Name: Misurazioni al microscopio a forza atomica della cartilagine in arti axolotl intatti e in rigenerazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Scopri la microscopia a forza atomica per misurare le proprietà meccaniche della cartilagine in arti di axolotl in rigenerazione. Questo metodo consente di studiare i segnali meccanici nella rigenerazione tessutale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Caratterizzazione meccanica della rigidità tissutale durante la rigenerazione degli arti con Axolotl

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Affinity Designer</td><td>Affinity</td><td>&nbsp; versione 1.10.4</td><td>Per l'assemblaggio di figure</td></tr><tr><td>Agarosio Low Melt</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td>Per la preparazione del campione</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Per colorare il tessuto</td></tr><tr><td>Axiozoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Per l'immagine samplea sotto l'AFM</td></tr><tr><td>Benzocaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Per anestetizzare gli animali</td></tr><tr><td>Butorfanolo (+)-tartrato sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; B9156</td><td>Come analgesico</td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow TL1</td><td>Per misure di indentazione AFM</td></tr><tr><td>Configurazione Cellhesion 200 dotata di uno stadio motore</td><td>JPK/Bruker</td><td></td><td>Per misure di indentazione AFM</td></tr><tr><td>Ingresso CellSense Per</td><td></td><td></td><td>l'imaging in stereoscopio Olympus UC90</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS, 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Per pulire campioni e sezioni sotto vibratomo</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ2)</td><td>https://imagej.net/software/fiji</td><td>versione 2.9.0/1.53t</td><td>Per l'elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td> <td>(versione 8.4.3)</td><td>Per rappresentare graficamente e analizzare statisticamente i dati</td></tr><tr><td>FBS inattivato termicamente</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Per cella terreno di coltura</td></tr><tr><td>Colla istoacrilica (2-butil-cianoacrilato)</td><td>Braun</td><td></td><td>Per incollare il campione su piastre di Petri</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>Per colorare i tessuti</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Per terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Microscopio confocale invertito</td><td>Zeiss</td><td>780 LSM</td><td>Per visualizzare sezioni di tessuto</td></tr><tr><td>Microscopio confocale invertito</td><td>Zeiss</td><td>980 LSM</td><td>Per l'imaging di sezioni di tessuto Software di</td></tr><tr><td>elaborazione dati JPK/Bruker</td><td>JPK/Bruker</td><td>SPM 6.4</td><td>Per analizzare le curve forza-distanza</td></tr><tr><td>L15 medium (Leibovitz)</td><td>Sigma</td><td>L1518</td><td>Per terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Per terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Per cellula Terreno di coltura</td></tr><tr><td>Perline di polistirene ( 20 & Micro; m di diametro); )</td><td>microParticelle</td><td></td><td>Per le misure di indentazione AFM</td></tr><tr><td>Pyjibe</td><td>scritto da Paul M&uuml; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe</td><td>0.15.0</td><td>Per analisi viscoelastiche</td></tr><tr><td>Stereoscopio Olympus SX10</td><td>Olympus</td><td>SX10</td><td>Per amputazioni di arti e montaggio di tessuti</td></tr><tr><td>Stereoscopio Olympus UC90</td><td>Olympus</td><td>UC90</td><td>Per imaging</td></tr><tr><td>Vibratomo Leica</td><td>VT</td><td>1200S</td><td>Per il sezionamento di tessuti</td></tr></tbody></table>

misurazioni al microscopio a forza atomica della cartilagine in arti axolotl intatti e in rigenerazione

Atomic Force Microscopy Measurements of Cartilage in Intact and Regenerating Axolotl Limbs

Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo misurato il modulo di Young apparente dei tessuti degli arti axolotl cartilaginei in condizioni omeostatiche ("intatte"), durante l'istolisi precoce della cartilagine e le successive fasi di condensazione della cartilagine (Figura 1A). Abbiamo anche sondato le proprietà meccaniche degli elementi scheletrici in diverse regioni, tra cui il loro centro e la loro periferia, come mostrato nelle immagini che raffigurano la posizione a sbalzo (Figura 1B). Per visualizzare l'architettura tissutale e correlarla con le misurazioni della rigidità, le sezioni trasversali del tessuto o il blocco tissutale in cui sono state eseguite le misurazioni sono state fissate e colorate per i filamenti e i nuclei di actina rispettivamente con Alexa Fluor 488 coniugato Falloidina e Hoechst (Figura 1C). Negli arti intatti, il radio è chiaramente più grande dell'ulna, ma entrambi gli elementi scheletrici cartilaginei hanno una morfologia simile, con nuclei rotondi uniformemente distribuiti al centro, circondati da un anello di nuclei appiattiti corrispondenti al pericondrio24. Durante la fase di islisi, sono stati rilevati cambiamenti drammatici nell'architettura dei tessuti, con nuclei disorganizzati e meno densamente impacchettati all'interno degli elementi scheletrici. Nella fase successiva di condensazione della cartilagine, i nuclei si organizzano di nuovo, con una chiara delimitazione tra la cartilagine di nuova formazione e i tessuti rigeneranti circostanti. Tuttavia, in questa fase, la maggior parte dei nuclei sono appiattiti e non ci sono chiare differenze morfologiche tra il centro e la periferia.
Quando sono state misurate le sezioni trasversali di entrambi gli elementi scheletrici presenti nella regione zeugoporale (radio e ulna), sono stati rilevati moduli di Young apparenti indistinguibili negli arti intatti, con valori mediani rispettivamente di 10,95 ± 11,69 kPa e 15,71 ± 6,49 kPa (Figura 2D, a sinistra), il che concorda con le loro somiglianze anatomiche (Figura 1C). È interessante notare che l'analisi del centro della cartilagine rispetto alla periferia ha mostrato che, in condizioni intatte, i moduli di Young apparenti al centro erano più alti che alla periferia, con valori mediani rispettivamente di 16,48 ± 6,86 kPa contro 7,53 ± 4,63 kPa (Figura 2E, a sinistra). Il giorno 5 dopo l'amputazione, corrispondente alla fase di istolisi, i moduli apparenti di Young nel radio e nell'ulna diminuirono considerevolmente (0,03 ± 0,02 kPa e 0,13 ± 0,09 kPa, rispettivamente, Figura 2D, a destra), ma anche le differenze tra il centro e la periferia scomparvero, con moduli mediani di Young rispettivamente di 0,11 ± 0,07 kPa e 0,27 ± 0,34 kPa (Figura 2E, a destra). Quando si analizzano le proprietà della cartilagine durante una fase di rigenerazione successiva, nel momento in cui la cartilagine inizia a condensarsi, è stato rilevato un aumento significativo dei moduli di Young apparenti, raggiungendo valori intermedi tra la fase intatta e quella islitica (0,77 ± 0,29 kPa, Figura 2F).
Come si può vedere nelle curve di esempio fornite (Figura 2B), l'isteresi si è verificata tra la maggior parte delle coppie di curve di avvicinamento e di retrazione, indicando una risposta viscoelastica del tessuto sotto forza. Abbiamo inoltre deciso di analizzare le proprietà viscoelastiche dei diversi tessuti in modo più dettagliato. Poiché le misurazioni oscillatorie su più frequenze richiedono molto tempo e sono in qualche modo critiche per quanto riguarda la conservazione dell'integrità dei tessuti, specialmente durante la mappatura di più regioni tissutali, abbiamo utilizzato un metodo precedentemente pubblicato da Abuhattum et al. che consente di adattare la parte di avvicinamento delle curve forza-distanza prima della retrazione immediata del cantilever26. Il modello si basa su elementi del modello di Kelvin-Voigt Maxwell ed è stato precedentemente applicato per l'analisi delle proprietà viscoelastiche di cellule e idrogel26, nonché del tessuto pancreatico27. I moduli mediani non rilassati (intatti: 23,05 kPa, istalisi: 0,20 kPa e cartilagine condensata: 1,60 kPa) e i moduli di Young apparenti (intatti: 17,54 kPa, istolisi: 0,07 kPa e cartilagine condensante: 1,54 kPa) derivati per i tessuti nei diversi stadi di rigenerazione hanno rivelato differenze significative (Figura 2G-H). Nel complesso, è stata osservata una risposta prevalentemente elastica dei tessuti alla deformazione alla velocità di deformazione scelta, come si evince dalla grande somiglianza tra moduli elastici non rilassati e apparenti (Figura 2G,H). Valori mediani di viscosità apparente significativamente più bassi sono stati ottenuti per lo stadio islitico (0,72 Pa·s) rispetto agli stadi di cartilagine intatta (2,06 Pa·s) e condensata (2,32 Pa·s) (Figura 2I). Come previsto, i moduli apparenti di Young dell'analisi di PyJjibe (Figura 2H) erano in alto accordo con i valori ottenuti dal software di elaborazione dati JPK (Figura 2F).
In conclusione, la caratterizzazione meccanica riflette la ristrutturazione dinamica dei tessuti durante il processo di rigenerazione. Queste misurazioni sono in accordo con le osservazioni anatomiche, in cui la rigidità tissutale diminuisce insieme alle alterazioni osservate nell'architettura dei tessuti (Figura 1C) e viene gradualmente riacquistata durante la rigenerazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig01v2.jpg"> Figura 1: Misurazioni dell'indentazione della cartilagine degli arti axolotl durante la rigenerazione. (A) Rappresentazione schematica delle fasi di rigenerazione. La linea tratteggiata indica il sito approssimativo della sezione trasversale generata dal vibratomo in cui sono state eseguite le misurazioni. (B) Immagini rappresentative delle misurazioni del centro (in alto) e della periferia (in basso) nella cartilagine degli arti. La punta nera è il cantilever. Barra della scala: 100 μm. (C) Architettura tissutale negli arti intatti (a sinistra), nei tessuti sottoposti a istolisi (al centro) e nella cartilagine condensata (a destra). Verde: nuclei (Hoechst), magenta: filamenti di actina (Falloidina). Barra della scala: 500 μm. C' Regione ingrandita delineata nel pannello. Barra di scala: 100 μm. Le griglie di indentazione di 70 μm x 70 μm sono indicate da quadrati tratteggiati bianchi (al centro) e gialli (periferia). Nei pannelli B e C, le lettere R e U indicano rispettivamente il raggio e l'ulna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5.jpg"> Figura 2: Misurazione della rigidità della cartilagine durante la rigenerazione degli arti axolotl con AFM. (A) Schemi dell'esperimento di indentazione AFM mostrati come forza in funzione del tempo (sopra) e forza in funzione della distanza tra il penetratore e il campione (sotto). Le curve di attacco e di retrazione vengono visualizzate rispettivamente in blu e rosso. Il punto di contatto è visualizzato da una linea tratteggiata verticale nera. Le curve forza-indentazione sono state adattate all'interno della parte di avvicinamento della curva, utilizzando il modello Hertz/Sneddon (software di elaborazione dati JPK e Pyjibe) o l'estensione del modello KVM viscoelastico in Pyjibe. (B) Curve forza-distanza rappresentative da misurazioni AFM in arti intatti e in rigenerazione durante gli stadi di istolisi e cartilagine condensata. La percentuale di curve analizzabili (cioè senza artefatti) è indicata nell'angolo in alto a destra di ogni curva. (C) Esempi di artefatti tipici nelle curve forza-indentazione, ad esempio, a causa di un contatto non corretto del penetratore con la superficie. Gli esempi mostrati corrispondono a arti intatti, ma tipi equivalenti di artefatti sono stati osservati in tutte le condizioni. Per B-C: le curve forza-distanza rappresentative sono state adattate e visualizzate utilizzando Pyjibe. La curva azzurra rappresenta la parte di avvicinamento della curva e la curva rosso chiaro è la parte di retrazione. La linea blu più scura è l'adattamento Hertz/Sneddon applicato per un penetratore sferico. I rispettivi residui dell'accoppiamento sono mostrati di seguito per le curve forza-distanza in basso. I residui tracciati rappresentano la differenza tra i valori di adattamento e quelli effettivi. (D) Moduli apparenti di Young del radio e dei centri dell'ulna misurati in arti intatti e sottoposti a istolisi. (E) Moduli apparenti di Young del centro della cartilagine rispetto alla periferia (Peri) negli arti intatti e durante l'istolisi. (F) Moduli di Young apparenti misurati per il centro della cartilagine negli stadi di rigenerazione analizzati. Per D-F: ogni punto è derivato da una curva forza-distanza analizzata con successo e i punti più grandi corrispondono ai valori mediani per campione. I moduli di Young sono stati ottenuti utilizzando l'adattamento del modello Hertz/Sneddon del software JPK Bruker. (G-I) Modulo non rilassato (G), modulo di Young apparente (H) e viscosità apparente (I) calcolati utilizzando PyJibe (estensione KVM) dalle misurazioni del centro della cartilagine nelle fasi di rigenerazione analizzate. Ogni punto è derivato da una curva forza-distanza analizzata con successo. Le linee corrispondono ai valori mediani di tutte le misurazioni per condizione. Per D-I: Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn. Lettere diverse rappresentano condizioni statisticamente diverse tra loro (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Misurazioni al microscopio a forza atomica della cartilagine in arti axolotl intatti e in rigenerazione

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