Name: Generazione e caratterizzazione di organoidi dellutero di ratto da cellule staminali epiteliali dellendometrio di ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Scopri come generare organoidi uterini di ratto da cellule staminali epiteliali dell'endometrio. Questo metodo riproducibile facilita la ricerca sulle malattie endometriali e apre nuove possibilità per test farmacologici e editing genico.

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<ol><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Anti-CD15 (SSEA-1)</td><td>Abcam</td><td>ab135377</td><td>Coniglio, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Recettore degli estrogeni alfa</td><td>Abcam</td><td>ab32063</td><td>Coniglio, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-pan Citocheratina</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>Topo, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Recettore del progesterone</td><td>Abcam</td><td>ab101688</td><td>Coniglio, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab279653</td><td>Mouse, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>A8301</td><td>TargetMol</td><td>909910-43-6</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiolo</td><td>Merck</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il conteggio delle cellule-8</td><td>Beyotime</td><td>C0038</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>BioLegend</td><td>109819</td><td>1:20 (FC), Pacific Blue</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BioLegend</td><td>101806</td><td>1:20 (FC), FITC</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>303120</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td>1:20 (FC), PE</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>TargetMol</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Soluzione per la raccolta di organoidi</td><td>R& D Systems</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 TSA Kit sistema di fluorescenza</td><td>APExBIO</td><td>K1051</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 TSA Kit sistema di fluorescenza</td><td>APExBIO</td><td>K1052</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>369803</td><td>1:20 (FC),</td></tr><tr><td>Kit per sistema di fluorescenza PerCP Fluoresceina TSA</td><td>APExBIO</td><td>K1050</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Capra Anticorpo IgG/HRP anti-coniglio</td><td>APExBIO</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix</td><td>Takara</td><td>RR063A</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Merck</td><td>57-83-0</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rat&nbsp;</td><td>Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>BioLegend</td><td>323047</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>TB Verde Veloce qPCR Mix</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>TriZOL</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>u-Slide Piastre a 8 pozzetti</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TargetMol</td><td>146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>qPCR primer di geni bersaglio&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genes</td><td>Company</td><td>Sequences</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACATGCCGCCTGGAGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH R</td><td>Sangon biotech</td><td>AGCCCAGGATGCCCTTTAGT</td><td></td></tr><tr><td>rat Nanog F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACTAGCAACGGCCTGACTCA</td><td></td></tr><tr><td>ratto Nanog R&nbsp;</td><td>Sangon biotech</td><td>CTGCAATGGATGCTGGGATA</td><td></td></tr><tr><td>rat Sox2 F</td><td>Sangon biotech</td><td>ATTACCCGCAGCAAAATGAC</td><td></td></tr><tr><td>rat Sox2 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>rat Oct4 F</td><td>Sangon biotech</td><td>CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA</td><td></td></tr><tr><td>rat Oct4 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione e caratterizzazione di organoidi dell'utero di ratto da cellule staminali epiteliali dell'endometrio di ratto

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

Le reESC e gli organoidi dell'utero di ratto sono stati stabiliti da sei femmine di ratto Sprague-Dawley di peso compreso tra 200 g e 250 g seguendo il protocollo delineato nella Figura 1. Attingendo al successo della coltura a lungo termine di cellule staminali epiteliali endometriali umane, la formulazione di REEM consisteva prevalentemente in Y27632, A8301 e CHIR99021. Per stabilizzare le reESC in vitro, abbiamo inizialmente isolato le cellule endometriali dall'endometrio di ratto utilizzando tecniche enzimatiche e meccaniche. L'analisi della citometria a flusso nella Figura 2A ha rivelato che le cellule endometriali primarie comprendevano circa il 50% di cellule epiteliali che esprimono CD9 (49,8%), con bassi livelli di EpCAM (4,49%) e CD24 (2,64%). Il marcatore SSEA-1 per le reESC era presente al 6,58%, mentre i marcatori endoteliali CD31 (30,9%) e CD45 (70,3%) erano relativamente alti.
Tuttavia, la coltura in REEM ha portato a reESC P1 che mostrano una morfologia uniforme a spirale o poliedrica e formano strutture clonali compatte (Figura 2D). La graduale rimozione di singoli fattori da REEM ha portato a una corrispondente diminuzione della capacità proliferativa delle reESC. Il saggio di formazione dei cloni ha evidenziato il ruolo critico di Y27632 nella coltura stabile di reESC (Figura 2B, C). Al terzo passaggio, le reESC hanno mostrato un'espressione coerente di SSEA-1 e citocheratina, indicando una forte espansione delle reESC primarie durante la coltura (Figura 2F). Inoltre, le reESC hanno mantenuto una capacità proliferativa robusta e stabile anche nei passaggi tardivi (Figura 2E), dimostrando il loro successo nell'isolamento e nell'espansione nell'attuale sistema REEM.
Le colture di organoidi sono state stabilite seguendo un sistema precedentemente riportato derivato da cellule staminali endometriali umane8. Entro 3 giorni, le reESC hanno mostrato una rapida auto-organizzazione in strutture organoidi con un centro cavo, che successivamente sono aumentate di dimensioni e spessore (vedi Figura 3A). I tipici risultati della colorazione HE che illustrano la formazione di organoidi da parte delle reESC sono presentati nella Figura 3B. Queste colture di organoidi possono essere sostenute attraverso il passaging, come evidenziato dall'elevata vitalità cellulare indicata dalla colorazione Ki67 dopo sia il passaggio diretto che i cicli di congelamento-scongelamento. Inoltre, la colorazione HE è stata eseguita sulla decima generazione di organoidi e i risultati hanno mostrato che la struttura dell'organoide poteva essere mantenuta intatta (vedi Figura 3E). Inoltre, i risultati della qPCR hanno indicato che Nanog, Sox2 e Oct4 erano espressi a livelli paragonabili a quelli della generazione P1 (Figura 3F). Questa scoperta suggerisce il potenziale per la coltura a lungo termine di organoidi all'interno del sistema attuale.
Il nostro studio ha condotto un'indagine preliminare sulla risposta di strutture simili all'utero di ratto a E2 e P4. La colorazione in immunofluorescenza nella Figura 4A ha rivelato la presenza di recettori per estrogeni e progesterone. Dopo l'integrazione di E2 , questi organoidi hanno subito una transizione da una forma sferica cava a un modello di crescita interna più densamente popolato (Figura 4C). La successiva esposizione al P4 ha portato a una diminuzione della permeabilità delle strutture dense, con conseguente disintegrazione (Figura 4B). Questi risultati suggeriscono che l'E2 potenzialmente guida un'ulteriore differenziazione delle strutture uterine di ratto, mentre il P4 può innescare percorsi apoptotici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Procedure utilizzate per stabilire le cellule staminali epiteliali endometriali di ratto e gli organoidi dell'utero di ratto. Abbreviazione: SD = Sprague-Dawley. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Generazione e coltura a lungo termine di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto in vitro. (A) Analisi citofluorimetrica che mostra la proporzione di cellule positive nell'endometrio di ratto. (B) Colorazione con cristallovioletto di cloni in REEM con o senza A8301, Y27632 o CHIR99021, rispettivamente. Barre di scala = 1 cm. (C) I numeri del clone in REEM con o senza fattori. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard; n = 3 donatori (***, p&lt;0,001). (D) Immagini al microscopio ottico di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto P1 con e senza colorazione cristallovioletto. (E) Analisi CCK-8 di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto al passaggio 1, passaggio 7 e passaggio 14. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard, n = 3. (F) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione di citocheratina e SSEA-1. Abbreviazione: REEM = mezzo di espansione reESC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Generazione e coltura a lungo termine di organoidi endometriali di ratto in vitro. (A) Immagini al microscopio ottico di organoidi endometriali di ratto P1. (B) Colorazione H&amp;E per organoidi P1 da cellule staminali epiteliali endometriali di ratto. (C) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione di citocheratina e SSEA-1. (D) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione di Ki67 e SSEA-1. (E) Colorazione H&amp;E per organoidi di ratto P 10. (F) analisi qPCR per l'espressione di Nanog, Sox2 e Oct-4 in organoidi endometriali di ratto P1 e P10. Espressione normalizzata a GAPDH (n = 3, t-test non accoppiato a due code, n.s. = non significativo). Abbreviazione: H&amp;E = ematossilina ed eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig04.jpg"> 
Figura 4: Coltura sequenziale di organoidi con E2 e P4. (A) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione del recettore degli estrogeni, del recettore del progestinico e di SSEA-1. (B) Panoramica delle immagini al microscopio ottico di organoidi di ratto coltivati in E2 e P4. (C) Le immagini al microscopio ottico dimostrano la trasformazione di una sfera cava in densa all'interno della cavità interna di organoidi dopo essere stati coltivati per 7 giorni in E2. Abbreviazioni: ER = recettore degli estrogeni; PR = recettore del progestinico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Generazione e caratterizzazione di organoidi dell'utero di ratto da cellule staminali epiteliali dell'endometrio di ratto

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

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