Name: Somministrazione costante di virus adeno-associato tramite iniezione laterale della vena di coda in topi adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Impara l'iniezione laterale della vena della coda nei topi adulti per somministrare virus adeno-associato. Questo protocollo ottimizzato facilita la terapia genica per disturbi neuromuscolari.

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Gli autori desiderano ringraziare il personale della struttura per la cura degli animali NINDS per il loro supporto. Questo lavoro è stato supportato dalla Divisione di Ricerca Intramurale del NIH, NINDS (Rapporto Annuale Numero 1ZIANS003129). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Terapie basate su AAV tramite iniezione endovenosa in modelli murini preclinici

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Gli autori non hanno alcuna divulgazione rilevante per il lavoro pubblicato in questo articolo.

Le terapie a base di AAV hanno un grande potenziale per le malattie monogeniche grazie alla versatilità dell'AAV come vettore di terapia genica, che consente di personalizzare gli AAV per soddisfare le varie esigenze di somministrazione di diverse malattie 4,5,7,9. Gli AAV sono comunemente somministrati tramite iniezione endovenosa in modelli murini preclinici per testare la sicurezza e l'efficacia di potenziali terapie16. Poiché diverse dosi iniettate di AAV possono comportare marcate differenze nei risultati sperimentali, è fondamentale che gli sperimentatori siano in grado di iniettare costantemente la dose di AAV prevista per garantire la validità e la robustezza dei dati in vivo generati 28. Le iniezioni endovenose sono ampiamente utilizzate, ma sono tecnicamente impegnative e richiedono una formazione approfondita e una pratica continua per sviluppare e mantenere un livello di abilità che garantisca iniezioni costantemente efficaci 16,17,18,19. Oltre a iniettare correttamente l'AAV, di solito si desidera utilizzare saggi per valutare la biodistribuzione dell'AAV iniettato e l'efficienza di consegna ai tessuti o alle cellule bersaglio29,30.
Questo protocollo mira ad aiutare gli sperimentatori a eseguire facilmente iniezioni endovenose con successo e in modo coerente, descrivendo accuratamente i dettagli di un protocollo di iniezione endovenosa ottimizzato per somministrare AAV in topi di 7-9 settimane non sedati. È importante notare che i topi che sono marcatamente più piccoli o più grandi dei topi di tipo selvatico nella fascia di età qui utilizzata possono presentare una sfida maggiore a causa di una ridotta visibilità delle vene o dell'incompatibilità con i sistemi di contenzione utilizzati in questo metodo. È stato precedentemente riportato che le iniezioni endovenose della coda non sono appropriate per la somministrazione di reagenti per via endovenosa in topi di età inferiore alle 6 settimane a causa delle piccole dimensioni del vaso31. Sebbene possibile, potrebbe essere difficile iniettare costantemente topi di peso inferiore a 22,0 g. con successo. Gli investigatori che utilizzano topi di dimensioni atipiche potrebbero dover apportare adattamenti alla procedura. Questo protocollo delinea anche diversi saggi che possono essere utilizzati per valutare la biodistribuzione e l'efficienza di trasduzione dell'AAV.
Alcuni punti critici devono essere tenuti a mente mentre si segue questo protocollo. Durante l'iniezione, gli aghi da 29 G forniscono una maggiore resistenza se l'ago non si trova all'interno della vena. Ciò riduce il volume perso dall'iniezione perivascolare accidentale della soluzione durante i tentativi di iniezione falliti. Le siringhe da insulina hanno volumi morti inferiori rispetto alle siringhe normali. Se si utilizza una siringa e/o un ago diversi da quelli elencati qui, potrebbe essere necessario preparare un volume di iniezione aggiuntivo nelle fasi del protocollo 1.1.3.3 per tenere conto di un volume di spazio morto maggiore (ad esempio, aggiungere 30 μl alla dose prevista invece di 15 μl).
Se durante l'aspirazione della dose di AAV nella siringa si formano bolle d'aria fini causate dall'aspirazione, tirare lentamente l'iniettato più in alto nella siringa. Questo rimuoverà la maggior parte delle piccole bolle d'aria. Caricare almeno altri 10-15 μl di AAV al volume previsto per l'iniezione. Questo volume aggiuntivo serve a tenere conto di qualsiasi volume che potrebbe essere perso durante l'espulsione di bolle d'aria o potenziali tentativi di iniezione falliti. (ad esempio, se il volume target da iniettare è 150 μL, caricare 165 μL nella siringa (a metà strada tra i segni 160 μL e 170 μL sulla scala graduatoria). Se l'ago è posizionato correttamente all'interno della vena e il volume nella siringa è di 165 μL immediatamente prima del tentativo di iniezione riuscito, erogare il reagente fino a quando non rimangono 15 μL nella siringa (a metà strada tra i segni di 10 μL e 20 μL), erogando così 150 μL (165 μL - 150 μL= 15 μL)). L'allineamento del lume smussato (smusso rivolto verso l'alto) con la scala della siringa consente di tracciare il volume erogato durante l'iniezione.
Alcuni sperimentatori potrebbero preferire posizionare il topo su un fianco in modo che una delle sue vene sia dritta e facilmente accessibile rispetto a un topo in piedi. Tuttavia, la coda di un topo su un lato sarà inclinata ad angoli diversi a seconda delle dimensioni del mouse che richiedono una regolazione dell'angolo di iniezione quando si iniettano topi di dimensioni diverse. Ciò potrebbe influire negativamente sulla coerenza del successo della procedura. Durante i tentativi di pratica iniziali, gli sperimentatori possono provare entrambi gli orientamenti di restrizione del mouse per determinare il loro approccio preferito. Avere il mouse sui piedi consente un accesso rapido e facile a entrambe le vene laterali della coda. Ciò riduce il tempo di trattenuta quando è necessario l'accesso a entrambe le vene in caso di più tentativi di iniezione falliti.
Se si inietta la vena laterale vicino alla base della coda (più vicino al corpo del topo) (soprattutto per i topi di peso >30 g), regolare l'angolo di iniezione da parallelo alla vena a 5°-10° rispetto alla vena poiché la vena alla base della coda è leggermente più profonda di quanto non lo sia distalmente.
I protocolli di digestione dell'RNasi e di controllo della contaminazione da RNA qui elencati sono stati verificati su campioni di DNA isolati da tessuti epatici freschi congelati contenenti un totale di 175-700 ng di acidi nucleici in 20 μL. Il protocollo di digestione della RNasi è stato testato anche su campioni di DNA isolati da tessuti epatici freschi congelati e cellule selezionate con FACS per confermare la presenza del genoma del vettore e del genoma del topo dopo la digestione della RNasi. I risultati sono stati visualizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio dell'amplificazione PCR dell'endpoint degli ampliconi bersaglio.
Seguire la metodologia descritta può ridurre il tempo di formazione e pratica necessario per padroneggiare le iniezioni endovenose e portare a una maggiore velocità di iniezione di successo, che farebbe risparmiare reagenti. Questo protocollo utilizza strumenti semplici e di uso comune senza la necessità di attrezzature o configurazioni avanzate che potrebbero non essere prontamente disponibili. Inoltre, le fasi di iniezione endovenosa qui elencate possono essere applicate a un'ampia gamma di iniettati che devono essere somministrati per via endovenosa, come gli oligonucleotidi antisenso (ASO), con le opportune modifiche apportate alle fasi di preparazione dell'iniettato a seconda dell'iniettato.

Le malattie monogeniche costituiscono l'80% delle malattie rare, che colpiscono complessivamente 300 milioni di individui in tutto il mondo 1,2. Attualmente non esistono terapie curative approvate per la maggior parte di queste malattie rare altamente debilitanti 1,2,3. Tuttavia, i disturbi monogenici sono candidati ideali per le terapie geniche che possono sostituire, integrare, correggere o silenziare i geni disfunzionali 4,5. Attualmente, più vettori sono in fase di sviluppo e utilizzati per fornire terapie geniche a specifici tipi di cellule 4,6. Uno di questi vettori è il virus adeno-associato (AAV). L'AAV è un parvovirus non patogeno che viene sempre più utilizzato come vettore di terapia genica7. Rispetto ad altri vettori virali, l'AAV ha una minore immunogenicità, un minore potenziale di integrazione nel genoma dell'ospite e la capacità di trasdurre in modo efficiente le cellule in divisione e non in divisione in vari tessuti 7,8. Inoltre, sono stati sviluppati diversi approcci per ingegnerizzare e identificare AAV con caratteristiche desiderabili come il tropismo tissutale specifico o l'immunogenicità ulteriormente ridotta, il che migliora notevolmente la versatilità dell'AAV come vettore virale per diverse indicazioni9. Questi fattori hanno reso l'AAV un vettore di terapia genica ampiamente studiato e hanno portato allo sviluppo di molteplici terapie geniche basate su AAV approvate dalla FDA10.
I modelli murini sono comunemente usati per testare potenziali terapie geniche in vivo e comprendere meglio i meccanismi patologici delle malattie monogeniche. Ciò è dovuto alla ricapitolazione dei modelli murini delle patologie di diverse condizioni, alla somiglianza del loro genoma con il genoma umano e alla relativa facilità di manipolazione, manutenzione e generazione dei topi 11,12,13. I test in vivo sono particolarmente importanti quando si studiano disturbi che colpiscono più sistemi o regioni del corpo, come le distrofie muscolari. Per questi disturbi, i test in vitro potrebbero non essere sufficienti per valutare in modo completo la sicurezza, l'efficacia, la farmacocinetica e la farmacodinamica delle terapie destinate a raggiungere diverse regioni del corpo dopo la somministrazione sistemica14.
Varie vie di somministrazione sistemica possono essere utilizzate per somministrare farmaci. Ogni percorso ha i suoi vantaggi, svantaggi e grado di compatibilità con il modello animale e il farmaco oggetto di studio15. L'iniezione endovenosa (IV) della vena di coda laterale è una via comunemente usata per la somministrazione sistemica di AAV nei topi16. Le iniezioni laterali della vena caudale consentono la somministrazione rapida e diretta dell'iniettato nel flusso sanguigno del topo, garantendo un'elevata biodisponibilità del farmaco nella circolazione sistemica17. Richiedono anche strumenti relativamente semplici e comunemente disponibili per essere eseguiti. Tuttavia, principalmente a causa del piccolo diametro della vena caudale e della difficoltà di localizzare la vena, le iniezioni laterali della vena caudale sono tecnicamente impegnative e richiedono un alto grado di abilità e pratica costante per evitare tentativi di iniezione falliti o l'erogazione incompleta della dose 16,17,18,19. Questi possono comportare la perdita di reagenti costosi o risultati imprecisi, soprattutto se l'iniezione incompleta non viene riconosciuta durante l'esecuzione dell'iniezione. La nostra esperienza qui riassunta si basa su protocolli riportati in articoli ben documentati che abbiamo adattato per il nostro utilizzo, ottimizzando vari passaggi della procedura di iniezione laterale della vena di coda per garantire iniezioni costantemente di successo 20,21,22,23,24,25,26,27.
Qui, descriviamo questo protocollo dettagliato e ottimizzato di iniezione della vena di coda laterale per somministrare AAV in topi di 7-9 settimane non sedati utilizzando strumenti semplici e comunemente disponibili. Inoltre, forniamo i protocolli per i metodi utilizzati per valutare la somministrazione e la biodistribuzione di AAV. Questi protocolli coprono la raccolta dei tessuti dopo l'iniezione, la fissazione dei tessuti, l'estrazione del DNA e la quantificazione del genoma del vettore della reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR) per genoma diploide (vg/dg). Il protocollo di iniezione endovenosa e i suggerimenti forniti qui mirano a migliorare la facilità di esecuzione con successo delle iniezioni laterali della vena di coda. Ciò contribuirà potenzialmente a ridurre il tempo necessario per padroneggiare le abilità di iniezione, migliorando contemporaneamente l'accuratezza e la coerenza delle iniezioni.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m siringa filtrante</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da insulina da 0,3 mL con ago da 29G</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga da 1,7 mL</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x tamponato con fosfato soluzione salina (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Utilizzato per preparare 1x PBS per la fissazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per provetta conica da 15 mL Fonti</td><td>multiple</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico a prova 190</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>Utilizzato per preparare l'etanolo al 70%</td></tr><tr><td>1x PBS sterile</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide (PFA) al 4% di microscopia</td> <td>elettronica Sciences</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Virus adeno-associato (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>DNA a filamento singolo (ssDNA) AAV è stato confezionato per fornire Cre ricombinasi come transgene guidato dal promotore del CMV</td></tr><tr><td>Tampone alcolico</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per lisi a perline</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td> enzima di <td></td></tr><tr><td>restrizione BsuRI (HaeIII)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Topi derivati da Ai14 Next Advance BBX24B derivati da Ai14 del ceppo JAX 007914 (patrimonio genetico: C57BL/6J)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>I topi contenenti l'allele Ai14 Cre-reporter sono stati acquistati da JAX (numero di catalogo: 007914)</td></tr><tr><td>Tamponi assorbenti monouso</td><td>Fisherbrand</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Pinze per dissezione Fine Science Tools (F.S.T)11251-35 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di degradazione del DNA (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A per estrazione del DNA</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Per la digestione dell'RNA durante l'estrazione dell'acido nucleico</td></tr><tr><td>RNasi libera da DNasi per la pulizia del DNA</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td> 11119915001 Per la digestione dell'RNA dopo <td>l'acido</td><td>nucleico kit</td></tr><tr><td>PCR sonda dPCR</td> di estrazione <td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>software dPCR&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Suite software QIAcuity&nbsp;</td></tr><tr><td>Piattaforma rialzata</td><td>Fonti multiple</td><td>N/A</td><td>Una scatola vuota di puntali per pipette è stata utilizzata per sollevare il sistema di ritenuta del topo durante il riscaldamento della coda</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Fonti</td><td>multiple</td><td>N/A</td><td>Modello utilizzato qui: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Software per microscopio a fluorescenza&nbsp;</td><td>Fonti multiple&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Software utilizzato qui: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Garza</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore metallico</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>Metilbutano</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>Qualità dell'acqua di grado molecolare</td><td></td><td>Biologico 351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per tubi per topi</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuga Myfuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore a reazione a catena della polimerasi</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories</td><td>1851148 Modello: C1000</td></tr><tr><td>Touch Salviette di precisione</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR Nanopiastra 26k 24 pozzetti</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One sistema dPCR</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood & Kit di tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Utilizzato per l'estrazione del DNA dai tessuti</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Utilizzato per la pulizia del DNA genomico e l'isolamento del DNA da piccoli volumi di sangue prtocotol è stato utilizzato per l'estrazione del DNA da cellule selezionate FACS</td></tr><tr><td>Cono di contenimento per roditori</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Scala</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di polistirolo</td><td>Fonti multiple</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Detergente e disinfettante per superfici</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fonti multiple</td><td>N/A Pinze</td><td></td></tr><tr><td>di trasferimento</td><td>Strumenti di scienza fine (FST)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger & Azienda</td><td>22220A</td><td>Modello: Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

somministrazione costante di virus adeno-associato tramite iniezione laterale della vena di coda in topi adulti

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

Molti disturbi colpiscono più organi o coinvolgono diverse regioni del corpo, quindi è fondamentale somministrare terapie a livello sistemico per colpire le cellule colpite situate in siti diversi. L'iniezione endovenosa è una via di somministrazione sistemica ampiamente utilizzata negli studi preclinici che valutano i trattamenti destinati alla somministrazione in tutto il corpo. Nei topi adulti, comporta la somministrazione endovenosa dell'agente terapeutico nelle vene laterali della coda del topo. Una volta padroneggiate, le iniezioni della vena caudale sono sicure e veloci e richiedono solo strumenti semplici e comunemente disponibili. Tuttavia, le iniezioni della vena caudale sono tecnicamente impegnative e richiedono una formazione approfondita e una pratica continua per garantire l'erogazione accurata della dose prevista.
Qui descriviamo un protocollo di iniezione della vena di coda laterale dettagliato e ottimizzato che abbiamo sviluppato sulla base della nostra esperienza e delle raccomandazioni precedentemente riportate da altri gruppi. Oltre ai sistemi di contenzione per topi e alle siringhe per insulina, questo protocollo richiede solo reagenti e attrezzature prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori. Abbiamo scoperto che seguendo questo protocollo si ottiene una somministrazione endovenosa costantemente efficace di virus adeno-associato (AAV) nelle vene caudali di topi non sedati di 7-9 settimane. Inoltre, descriviamo i protocolli ottimizzati per la rilevazione istologica delle proteine reporter fluorescenti e la quantificazione del genoma del vettore per genoma diploide (vg/dg) utilizzati per valutare la trasduzione e la biodistribuzione dell'AAV. L'obiettivo di questo protocollo è aiutare gli sperimentatori a eseguire facilmente iniezioni di vena caudale con successo e costanza, il che può ridurre il tempo di pratica necessario per padroneggiare la tecnica.

Topi maschi di età compresa tra sette e nove settimane sono stati iniettati con AAV tramite iniezione laterale della vena di coda a 1,5 × 1012 vg/topo erogati in 150-200 μL di volume iniettato. L'ssDNA AAV utilizzato qui ha fornito il transgene Cre ricombinasi guidato dal promotore del CMV. I topi iniettati erano omozigoti per l'allele Cre reporter Ai14. Quando esposte alla Cre ricombinasi, le cellule contenenti l'allele Ai14 esprimono la proteina fluorescente tdTomato. Poiché l'espressione di tdTomato è causata dalla ricombinazione genomica indotta da Cre, le cellule che esprimono tdTomato indicano cellule che sono state trasdotte direttamente dall'AAV o erano cellule progenie di cellule trasdotte. I dati qui riportati sono di topi iniettati con AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg/topo somministrati in 160 μl (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). I topi sono stati sacrificati 28 giorni dopo l'iniezione e i tessuti sono stati raccolti come descritto sopra. Alcuni muscoli scheletrici e lobi del fegato sono stati digeriti e le loro cellule sono state raccolte utilizzando FACS. Alcuni lobi del fegato sono stati congelati immediatamente utilizzando metilbutano prerefrigerato per l'estrazione dell'acido nucleico. Alcuni muscoli scheletrici e lobi epatici sono stati fissati e congelati per l'imaging istologico del tdTomato fluorescente. tdTomato è stato espresso diffusamente in tutto il fegato (Figura 2A) e nel quadricipite (Figura 2C), indicando che AAV9 ha ampiamente raggiunto e trasdotto diverse regioni di entrambi i tessuti.
Il DNA estratto da fegato fresco congelato e cellule selezionate con FACS è stato utilizzato per quantificare vg/dg utilizzando la dPCR. La quantificazione Vg/dg può essere utilizzata per valutare la consistenza dell'iniezione e l'efficienza di trasduzione di AAV nel campione analizzato. Per garantire la validità del test sono stati utilizzati i grafici a dispersione di gocce 1D dal campione di tessuto epatico fresco congelato e le cellule selezionate da FACS (Figura 3A, C). Il grafico a dispersione ha mostrato la presenza di partizioni positive e negative, una chiara separazione tra le partizioni positive e negative che consente una determinazione accurata della soglia di rilevamento e la presenza di poche goccioline tra le partizioni positive e negative, che possono ridurre l'accuratezza del test dPCR. Il soddisfacimento di tutti questi criteri ha indicato che i risultati del test dPCR erano validi. Il numero di copie del gene Polr2a in ciascun campione è stato quantificato per determinare il numero di genomi diploidi di topo (2 copie del gene Polr2a /genoma diploide di topo) e sono stati utilizzati primer/sonda contro la sequenza del transgene Cre ricombinasi per quantificare il genoma virale (1 copia del transgene/genoma virale, Tabella 1). Il valore vg/dg è stato quantificato per il campione di tessuto epatico fresco congelato e per le cellule selezionate con FACS e ha mostrato la presenza di 187,7 vg/dg e 4,7 vg/dg in ciascun campione, rispettivamente (Figura 3B, D). Come controlli negativi sono stati utilizzati campioni di topi iniettati con PBS e controlli non modello privi di acidi nucleici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica della stazione di iniezione endovenosa. (A) Strumenti necessari per eseguire l'iniezione endovenosa. Qui sono mostrati (1) il timer, (2) il sistema di ritenuta del tubo del topo, (3) i coni di contenimento in plastica non tagliati e (4) tagliati, (5) il tampone imbevuto di alcol, (6) la scatola vuota dei puntali delle pipette utilizzata come piattaforma per sollevare il sistema di contenimento del tubo del topo, (7) i tamponi assorbenti monouso, (8) la provetta conica da 15 ml con acqua calda, (9) il supporto della provetta da 15 ml, (10) la garza e (11) la siringa da insulina. (B) Il topo viene prima posizionato all'interno del fermatubi. Quindi, il cono di contenimento tagliato viene inserito per creare un manicotto di contenimento attorno al mouse, se il mouse è troppo piccolo per essere trattenuto solo dal fermatore del tubo. Assicurarsi che la respirazione del mouse non sia ostruita dai sistemi di ritenuta. Il sistema di ritenuta del tubo è posizionato sulla parte superiore della piattaforma rialzata per consentire il posizionamento della coda del topo in acqua calda. (C) Posizionamento della coda del mouse e angolo di tenuta dell'ago immediatamente prima di eseguire l'iniezione. Tira indietro la coda in modo che la coda sia tesa e il sito di iniezione sia completamente orizzontale. L'ago è parallelo alla coda e alla vena e lo smusso è rivolto verso l'alto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figura 2: Rilevamento della proteina reporter fluorescente dopo l'iniezione IV. Topi maschi di età compresa tra sette e nove settimane che ospitavano l'allele Cre reporter Ai14 sono stati iniettati per via endovenosa con AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg/topo somministrati in 160 μl (5,8-5,9 × 10,13 vg/kg) o PBS. Immagini di fluorescenza rappresentative di sezioni di fegato o quadricipite (C) di topo dopo AAV9 che eroga l'iniezione di Cre IV. (B) Le sezioni del fegato o (D) del quadricipite di topi iniettati con PBS sono state sottoposte a imaging per fungere da controlli negativi. I tessuti sono stati raccolti e fissati congelati 28 giorni dopo l'iniezione endovenosa. Dopo l'esposizione a Cre, la proteina fluorescente tdTomato è espressa nelle cellule trasdotte e nelle cellule progenie delle cellule trasdotte. Le sezioni spesse 10 μm sono state riprodotte con un ingrandimento 10x. Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figura 3: Quantificazione del genoma vettoriale per genoma diploide (vg/dg). Grafico a dispersione 1D della quantificazione dei genomi dei vettori dPCR in (A) tessuto epatico o (C) cellule selezionate FACS raccolte da topi iniettati con AAV9-CMV-Cre o PBS. I grafici a dispersione mostrano le partizioni dPCR positive e negative, nonché la soglia di rilevamento indicata dalla linea orizzontale che attraversa i campioni. Quantificazione (B,D) vg/dg dopo aver quantificato i genomi diploidi di topo e i genomi vettori in (B) tessuto epatico o (D) campioni di cellule selezionate FACS. I risultati mostrati qui provengono da un singolo topo iniettato con AAV9 e da un singolo topo iniettato con PBS con un duplicato tecnico di dPCR per ciascun topo. Le barre di errore indicano l'intervallo di confidenza del 95% per ogni campione. Abbreviazioni: NTC= Controllo non modello; dPCR = PCR digitale; FACS = smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Abbecedario</td>
			<td>Sequenza</td>
		</tr><tr><td>Primer Cre forward</td>
			<td>CTGACGGTGGGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Primer inverso Cre</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Sonda Cre </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Primer in avanti Polr2a </td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Primer inverso Polr2a </td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Sonda Polr2a </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Sequenze di primer e sonde utilizzate per la quantificazione vg/dg. I primer e la sonda Cre sono stati utilizzati per quantificare il genoma del vettore. I primer e la sonda Polr2a sono stati utilizzati per quantificare il genoma diploide del topo.

Qui descriviamo in dettaglio un protocollo ottimizzato per l'iniezione laterale della vena di coda nel topo per somministrare sistemicamente il virus adeno-associato (AAV) nei topi adulti. Inoltre, descriviamo i protocolli dei saggi comunemente usati per valutare la trasduzione di AAV.

Somministrazione costante di virus adeno-associato tramite iniezione laterale della vena di coda in topi adulti

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Li, D., et al. Iniezione intratecale diretta di virus adeno-associati ricombinanti in topi adulti. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per l'iniezione intratecale di virus adeno-associati (AAV) nel liquido cerebrospinale (CSF) di un topo sveglio, coprendo la preparazione della siringa, l'allineamento spinale e l'inserimento preciso dell'ago. Questo metodo convalida la somministrazione genica mirata, supportando il suo potenziale per le terapie del SNC.

Somministrazione intratecale di virus in un modello murino per il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale

Fonte:Pourshafie, N., et al. Somministrazione sistemica di microRNA utilizzando il sierotipo 9 del virus adeno-associato ricombinante per il trattamento delle malattie neuromuscolari nei roditori. J. Vis. Exp. (2018).In questo video, un topo affetto da atrofia muscolare spinale e bulbare o affetto da SBMA viene sottoposto a iniezione nella vena caudale di vettori AAV (vettori adeno-associati) ricombinanti che trasportano un microRNA terapeutico codificante un plasmide. Il vettore produce...

Iniezione di vettori adeno-associati ricombinanti in un modello murino di atrofia muscolare spinale e bulbare

Fonte: Grames, M. S., et al. Metodi e suggerimenti per la somministrazione endovenosa di virus adeno-associato ai ratti e valutazione della trasduzione del sistema nervoso centrale. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'iniezione nella vena caudale del virus adeno-associato ricombinante (AAV) nei ratti. Dopo l'iniezione nella vena laterale della coda, il virus entra nel flusso sanguigno, circola attraverso il cuore e raggiunge il cervello, dove entra nei neuroni e facilita la produzione di...

 Somministrazione endovenosa di vettori virali adeno-associati ricombinanti in un modello di ratto 

Qui descriviamo la consegna del microRNA usando un virus ricombinante adeno-associato sierotipo 9 in un modello murino di una malattia neuromuscolare. Una singola somministrazione periferica nei topi ha provocato la sovraespressione di miRNA sostenuta nel muscolo e motoneuroni, offrendo l'opportunità di studio miRNA funzione e potenziale terapeutico in vivo.

Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

L'obiettivo del presente studio è stato quello di sviluppare e convalidare la potenza e la sicurezza del recettore genico mediato dal virus 9 associato ad adeno associato a spina (AAV9) utilizzando una nuova tecnica di somministrazione del gene subpiale nei topi adulti.

Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Qui presentiamo una tecnica di iniezione intratecale diretto utilizzo 1% lidocaina cloridrato in una soluzione virale per garantire una consegna efficiente virus adeno-associato ai piccoli animali e stabilire un sistema di scoring per predire l'efficienza di trasduzione in zona centrale sistema nervoso secondo il grado della debolezza transitoria indotta da lidocaina.

Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti

In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali

Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.

Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Impara l'iniezione laterale della vena della coda nei topi adulti per somministrare virus adeno-associato. Questo protocollo ottimizzato facilita la terapia genica per disturbi neuromuscolari.

Somministrazione costante di virus adeno-associato tramite iniezione laterale della vena di coda in topi adulti

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