Name: Applicazione del DNA Barcoding per identificare le piante medicinali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Scopri l'applicazione del DNA barcoding per l'identificazione accurata delle piante medicinali, utilizzando Angelica sinensis come caso di studio. Questo metodo migliora il controllo qualità e l'autenticazione delle specie.

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<meta charset="utf8"></head><body>DNA Barcoding per piante medicinali: identificazione e analisi filogenetica

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<table><tbody><tr><td>Kit di estrazione rapida del DNA genomico delle piante CTAB</td><td>Shanghai Huiling Biotechnology Co.</td><td>NG411M</td><td>Adatto per l'estrazione rapida di DNA genomico di alta qualità da diversi tessuti di un'ampia gamma di piante</td></tr><tr><td>DL5000 Marcatore DNA</td><td>Nanjing vazyme Bio-technology Co.</td><td>MD102-02</td><td>Prodotto pronto all'uso, prelevare una quantità appropriata di questo prodotto direttamente per l'elettroforesi durante l'esecuzione del gel.</td></tr><tr><td>Elettroforesi</td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co.</td><td>DYY-6C</td><td>Adotta il design del touch screen, può visualizzare la tensione impostata, impostare la corrente allo stesso tempo, l'uscita parallela</td></tr><tr><td>Acido etilendiammintetraacetico</td><td>BeijingpsaitongBiotechnologyCo., Ltd</td><td>E70015-100G</td><td>Reagenti per formulazione tampone di isolamento nucleare.</td></tr><tr><td>Colorazione in gel di acido nucleico Goldview (10.000 volte)</td><td>Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>10201ES03</td><td>Quando si utilizza l'elettroforesi su gel di agarosio per rilevare il DNA, si lega al DNA e produce un forte segnale fluorescente.</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo ad alta velocità</td><td>Changsha Zona di sviluppo industriale ad alta tecnologia Xiangyi Centrifuga Instrument Co.</td><td>H1650</td><td>Per una separazione rapida ed efficiente dei campioni, questa centrifuga compatta e leggera offre una sicurezza affidabile</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti ad alta produttività</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co.</td><td>Tiss-48</td><td>Uno strumento di vibrazione ad alta frequenza per la macinazione di campioni</td></tr><tr><td>http://www.gpgenome.com/</td> <td>Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics</td><td></td> <td>database include sequenze genomiche, set di geni, genomi di organelli, dati genomici a bassa copertura e sequenze di codici a barre del DNA.</td></tr><tr><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/</td> <td>U.S. National Library of</td> <td>Medicine-Il</td> <td>National Center for Biotechnology Information fa progredire la scienza e la salute fornendo l'accesso alle informazioni biomediche e genomiche.</td></tr><tr><td>Kylin-Bell</td><td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.</td><td>VORTEX-5</td><td>Miscelazione rapida sotto forma di vortice ad alta velocità, velocità di miscelazione, uniformità, completezza</td></tr><tr><td>LifeTouch</td><td>Hangzhou BORI Technology Co.</td><td>TC-96/G/H(b)B</td><td>Adozione di una tecnologia di refrigerazione termoelettrica avanzata e di una tecnologia TAS di nuova creazione per migliorare le sue prestazioni complessive</td></tr><tr><td>Sistema di analisi delle immagini su gel</td><td>multifunzionale Centro operativo sud-ovest di Shanghai Tianneng Life Science Co.</td><td>Tanon-Mini Space 2000</td><td>Esegue esperimenti di amplificazione genica rapida con una funzione di gradiente per la mappatura delle condizioni di amplificazione e un intervallo di temperatura del gradiente fino a 30 gradi; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pechino Solarbio Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.</td><td>S8210-100</td><td>Reagenti per formulazione tampone di isolamento nucleare.</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Genes Ltd.</td><td>ND ONE</td><td>Quantifica campioni di DNA, RNA e proteine in pochi secondi con solo 1-2 &micro; L del campione</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone</td><td>Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd</td><td>S30268-500g</td><td>Reagenti per formulazione tampone di isolamento nucleare.</td></tr><tr><td>Fabbricatore di ghiaccio a fiocco di neve</td><td>Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.</td><td>ZX-60X</td><td>Adottando il metodo di produzione del ghiaccio per estrusione rotativa, la velocità di produzione del ghiaccio veloce e l'alta efficienza della produzione di ghiaccio</td></tr><tr><td>Perline in acciaio inossidabile per omogeneizzatore di tessuti</td><td>Beyotime Biotechnology.</td><td>F6623</td><td>Apparecchiatura per la macinazione e la miscelazione di tessuti e altri campioni mediante vibrazione</td></tr><tr><td>Tris Acetato-EDTA tampone</td><td>Beyotime Biotech Inc</td><td>ST716</td><td>TAE è un tampone comunemente usato per l'elettroforesi del DNA, spesso impiegato nell'elettroforesi su gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pechino Solarbio Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.</td><td>T8230</td><td>Reagenti per formulazione di tampone di isolamento nucleare.</td></tr><tr><td>Bollitore a bagnomaria</td><td>Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.</td><td>DK-8D</td><td>Termostato preciso e regolazione della temperatura, controllo della temperatura accurato e affidabile</td></tr> <tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Shanghai Eon Chemical Technology Co.</td><td>R054186-100 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Reagenti per formulazione tampone di isolamento nucleare.</td></tr></tbody></table>

applicazione del dna barcoding per identificare le piante medicinali

Application of DNA Barcoding to Identify Medicinal Plants

Qualità del DNA del campione
L'intervallo dei rapporti di assorbanza OD260/OD280 era 1,80-1,84. La quantità di DNA misurata dallo spettrofotometro per ciascun campione era superiore a 100 ng/μL (Tabella 3), indicando una buona qualità dell'estrazione del DNA del campione. Ciò indica che i campioni non sono stati contaminati da proteine, RNA o reagenti durante il processo di estrazione e che erano di buona qualità e adatti all'amplificazione PCR a valle.
Analisi PCR
L'elettroforesi su gel è stata eseguita sul prodotto PCR dei tre campioni sperimentali paralleli. La configurazione era: Marker, campioni 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) e controllo negativo (0), come mostrato nella Figura 3. Le dimensioni di AS-1, AS-2 e AS-3 sono tutte comprese tra 500 bp con bande singole, luminose e chiare, e non ci sono bande nello 0, indicando che il DNA estratto è stato amplificato a 500 bp utilizzando i primer ITS2.
Confronto del database dei risultati del sequenziamento
I risultati del sequenziamento hanno identificato A. sinensis con una somiglianza di sequenza del 100% combinando i risultati dell'identificazione BLAST del database NCBI, che è lo stesso dei risultati dell'identificazione delle specie del database GPGD (Tabella 4). Il risultato BLAST è stato determinato utilizzando il punteggio di identità percentuale più alto e il valore e più basso. L'identificazione delle specie è stata considerata di successo quando la percentuale massima di identità includeva una singola specie e ha ottenuto un punteggio del &gt;99%. Se un punteggio è ≤ 99%, controlla la qualità del file di sequenziamento o se il prodotto PCR è contaminato.
Analisi filogenetica ad albero dell'identificazione delle specie
I risultati hanno mostrato che nell'albero filogenetico costruito del New Jersey, tutte e quattro le specie erano raggruppate in cladi separati, e il P. praeruptorum come outgroup era separato dai cladi di Angelica . Le sequenze di splicing sono state raggruppate con il clade di A. sinensis OR879715.1, e il valore di supporto del clade (bootstrap) era 100, e poi le altre due specie, A. dahurica e A. cartilaginomarginata sono state raggruppate in un clade separato, dimostrando così che le sequenze di splicing erano A. sinensis (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso per l'identificazione delle specie di piante medicinali. (A) Lavorazione delle piante, estrazione del DNA e sequenziamento delle piante medicinali, (B) confronto della sequenza delle specie utilizzando database e (C) utilizzo di alberi filogenetici per la convalida tassonomica per confermare le relazioni filogenetiche tra le specie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro per l'estrazione del DNA delle piante medicinali. (A) L'estrazione del DNA dalle piante medicinali prevede un totale di 6 passaggi. (B) Amplificazione dello strumento PCR e processo di ciclo PCR. (C) Elettroforesi. (D) Sequenziamento con metodo Sanger e cromatogramma di sequenziamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig03.jpg"> Figura 3: Elettroforesi su gel di Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Utilizzando il marcatore di DNA DL5000 come marcatore molecolare, AS-1, AS-2 e AS-3 vengono utilizzati come campioni e 0 come gruppo di controllo. È stata condotta l'elettroforesi su gel e i risultati hanno mostrato che i campioni AS-1, AS-2 e AS-3 avevano tutti bande a 500 bp, mentre il controllo non mostrava bande. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig04.jpg"> Figura 4: Albero filogenetico di unione dei vicini creato da 13 sequenze. Un totale di 10 sequenze di quattro specie vegetali sono state scaricate dal database NCBI e le sequenze di splicing sono state confrontate per analizzare e confrontare la variazione di sequenza intraspecifica e interspecifica e per costruire alberi filogenetici di congiunzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome del materiale/attrezzatura</td>
			<td>dose</td>
		</tr><tr><td>Polivinilpirrolidone</td>
			<td>10 g</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl</td>
			<td>1 M 50 mL</td>
		</tr><tr><td>Acido etilendiamminatetraacetico</td>
			<td>0,5 M 20 mL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>20,45 grammi</td>
		</tr><tr><td>β-mercaptoetanolo</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>acqua deionizzata sterilizzata</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Reagenti per la formulazione di tampone di isolamento nucleare.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Codice a barre</td>
			<td>Abbecedario</td>
			<td colspan="2">Sequenza di primer (5'-3')</td>
			<td colspan="3">Sequenziamento dell'amplificazione PCR</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">ITS2</td>
			<td rowspan="3">R:3R</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">GACGCTTCTCCAGACTACAAT</td>
			<td>94°C</td>
			<td colspan="2">5 minuti</td>
		</tr><tr><td>94°C</td>
			<td>Anni '30</td>
			<td rowspan="3">40cicli</td>
		</tr><tr><td>56°C</td>
			<td>Anni '30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">F:2F</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ATGCGATACTTGGTGTGAAT</td>
			<td>72°C</td>
			<td>45 secondi</td>
		</tr><tr><td>72°C</td>
			<td colspan="2">10 minuti</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Primer di codici a barre del DNA e condizioni di reazione alla PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Campioni</td>
			<td>Estrazione del DNA (ng/μL)</td>
			<td>OD260/OD280</td>
		</tr><tr><td>AS-1</td>
			<td>124</td>
			<td>1.84</td>
		</tr><tr><td>AS-2</td>
			<td>184</td>
			<td>1.81</td>
		</tr><tr><td>AS-3</td>
			<td>164</td>
			<td>1.82</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Angelica sinensis (Oliv.) Diels ha estratto la qualità del DNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Campioni</td>
			<td>Lunghezza sequenza allineata (bp)</td>
			<td>Lunghezza della sequenza di giunzione (bp)</td>
			<td>GC(%)</td>
			<td>NCBI:Percentuale BLAST(%)</td>
			<td>GPGD: Percentuale di identificazione delle specie (%)</td>
		</tr><tr><td>AS-1</td>
			<td>500 punti base</td>
			<td>229 punti base</td>
			<td>55.50%</td>
			<td>100%</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>AS-2</td>
			<td>504 punti base</td>
			<td>229 punti base</td>
			<td>55.50%</td>
			<td>100%</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>AS-3</td>
			<td>499 punti base</td>
			<td>229 punti base</td>
			<td>55.50%</td>
			<td>100%</td>
			<td>100%</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Confronto tra database dei risultati del sequenziamento.

Applicazione del DNA Barcoding per identificare le piante medicinali

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration ...

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