) e una curva di retrazione (colore scuro) da una singola misurazione dell'indentazione della forza in una posizione di un topo capillare retinico isolato da un topo (A) non diabetico o (B) diabetico. Le curve di forza ottenute utilizzando una sonda a sbalzo emisferica SAA-SPH con raggio di 1 μm, tracciano la relazione tra la distanza cantilever-campione (controllata dallo z-piezo) e la forza verticale applicata che provoca la deflessione a sbalzo. (A) La freccia gialla indica l'avvicinamento a sbalzo guidato da piezo-z verso il campione, la freccia bianca indica il punto di contatto in cui la sonda a sbalzo entra in contatto con il campione e la freccia verde indica la deflessione a sbalzo fino a una forza di indentazione di setpoint (picco) (*). (B) Sia le curve di approccio che quelle di retrazione ottenute da un capillare retinico isolato da topi diabetici mostrano una pendenza marcatamente più ripida rispetto a quelle delle loro controparti non diabetiche (mostrate in A), il che indica una maggiore rigidità capillare nei topi diabetici. La punta della freccia indica un calo della curva di retrazione al di sotto della linea di base, che riflette la deflessione negativa della sonda a sbalzo causata dall'adesione tra la sonda e il campione durante l'indentazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Recentemente abbiamo identificato l'irrigidimento capillare retinico come un nuovo paradigma per la disfunzione retinica associata al diabete. Questo protocollo elabora le fasi per l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale da colture endoteliali retiniche, seguite da una descrizione della tecnica di misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica.

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that ...

isolation-mouse-retinal-capillaries-subendothelial-matrix-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La rigidità della matrice extracellulare influenza fortemente i comportamenti multipli di cellule aderenti. Matrice di rigidezza varia spazialmente in tutto un tessuto, e subisce modifiche nelle condizioni patologiche diverse. Qui sviluppare metodi per la caratterizzazione variazioni spaziali della rigidità nei tessuti del mouse normale e fibrotica del polmone mediante microscopia a forza atomica micropenetrazione.

Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Presentiamo protocolli dettagliati per l'isolamento delle aorte dal topo e la misurazione del loro modulo elastico utilizzando la microscopia a forza atomica.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Presentiamo un metodo per studiare i primi cambiamenti osteoartritici a livello cellulare nella cartilagine articolare utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM).

Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Presentiamo un protocollo per misurare i moduli elastici di aree ricche di collagene in fegato normale e malato utilizzando la microscopia a forza atomica. L'uso simultaneo della microscopia a polarizzazione fornisce un'elevata precisione spaziale per localizzare aree ricche di collagene nelle sezioni del fegato.

Misurazione della rigidità epatica mediante microscopia a forza atomica accoppiata con microscopia a polarizzazione

Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

L'effetto di rigidità substrati sulla funzione cellulare può essere...

Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell'occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l'auto-rinnovamento e multipotenzialità.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

L'attacco dei virioni a una superficie è un requisito per l'imaging a virione singolo mediante imaging a fluorescenza a super risoluzione o microscopia a forza atomica (AFM). Qui dimostriamo un metodo di preparazione del campione per l'adesione controllata di virioni a superfici di vetro adatte all'uso nell'AFM e nell'imaging a fluorescenza a super risoluzione.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l'espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

Impara l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per misurare la rigidità mediante microscopia a forza atomica. Questo metodo aiuta a studiare la meccanobiologia vascolare nella retinopatia diabetica.

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Esplora altri video