Generazione e caratterizzazione di organoidi dell'utero di ratto da cellule staminali epiteliali dell'endometrio di ratto
2 agosto 2024
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e coltivare cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC), generando organoidi endometriali di ratto. Questo metodo facilita gli studi in vitro delle malattie dell'endometrio, consentendo l'editing genetico e altre manipolazioni cellulari.
La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di un nuovo sistema riproducibile per la coltivazione e l'espansione di organoidi endometriali di ratto da cellule gliali. Affrontando i limiti degli attuali metodi di dispositivi per il tessuto endometriale, miriamo a migliorare il ritmo della ricerca nella biologia riproduttiva delle donne. La nostra ricerca ha proposto un metodo per la coltura di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto. Sulla base di questo metodo, possiamo optare per gli organoidi endometriali di ratto, superando la precedente sfida di dover costruire e misurare i blocchi. Esploreremo potenziali applicazioni, tra cui test farmacologici e editing genetico, che potrebbero contribuire a una migliore comprensione e trattamento della malattia del sistema riproduttivo femminile.
[Narratore] Per iniziare, posizionare il ratto anestetizzato sulla piattaforma chirurgica. Eseguire incisioni longitudinali su entrambi i lati dell'utero per esporre l'endometrio interno. Con una lama di bisturi T10, raschiare l'endometrio fino a quando la superficie non è ruvida. Metti tutti i frammenti di endometrio uterino in un piatto da 3,5 centimetri e lavali tre volte con PBS. Ora, mescola i frammenti di endometrio uterino con tre millilitri di collagenasi all'1% di tipo uno e incuba a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Filtrare il tessuto non digerito utilizzando un colino cellulare da 100 micrometri e raccogliere il filtrato per un'ulteriore coltura. Calcolare il volume della sospensione cellulare necessaria per seminare le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti per ottenere la densità cellulare desiderata. Seminare le cellule raccolte in piastre a 12 pozzetti in terreno REEM per un'ulteriore coltura. Prelevare REESC in coltura con confluenza del 70% e digerire le cellule con tripsina allo 0,25% e un millimolare di EDTA per cinque o sei minuti. Risospendere i REESC in 500 microlitri di matrigel FOD e metterli in piastre a 12 pozzetti. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 20 minuti per consentire la gellificazione. Una volta che la miscela di matrigel cellulare si è solidificata, aggiungere 1,5 millilitri per pozzetto REEM per coprire il matrigel. Per la coltura a lungo termine degli organoidi, aspirare il REEM e aggiungere un millilitro di soluzione di raccolta degli organoidi per 40 minuti per dissociare gli organoidi. Incubare su ghiaccio per mantenere l'integrità dell'organoide. Dopo l'incubazione, raccogliere gli organoidi utilizzando una pipetta da pascolo e centrifugarli a 300 G per tre minuti a quattro gradi Celsius per pellettarli per un'ulteriore lavorazione. Risospendere gli organoidi pellettati in matrigel in un rapporto di uno a due o uno a tre per l'inclusione e la successiva coltura in piastre a 12 pozzetti. Per scongelare gli organoidi congelati, preriscaldare il REEM in un bagnomaria a 37 gradi Celsius e immergere il tubo di brodo congelato nel bagnomaria per scongelare delicatamente gli organoidi. Dopo lo scongelamento, risospendere gli organoidi in 500 microlitri di matrigel per la reinclusione e la coltura in una piastra a 12 pozzetti. Prendi gli organoidi endometriali di ratto in coltura, aspira il REEM dagli organoidi e aggiungi un millilitro di soluzione per la raccolta degli organoidi per dissociare gli organoidi. Incubare su ghiaccio per mantenere l'integrità dell'organoide. Dopo l'incubazione, raccogliere gli organoidi utilizzando una pipetta da pascolo e centrifugarli a 300 G per tre minuti a quattro gradi Celsius per pellettarli per un'ulteriore lavorazione. Risospendere gli organoidi in tre millilitri di REEM preriscaldato e trasferire gli organoidi ri-sospesi in un piatto di 3,5 centimetri. Quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, digerirle con tripsina allo 0,25% e un millimolare di EDTA per cinque o sei minuti.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo riproducibile per l'isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESCs) al fine di generare organoidi endometriali. Questo progresso facilita la ricerca in vitro sulle malattie endometriali, aprendo la strada ad applicazioni nell'editing genico e nei test farmacologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia riproduttiva femminile
- Malattie endometriali
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Limiti dei metodi attuali di coltura dei tessuti endometriali
- Necessità di modelli in vitro migliori
- Importanza della comprensione delle malattie del sistema riproduttivo femminile
Metodi Utilizzati
- Isolamento e coltura di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto
- Organoidi endometriali di ratto come sistema biologico
- Uso della collagenasi per la digestione del tessuto e del matrigel per la coltura
Risultati principali
- Coltura ed espansione efficace di reESC
- Creazione di organoidi endometriali di ratto funzionali
- Potenziale per lo studio di applicazioni nel test farmacologico e nella modifica genica
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo affidabile per la coltura di organoidi endometriali, fondamentale per far progredire la ricerca nella salute riproduttiva.
- Questo protocollo è significativo per gli studi volti a sviluppare trattamenti per le patologie del sistema riproduttivo femminile.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La generazione e l'espansione stabile di organoidi endometriali di ratto a partire da cellule staminali epiteliali colma un'importante lacuna nella modellizzazione preclinica della fisiopatologia endometriale. Questa piattaforma consente un approccio meccanicistico per ridurre i rischi e aumentare la previsione nell'ambito della sperimentazione di ipotesi terapeutiche nella salute riproduttiva femminile. Il modello favorisce una continuità traslazionale dalla fase iniziale di scoperta fino alla valutazione preclinica, in particolare per applicazioni di test farmacologici e di editing genico.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biotecnologico-farmaceutico
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei meccanismi delle malattie endometriali in un sistema controllato e riproducibile.
- Consente la validazione funzionale di bersagli terapeutici rilevanti per la patologia endometriale.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico modellando la risposta agli ormoni e la polarità epiteliale.
- Fornisce una piattaforma per l'esplorazione basata su ipotesi della funzione genica nella biologia endometriale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema standardizzato ed espandibile di organoidi per lo screening di composti e la profilazione della risposta ai farmaci.
- Garantisce riproducibilità e scalabilità per lo sviluppo di saggi quantitativi.
- Permette la preparazione di sistemi biologici validati per flussi di lavoro di screening successivi.
- Consente una valutazione affidabile di terapie sperimentali in un contesto tissutale rilevante per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla modellizzazione pertinente alle malattie per la scoperta traslazionale di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalla scoperta in vitro alla validazione preclinica in sistemi mammiferi.
- Riduce il rischio traslazionale simulando patologie come adesioni intrauterine nei ratti.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio per portafogli in ambito salute riproduttiva.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma di organoidi si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una validazione precoce del bersaglio, lo sviluppo di saggi e la ricerca traslazionale in modelli di malattie endometriali.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici nella biologia del tessuto endometriale.
- Screening: Fornisce organoidi pronti per saggi, riproducibili, per la valutazione di composti e test farmacologici.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa della risposta ormonale e delle caratteristiche epiteliali.
- Ricerca Translazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici rilevanti per la salute femminile.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile e scalabile per la ricerca e sviluppo continua in biologia riproduttiva.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle malattie endometriali.
- Valore operativo: Standardizza la generazione e l'espansione di organoidi per ottenere risultati riproducibili tra diversi studi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale nei programmi precoci di salute riproduttiva.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione dei candidati terapeutici mirati ai disturbi endometriali, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule staminali e nelle tecniche di coltura di organoidi in 3D.
- Richiede l'accesso a mezzi specializzati, matrigel e strumentazione per l'elaborazione dei tessuti.
- Necessita di una standardizzazione tra team per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per l'uso con altre specie di mammiferi o modelli di malattia.
- La stabilità della coltura a lungo termine e la caratterizzazione funzionale devono essere verificate regolarmente.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:12
Processing Rat Uterine Endometrium to Isolate Rat Endometrial Epithelial Stem Cells (reESCs)
2:23
Establishing Rat Endometrial Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells (reESCs) and Their Long-Term Culture
4:13
Transitioning Rat Endometrial Organoids to Adherent Culture
