Name: Estrazione di RNA in provetta singola su un singolo animale per il confronto dei livelli relativi di trascrizione tramite qRT-PCR nellesemplare di Tardibius expsibius (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Scopri un metodo rapido di estrazione dell'RNA da singoli tardigradi Hypsibius exemplaris per l'analisi qRT-PCR. Questa tecnica riduce i tempi del 30% e migliora l'efficienza di 200 volte rispetto ai metodi tradizionali.

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<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg"> 
Figura 1: Tubazione a tubo singolo per l'estrazione dell'RNA da un singolo tardigrado. (A) Schema che mostra il protocollo per l'estrazione dell'RNA da un singolo tardigrado, inclusi sei cicli di congelamento-disgelo e successiva sintesi del cDNA. I campioni possono essere successivamente utilizzati per la RT-PCR e la qRT-PCR. (B) Immagine del cono della micropipetta utilizzato per la rimozione dell'acqua. Barra della scala: 2 mm. (C) Immagine in campo chiaro di un tardigrado in un piccolo volume d'acqua (linea tratteggiata). La rimozione della maggior parte dell'acqua, nella misura indicata, è necessaria per il successo dell'estrazione e impedisce la diluizione del tampone di lisi. Barra di scala: 50 μm. (D) Immagine che mostra l'immersione dei campioni in azoto liquido utilizzando una lunga pinza per congelare e scongelare rapidamente i campioni in modo sicuro. Alcuni dei contenuti sono stati creati in BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
NOTA: La Figura 1A mostra uno schema della procedura. Per le procedure dettagliate di coltivazione di tardigradi e alghe, fare riferimento ai rapporti precedentemente pubblicati 45,46,47.
1. Sterilizzazione dell'acqua di sorgente
<ol>
	<li>Versare 2 L di acqua di sorgente da una brocca d'acqua da 5 galloni (vedere la Tabella dei materiali per le specifiche) in una bottiglia di vetro da 2 L adatta all'autoclave.</li>
	<li>Posizionare il tappo sulla bottiglia sicura per autoclave e sigillare con una piccola quantità di nastro adesivo per autoclave. Non stringere la bottiglia; Posizionare il tappo sopra.</li>
	<li>Autoclavare l'acqua di sorgente per 50 minuti con ciclo umido senza fase di essiccazione.</li>
	<li>Lasciare che l'acqua raggiunga la temperatura ambiente (RT) e sigillare saldamente il tappo prima di riporlo a RT.</li>
</ol>
2. Estrazione di micropipette in vetro (con un estrattore per pipette)
<ol>
	<li>Fissare una micropipetta di vetro (diametro esterno: 1 mm, diametro interno: 0,58 mm, lunghezza: 10 cm) su un estrattore per micropipette. Evitare il contatto con il filamento riscaldante, in quanto ciò altererebbe la forma della pipetta e danneggerebbe il filamento.<ol>
		<li>Determinare empiricamente l'estrazione della pipetta per ogni filamento ed estrattore di pipette. Tuttavia, per fungere da punto di partenza per l'ottimizzazione, utilizzare 78 °C e un singolo passo di trazione del peso di trazione di 182,2 g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lasciare che il filamento si riscaldi e separare per gravità la micropipetta di vetro in due micropipette di vetro con punte acuminate (Figura 1B).</li>
	<li>Conservare queste micropipette di vetro estratte in una capsula di Petri chiusa da 100 mm con cera o argilla per tenerle in posizione ed evitare che le punte affilate si rompano.</li>
</ol>
3. Estrazione di micropipette in vetro (senza estrattore per pipette)
<ol>
	<li>Accendere un bruciatore Bunsen o un'altra fonte di fiamma controllata a bassa temperatura.</li>
	<li>Prendi una micropipetta di vetro con un'estremità in ogni mano.</li>
	<li>Tenere il centro della micropipetta di vetro sulla fiamma fino a quando il vetro inizia a sciogliersi. Quindi, separa rapidamente le due estremità. Questo creerà due punte affilate molto delicate.</li>
	<li>Rompere leggermente la punta con un paio di pinze fini sterili.</li>
	<li>Conservare queste micropipette di vetro estratte in una capsula di Petri chiusa da 100 mm con cera o argilla per tenerle in posizione ed evitare che le punte affilate si rompano.</li>
</ol>
4. Estrazione dell'RNA
<ol>
	<li>Ottenere 0,5 L di azoto liquido in un contenitore crio-sicuro. ATTENZIONE: L'azoto liquido è criogenico e può causare ustioni se esposto alla pelle o agli occhi. Durante la manipolazione, utilizzare indumenti protettivi, occhiali antispruzzo, guanti in nitrile, crio-guanti, camice da laboratorio e scarpe chiuse. Assicurarsi che il contenitore sia sicuro per l'azoto liquido prima di trasportare il liquido. Per questo passaggio potrebbe essere possibile anche utilizzare un bagno di ghiaccio secco all'etanolo.</li>
	<li>Preparare la master mix di sintesi del cDNA: una soluzione da 10 μL contenente 1 μL di primer per esamero casuale, 2 μL di DNasi, 4 μL di tampone RT 5x, 1 μL di miscela enzimatica, 1 μL di H2O e 1 μL di dNTP da 10 mM. Conservare questa soluzione in ghiaccio.</li>
	<li>Preparare il tampone di lisi tardigrado (5 mM Tris (pH = 8), 0,5% (v/v) Detergente 1, 0,5% (v/v) Detergente 2, 0,25 mM EDTA in acqua sterile priva di nucleasi). NOTA: Questa soluzione può essere conservata sul piano di lavoro per 6 mesi. Tuttavia, mantenere la sterilità ed evitare potenziali fonti di contaminazione dell'RNAsi.</li>
	<li>Aliquotare abbastanza tampone di lisi per le estrazioni (2 μL/tardigrado).</li>
	<li>Aggiungere l'inibitore dell'RNAsi alla soluzione tampone di lisi tardigrada a una concentrazione finale di 4 U/μL.</li>
	<li>Agitare e far girare la soluzione a RT su una centrifuga da banco ad una velocità di 2000 x g per 5 s prima di conservare la soluzione in ghiaccio.</li>
	<li>Rimuovere dalla coltura il numero di tardigradi necessario per l'esperimento utilizzando una pipetta P1000 sterile con punta filtrante e metterli in una capsula di Petri sterile da 35 mm. NOTA: In questo modo è possibile elaborare un numero qualsiasi di tardigradi. Di solito, tre tardigradi per condizione vengono elaborati per l'estrazione.</li>
	<li>Lavare i tardigradi tre volte, utilizzando 1 ml di acqua di sorgente sterile autoclavata e una pipetta P1000 sterile con filtro. Il pipettaggio lento su e giù aiuta a rimuovere i contaminanti algali.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio da dissezione con un ingrandimento da 25x a 50x, trasferire un singolo tardigrado da questa coltura lavata a una nuova piastra di Petri sterile da 35 mm utilizzando una pipetta P10 sterile con filtro.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta P200 sterile con filtro per lavare il singolo tardigrado in 100 μL di acqua sterile priva di nucleasi. NOTA: Questa fase di lavaggio viene utilizzata per rimuovere ulteriormente i contaminanti, comprese le ribonucleasi.</li>
	<li>Trasferire il tardigrado lavato sul fondo di una provetta PCR pulita e sterile in 1-2 μL di acqua sterile priva di nucleasi utilizzando una pipetta P10 sterile con filtro, assicurandosi che il tardigrado non si attacchi al lato della punta.</li>
	<li>Visualizza il tardigrado con un microscopio da dissezione a un ingrandimento di 25x.</li>
	<li>Per facilitare la rimozione dell'acqua dall'acqua, rompere leggermente la punta della micropipetta di vetro estratta all'esterno del tubo. Assicurati che il foro sia abbastanza grande da tirare su l'acqua ma non il tardigrado.</li>
	<li>Usando l'azione capillare di una micropipetta di vetro tirata, rimuovere l'acqua fino a quando l'animale non è circondato da una piccola bolla d'acqua di circa due lunghezze tardigrade di diametro.</li>
	<li>Monitorare il processo di rimozione dell'acqua tramite il cannocchiale da dissezione per assicurarsi che il livello dell'acqua sia appropriato e che il tardigrado rimanga idratato. NOTA: La Figura 1C offre un esempio della quantità di acqua da rimuovere. Questo è un passaggio fondamentale. Una piccola bolla d'acqua circonderà il tardigrado per evitare che si secchi, ma quanta più acqua in eccesso possibile dovrebbe essere rimossa per evitare la diluizione del tampone di lisi. Per un esempio dei livelli dell'acqua rimanenti, fare riferimento alla Figura 1C.</li>
	<li>Immediatamente dopo aver rimosso l'acqua, aggiungere 2 μL di tampone di lisi tardigrada sul fondo della provetta, agitare brevemente e centrifugare la provetta a RT per 5 s a 2000 x g su una centrifuga da tavolo.</li>
	<li>Posizionare immediatamente i campioni contenenti i tardigradi in un rack per provette PCR e assicurarsi che siano tenuti ben saldi dal rack.</li>
	<li>Afferrare il rack utilizzando un paio di pinze lunghe e grossolane e immergere delicatamente il rack contenente i campioni nell'azoto liquido fino a quando non è completamente congelato (Figura 1D).</li>
	<li>Togliete la griglia dall'azoto liquido e mettetela immediatamente sul ghiaccio. Lasciare scongelare il campione (richiede da ~45 s a 1 min). Monitorare il campione ogni 15 s rimuovendolo dal ghiaccio e ispezionandolo visibilmente. Una volta che il campione è visibilmente trasparente, passare al passaggio successivo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.18-4.19 altre cinque volte. Per la massima lisi ed estrazione sono necessari un totale di sei cicli di congelamento-scongelamento (Figura 2A, B).</li>
	<li>Una volta completato il congelamento-scongelamento, posizionare i campioni sul ghiaccio e procedere immediatamente alla fase successiva. Non congelare i campioni a questo punto per la conservazione, poiché ciò ridurrà l'RNA disponibile per la preparazione del cDNA.</li>
</ol>
5. Sintesi del cDNA
<ol>
	<li>Aggiungere 2 μL di master mix di sintesi di cDNA alla provetta PCR contenente lisato tardigrado. Muovere brevemente la provetta e farla girare a RT a 2000 x g per 5 s con una centrifuga da tavolo prima di riposizionare i campioni sul ghiaccio.</li>
	<li>Posizionare i campioni in un termociclatore e incubare a 25 °C per 10 minuti per ricuocere i primer, a 55 °C per 30 minuti per eseguire la trascrizione inversa e, infine, inattivare gli enzimi a 85 °C per 5 minuti.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente la provetta sul ghiaccio e diluire il campione fino a un volume totale di 25 μl aggiungendo 21 μl di acqua sterile priva di nucleasi. Per le trascrizioni con un numero di copie basso, modificare questa fase di diluizione come determinato empiricamente.</li>
</ol>
6. qPCR
<ol>
	<li>Determinare la temperatura di ricottura del set di primer utilizzando l'RNA totale preparato da quantità maggiori di tardigradi, ad esempio il metodo di estrazione di massa presentato in Boothby, 201843.</li>
	<li>Eseguire un gradiente di temperatura PCR per determinare la temperatura di ricottura ottimale prima di eseguire qRT-PCR (per tutte le impostazioni PCR utilizzate in questo protocollo, fare riferimento alla Tabella 1 e alla Tabella 2).</li>
	<li>Scongelare un tubo di colorante indicatore super mix con ghiaccio e isolare dalla luce. Posizionare una piastra qPCR a 96 pozzetti sul ghiaccio e posizionare 5 μL di super mix, 2 μL di acqua, 1 μL di ciascun primer (10 μM) e 1 μL di prodotto cDNA nel numero di pozzetti desiderati.</li>
	<li>Sigillare la piastra PCR con la piastra sigillante ed eseguire la qRT-PCR utilizzando una temperatura di ricottura appropriata per il set di primer (per tutte le impostazioni qRT-PCR utilizzate in questo documento, fare riferimento alla Tabella 3).</li>
</ol>
7. Quantificazione e interpretazione dei risultati
<ol>
	<li>Confrontare quantitativamente i risultati con uno o più geni di controllo, la cui espressione dovrebbe essere costante nelle condizioni imposte. Per questo studio è stato utilizzato il gene dell'actina.</li>
	<li>Ottenere e confrontare i valoriC t o la soglia del ciclo per ciascun pozzetto con i valori Ct delle reazioni geniche di controllo. Calcola la variazione di piega nell'espressione genica utilizzando la seguente equazione: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: L'espressione genica del fold è tracciata per ogni trascritto e tardigrado come 2-(ΔΔCt)48.</li>
	<li>Per ottenere una stima approssimativa del numero di trascrizione dal valoret C, utilizzare la seguente equazione: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;"> Dove N è il numero di trascritti e 2 è l'efficienza presunta della PCR o l'aumento della fluorescenza per ciclo di PCR48.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Estrazione ottimizzata dell'RNA per qRT-PCR in singoli tardigradi

<table><tbody><tr><td>10 &micro; L Puntali barriera Premium a basso legante, in rack, sterili</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td><td>Indicati come pipetta P 10 sterile con punta filtrante&nbsp; Punte</td></tr><tr><td>1000 &micro; L&nbsp; Puntali per pipette di alta qualità, a basso binding, in rack, sterili</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td><td>Pipetta P 1000 sterile con punta a filtro. Punte</td></tr><tr><td>200 &micro; L&nbsp; Puntali barriera premium a basso legame, in rack, sterili</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td><td>indicati come pipetta P 200 sterile con punta filtrante&nbsp; Punte</td></tr><tr><td>4 stelle dritto forte pinzetta a punta media&nbsp;</td><td>Excelta&nbsp;</td><td>00-SA-DC</td><td>Indicato come pinza lunga</td></tr><tr><td>Rack PCR a 96 pozzetti con coperchio assortito, 5 rack/unità</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td><td>Indicato come rack PCR</td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; NASTRO AUTOCLAVE SENZA PIOMBO 3M 1"</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>indicato come nastro per autoclave&nbsp;</td></tr><tr><td>Nastro per autoclave</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td>Indicato come PCR Plate Seals</td></tr><tr><td>Benchling V8</td><td>Benchling</td><td>N/A</td><td>Indicato come Benchling&nbsp;</td></tr><tr><td>BioRadHard-Shell Piastra PCR a 96 pozzetti</td><td>BioRad&nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>Indicato come piastra PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Camice da laboratorio BULWARK FR:&nbsp;</td><td>Grainger&nbsp;</td><td>26CF64</td><td>indicato come camice da laboratorio</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>indicato come termociclatore&nbsp;</td></tr><tr><td>Termociclatore C1000 Touch Bio-rad con modulo ottico CFX&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>indicato come termociclatore qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroccoccum hypnosporum. &nbsp;</td><td>Carolina</td><td>152091</td><td>indicata come Algae</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Bottiglie riutilizzabili PYREX per la conservazione dei terreni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>Indicato come 2 L Bottiglia di vetro autoclave</td></tr><tr><td>Daigger & Azienda Vortex-Genie 2 Miscelatore da laboratorio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>3030A</td> indicato <td>come Vortexer&nbsp;</td></tr><tr><td>Direct-zol Micro Prep&nbsp;</td><td>Ricerca Zymo&nbsp;</td><td>R2060</td><td>Indicato come kit di estrazione dell'RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont 5 pinzette per biologia</td><td>Strumenti per la scienza fine&nbsp;</td><td>11254-20</td><td>Denominato pinza fine</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500&nbsp;</td><td>Denominato EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Figi v 2.14.0/1.54f&nbsp;</td><td>ImageJ,</td> <td>N/A</td><td>indicato come filamento FIJI/ImageJ</td></tr><tr><td>per pippette Puller&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>indicato come filamento</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Impact Goggles</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-181-501</td><td>indicato come Splash Goggles&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipetta in vetro D.E. 1mm ID 0,58, Lunghezza 10 cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp;</td><td>Indicato come micropipetta di vetro</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151 Ceppo</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>Indicato come Tardigrades o H. exemplaris</td></tr><tr><td>Azoto Liquido Dewar 1 L</td><td>Agar Scientific&nbsp;</td><td>AGB7475</td><td>Indicato come contenitore crio-sicuro&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di sintesi del cDNA Maxima H Minus First Strand&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1651</td><td>indicato come cDNA Synthesis Master Mix&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio Narishige&nbsp;</td><td>Ricerca Tritech</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>Indicato come estrattore per micropipette&nbsp;</td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-000-314</td><td>Indicati come guanti in nitrile&nbsp;</td></tr><tr><td>PIASTRA DI PETRI, PS, 35/10 mm, CON SFATATI</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>Indicato come piastra di Petri da 35 mm.</td></tr><tr><td>PIPETMAN P10, 1&ndash; 10 &micro; L, espulsore di metallo</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>indicato come P 10 pipetta</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000, 100&ndash; 1000 &micro; L, espulsore di metallo</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>indicato come P 1000 pipetta</td></tr><tr><td>PIPETMAN P200, 20&ndash; 200 &micro; L, Eiettore di metallo</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F144058M</td><td>indicato come P 200 pipetta</td></tr><tr><td>libbra questa argilla da modellare a 4 colori&nbsp;</td><td>Eccedenza scientifica americana</td><td> 96517P001</td><td>Indicato come argilla&nbsp;</td></tr><tr><td>Prisma v10.0&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>riferito a un prisma&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette per PCR da 0,2 mL senza RNAsi, 8 strisce con tappo.</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td><td>indicato come promega</td></tr><tr><td>inibitore della ribonucleasi della RNasina</td> in <td>provetta</td> sterile per PCR<td>N2111</td><td>indicato come inibitore dell'RNAsi&nbsp;</td></tr><tr><td>Acqua di sorgente&nbsp;</td><td>Nestlé Pure Life</td><td>44221229</td><td>indicato come acqua di sorgente</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>indicato come Indicator Dye Super Mix&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema stereo-microscopio con ottica e illuminazione&nbsp;</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1</td><td>indicato come microscopio da dissezione</td></tr><tr><td>Supertek Scientific&nbsp; Tirrill Burners</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S09572B</td><td>indicato come Bunsen Burner&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Qualitron</td><td>&nbsp; DW-41-115-NEW</td><td>Indicato come centrifuga da tavolo&nbsp;</td></tr><tr><td>Tempshield&nbsp; Cryo-Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-305</td><td>indicato come Cryo Gloves&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Piastre di Petri Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>Indicate come piastre di Petri da 100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-500&nbsp;</td><td>Indicato come Tris o Tris Base&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93443</td><td>Indicato come Detersivo 1&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma aldrich</td><td>P1379-500&nbsp;</td><td>Indicato come Detersivo 2</td></tr><tr><td>Acqua - Certificata PCR/RT-PCR, priva di nucleasi</td><td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td><td>denominata acqua sterile priva di nucleasi</td></tr></tbody></table>

estrazione di rna in provetta singola su un singolo animale per il confronto dei livelli relativi di trascrizione tramite qrt-pcr nell'esemplare di tardibius expsibius

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

Sviluppo e ottimizzazione dell'estrazione di RNA a singolo tardigrado Adattando il protocollo di Ly et al., 201542 per l'estrazione dell'RNA nei tardigradi, il sistema STST è ottimizzato per massimizzare la quantità e la qualità del preparato (Figura 1A). La RT-PCR è stata eseguita per i trascritti di actina, quantificando la resa del trascritto amplificando una regione di 527 bp che copre gli esoni 1 e 2 (le sequenze per questi primer possono esse...

Estrazione di RNA in provetta singola su un singolo animale per il confronto dei livelli relativi di trascrizione tramite qRT-PCR nell'esemplare di Tardibius expsibius

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