La rimozione parziale immediata dei complessi cumuli-ovociti: un approccio raffinato per l'osservazione rapida della fecondazione in vitro

La nostra ricerca si concentra sul miglioramento dei risultati della fecondazione in vitro valutando se la rimozione parziale immediata degli impacchi di ovociti del cumulo migliora la fecondazione. L'efficienza dell'osservazione influisce sulla razza di fecondazione e sulla qualità dell'embrione e ottimizza le procedure di laboratorio. Il nostro obiettivo è quello di perfezionare le tecniche di fecondazione in vitro per ottenere migliori risultati clinici.

Abbiamo stabilito che nella rimozione parziale mediale degli impacchi di ovociti del cumulo migliora significativamente l'efficienza dell'osservazione della fecondazione nella fecondazione in vitro. Ciò porta a migliorare i tempi di valutazione degli eventi di fecondazione e potenzialmente a ottimizzare la qualità degli embrioni e i risultati della fecondazione in vitro. Il nostro protocollo migliora l'efficienza della fecondazione in vitro riducendo il tempo di consegna e minimizzando l'esposizione ambientale e migliorando potenzialmente la qualità degli embrioni.

Offre un approccio snello ed efficace rispetto alle tecniche tradizionali. Per iniziare, metti le piastre per il prelievo degli ovociti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Incubare 12 millilitri di terreno di manipolazione dei follicoli in provette da 14 millilitri a fondo rotondo a 37 gradi Celsius durante la notte.

Quindi trasferire le provette nel rack per provette preriscaldato 30 minuti prima del prelievo degli ovociti. Quindi, aggiungere nove millilitri di terreno di manipolazione dei follicoli a una provetta a fondo tondo da 14 millilitri e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno del prelievo degli ovociti, trasferire 4,5 millilitri del terreno in una capsula di prelievo degli ovociti pre-incubata coperta con due millilitri di olio di paraffina al 100%.

Quindi aggiungere 4,5 millilitri di terreno di fertilizzazione in una capsula di raccolta degli ovociti e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, aggiungi un millilitro di terreno di fertilizzazione a un piatto di sei centimetri ricoperto di olio di paraffina al 100%. Per smussare e arrotondare le punte delle pipette di vetro pasteur, bruciarle su una lampada ad alcool per circa cinque secondi.

Collegare una testa di aspirazione alla punta delle pipette pasteur in modo che possa toccare il fondo del piatto senza graffiare. Sciacquare il bicchiere oltre le pipette in piatti da 10 centimetri con un mezzo di manipolazione dei follicoli. In breve, utilizzare un ago calibro 17 per recuperare gli ovociti sotto guida ecografica transvaginale.

Versare il liquido follicolare raccolto nella provetta a fondo tondo da 14 millilitri in un piatto da 10 centimetri. Posizionare il piatto su una piattaforma a temperatura costante. Osservare l'OCCC al microscopio stereoscopico per confermare la presenza di ovociti e valutarne la maturità.

Confermare la presenza di ovociti nell'OCCC ed effettuare una valutazione preliminare della maturità degli ovociti. Pre-preparare una pipetta per aspirazione in silicone con una pipetta pasteur rotonda lucidata a fiamma. Aspirare l'OCCC sollevando delicatamente il piatto di coltura dalla posizione dalle nove alle 10:00 con l'anulare sinistro e inclinandolo di circa 15 gradi a sinistra.

Mentre si sputa l'OCCC aspirato nella posizione 11:00 del piatto, allungarlo delicatamente orizzontalmente verso destra. Quindi osservare la dimensione delle cellule della granulosa attorno all'OCCC espanso. Ora, usa una pipetta Pasteur per rimuovere delicatamente le cellule della granulosi in eccesso con un rapido taglio verso il basso nella posizione appropriata sull'OCCC allungato.

Trasferire l'OCCC tagliato in una capsula di raccolta, contenente la soluzione di lavaggio OCCC. Versare il liquido follicolare rimanente in un contenitore per campioni sterile. Per iniziare, valutare la concentrazione, la motilità e la morfologia degli spermatozoi del campione di sperma raccolto al microscopio ottico.

Quindi trasferire il pellet di sperma in una nuova provetta da centrifuga e lavarlo due volte nel mezzo di fertilizzazione. Incubarli al 6% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Dopo aver rimosso le cellule di granulosi in eccesso, aggiungere da sei a otto OCCC e un millilitro di terreno di fertilizzazione alla piastra di fertilizzazione.

Inseminare gli OCCC con spermatozoi modali in una singola gocciolina, circa due o tre ore dopo il prelievo nella capsula di fecondazione. Per la fecondazione a breve termine, co-incubare gli OCCC con gli spermatozoi per quattro-sei ore. Dopo l'incubazione, rimuovere meccanicamente le cellule del cumulo, che circondano gli ovociti.

Aspirare gli ovociti utilizzando una pipetta con un diametro interno leggermente più piccolo degli ovociti per garantire la completa rimozione delle cellule. Per confermare la fecondazione, osservare la presenza di due corpi polari. Gli ovociti, che mostrano un secondo globulo polare, sono considerati fecondati.

Per una fecondazione regolare, rimuovere le cellule del cumulo utilizzando le pipette dopo 18-20 ore di co-incubazione per la valutazione della fecondazione. Coltivare gli ovociti fecondati per tre-cinque giorni dopo il prelievo degli ovociti. Valutare la fecondazione a 20 ore dopo l'inseminazione per determinare il numero di pronuclei.

Successivamente, coltivare ogni zigote individualmente in una gocciolina di terreno e trasferire gli embrioni dopo la fecondazione in un mezzo di scissione. Trasferisci gli embrioni del terzo giorno nel terreno blastocitario e valuta il quinto giorno. Riporta i dati continui come media e deviazione standard ed esprimi i dati ordinali come proporzioni.

Su 47 pazienti che hanno ricevuto l'inseminazione a breve termine, non sono state osservate differenze significative in termini di età dei pazienti e numero di ovociti recuperati. Il tempo medio della procedura è stato significativamente più breve nella rimozione parziale del gruppo OCC, rispetto al gruppo di controllo, nonostante non siano state riscontrate differenze significative nel tasso di scissione, nel tasso ottimale di embrioni e nel tasso ottimale di blastociti. Nelle pazienti sottoposte a fecondazione in vitro tradizionale, sono state notate somiglianze nell'età delle pazienti e nel numero di ovociti recuperati tra i due gruppi.

Sebbene sia stato notato un tempo medio di intervento leggermente più breve nella rimozione parziale del gruppo OCCC, non è stata evidenziata alcuna differenza statisticamente significativa. Come nel gruppo precedente, non sono state identificate discrepanze significative nella velocità di scissione, nella velocità ottimale degli embrioni e nella velocità ottimale dei blastociti.