Name: Monitoraggio dellattività di ripetizione ricca di leucina contenente 8 canali (LRRC8/VRAC) utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster a emissione sensibilizzata (SE-FRET) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Scopri il monitoraggio dell'attività dei canali LRRC8/VRAC mediante SE-FRET in cellule HeLa. Questo metodo non invasivo permette di studiare la regolazione dei canoni anionici durante stimoli osmotici in tempo reale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Metodo basato su FRET per monitorare l'attività del canale LRRC8 senza elettrofisiologia

I canali ionici costituiti da eteromeri di ripetizioni ricche di leucina contenenti 8 proteine della famiglia (LRRC8) si trovano in tutte le cellule dei vertebrati, partecipando a un'ampia gamma di funzioni fisiologiche 1,2. Questi canali LRRC8, identificati per la prima volta come canali anionici regolati dal volume (VRAC) o canali raddrizzatori verso l'esterno sensibili al volume (VSOR), svolgono un ruolo cruciale nella diminuzione del volume regolatorio cellulare 3,4. Facilitano l'espulsione degli ioni cloruro e degli osmoliti organici, seguita dall'efflusso d'acqua in risposta al rigonfiamento osmotico. Oltre al loro ruolo nella risposta allo stress osmotico, il loro ruolo nella regolazione del volume cellulare è stato collegato alla proliferazione e migrazione cellulare, all'apoptosi, alla spermiogenesi e all'integrità epiteliale 5,6,7. È stato dimostrato che l'alterazione del potenziale di membrana in seguito all'attivazione di LRRC8/VRAC contribuisce al differenziamento del miotubo8 e alla secrezione di insulina da parte delle cellule β pancreatiche 9,10,11. Inoltre, i canali LRRC8 conducono una varietà di osmoliti organici come le molecole di segnalazione purinergica ATP e cGAMP o l'amminoacido eccitatorio glutammato, ponendo questi canali nella comunicazione cellula-cellula nel sistema immunitario o nell'interazione glia-neurone 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Anche gli xenobiotici, come il colorante fluoresceina, l'antibiotico blasticidina S o il farmaco antitumorale cisplatino, sono condotti dai canali LRRC8 23,24,25.
Ci sono numerosi rapporti sulla trasduzione del segnale che porta all'attivazione di LRRC8/VRAC 26,27,28. Tuttavia, il meccanismo rimane poco chiaro e la letteratura presenta un'ampia gamma di potenziali meccanismi che potrebbero dipendere dallo specifico processo fisiologico. Questi includono cambiamenti nella forza ionica citosolica, interazione con il citoscheletro, composizione della membrana, proteine G, stato redox e cascate di fosforilazione 2,27,29,30,31.
I canali LRRC8/VRAC contengono LRRC8A come subunitàessenziale 3,4 che deve eteromerizzarsi con almeno uno dei suoi paraloghi LRRC8B-E per formare i canali fisiologicamente funzionali 4,14,32. La composizione delle subunità determina le proprietà biofisiche del canale, come la rettifica e l'inattivazione dipendente dalla depolarizzazione 4,29,32,33,34, la specificità del substrato 15,17,20,21,24,35 e alcune vie di attivazione 36,37. Le strutture di crio-microscopia elettronica (cryo-EM) mostrano che gli omomeri LRRC8A, così come gli eteromeri, si assemblano come esameri 38,39,40, mentre le chimere LRRC8A/LRRC8C che formano canali funzionali sono eptameri 41. La parte N-terminale di tutte le proteine LRRC8 comprende quattro eliche transmembrana e la parte C-terminale contiene un dominio con ripetizioni ricche di leucina (LRRD). Le strutture del complesso LRRC8 disponibili forniscono la prova che gli LRRD, che si estendono nel citosol 3,4,23, possono subire riarrangiamenti conformazionali durante il gating del canale 34,42,43. Questa nozione è corroborata dalla scoperta che la fusione C-terminale di proteine fluorescenti provoca l'attività del canale basale14 e che il legame dei nanocorpi ai domini può modulare l'attività del canale44. Inoltre, alterazioni conformazionali dei C-terminali sono state dimostrate mediante trasferimento di energia di risonanza di Förster intra-complesso (FRET)45.
Il metodo più comune per studiare l'attività dei canali ionici è la misurazione elettrofisiologica46, che è stata ampiamente applicata nello studio dei VRAC prima della loro identificazione molecolare47. Tuttavia, esistono vari modi aggiuntivi per monitorare indirettamente l'attività di VRAC, tra cui la misurazione dei suoi substrati condotti - ioni alogenuri o osmoliti organici - o il suo effetto sul volume cellulare48. Infatti, l'identificazione delle proteine LRRC8 come VRAC si è basata su un saggio basato sul quenching di una proteina fluorescente49 sensibile agli alogenuri da parte dello ioduro che entra nella cellula attraverso i VRAC attivati 3,4. Un altro metodo per monitorare l'attività dei canali LRRC8/VRAC utilizza il movimento dei domini citosolici che può essere osservato, come in altri canali ionici 50,51,52,53, da cambiamenti in FRET45. A tal fine, le proteine fluorescenti che fungono da coppie FRET, come la proteina ciano-fluorescente (CFP)/mCerulean3 come donatore e la proteina giallo-fluorescente (YFP)/mVenus come accettore, sono state fuse ai C-terminali delle proteine LRRC8 (Figura 1). Il FRET intra-complesso tra le subunità LRRC8 è stato dimostrato mediante esperimenti di fotobleaching dell'accettore45. Evitando il metodo distruttivo del fotosbiancamento, le variazioni dei FRET nel tempo sono state monitorate mediante FRET A EMISSIONE SENSIBILIZZATA (SE-FRET), dove sostanzialmente viene misurata l'emissione sensibilizzata dell'accettore in seguito all'eccitazione del donatore dovuta alla sovrapposizione dello spettro di emissione del donatore con lo spettro di eccitazione dell'accettore. L'applicazione dell'ipotonicità extracellulare, uno stimolo per l'attivazione di LRRC8/VRAC, ha determinato una riduzione reversibile dell'intensità SE-FRET45. È importante sottolineare che le misurazioni simultanee del patch-clamp su cellule intere e il monitoraggio FRET durante il trattamento ipotonico hanno dimostrato che questa riduzione di FRET rispecchia effettivamente l'attivazione di LRRC8/VRAC45. Questo metodo, che evita di interrompere la membrana plasmatica o di alterare l'ambiente intracellulare con la soluzione pipettata, offre un'alternativa per il monitoraggio dell'attività di LRRC8/VRAC. È particolarmente utile in contesti fisiologici dove il mantenimento del citosol nativo è cruciale, è necessaria la risoluzione subcellulare o è richiesta un'osservazione prolungata dell'attività del canale.
Qui, presentiamo un protocollo per studiare LRRC8/VRAC con una tale lettura basata su FRET. Il protocollo illustra come gestire e trasfettare le cellule, acquisire immagini di campioni e controlli, analizzare i dati e calcolare i valori di emissione sensibilizzata FRET (SE-FRET).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Schema del sistema di coppie di tasti LRRC8. mCerulean3 è mostrato in ciano e mVenus è mostrato in giallo. Dopo l'apertura del VRAC, la distanza (e/o l'orientamento spaziale) tra i fluorofori cambia, con conseguente riduzione del trasferimento di energia tra donatore (Don) e accettore (Acc) e, a sua volta, abbassamento del FRET osservato. Creato con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Dono di C.F. Kaminski (Università di Cambridge, Regno Unito)</td></tr><tr><td>Cicloesimide (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitolo</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Ruota portafiltri di emissione (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)</td><td>Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (siero fetale bovino)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtrante CYR71010</td><td>Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura inferiori in vetro 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HeLa</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>Carcinoma della cervice dei mammiferi/ Ottenuto da Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Cloruro di potassio)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>Sorgente luminosa LED8</td><td>Leica</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>logos biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Cloruro di magnesio)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio THUNDER Imager cellula viva</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Cloruro di sodio)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo HC PL APO 63x/1.40 OLIO</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmometro OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina (Pen Step)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di necrosi tumorale (TNF)-a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione gravitazionale controllato da valvola</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio dell'attività di ripetizione ricca di leucina contenente 8 canali (lrrc8/vrac) utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di förster a emissione sensibilizzata (se-fret)

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Con questo metodo basato su FRET, l'attività di LRRC8/VRAC può essere monitorata durante la stimolazione osmotica e la riduzione di SE-FRET è correlata al grado di ipotonicità extracellulare45. Qui sono mostrati anche i risultati rappresentativi per l'attivazione del canale indotta dall'ipotonicità (Figura 3 e Figura 4). Inoltre, si può osservare l'attivazione di LRRC8/VRAC da parte di diversi stimoli isosmotici, come la manipolazione del segnale del diacilglicerolo45 o durante l'attivazione dei miociti56.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg"> 
Figura 4: Tracce SE-FRET. (A) Tracce SE-FRET apparenti da 5 esperimenti indipendenti. I dati rappresentano la media ± SD da N = 2 a N = 7 celle per campo visivo (FOV). (B) Medie ± SD di tutte le celle (N = 31 cellule). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Poiché i canali LRRC8/VRAC sono anche coinvolti nella diminuzione del volume apoptotico24,57, l'osservazione dell'attività del canale dopo l'induzione dell'apoptosi sarebbe un'altra applicazione per il metodo qui descritto. Di conseguenza, il protocollo per monitorare SE-FRET nelle cellule HeLa che esprimono LRRC8A-mCerulean3 e LRRC8E-mVenus è stato eseguito applicando farmaci che inducono l'apoptosi mediata dal recettore della morte. In precedenza, era stato dimostrato che il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α e la cicloesimide (CHX) evocavano correnti VRAC entro pochi minuti58. Dopo l'aggiunta di 2 ng/mL di TNF-α e 1 μg/mL di CHX in tampone isotonico, si è verificata una robusta diminuzione di SE-FRET (Figura 5). Sostituendo il tampone con un mezzo ipertonico, anche se contenente TNF-α e CHX, i valori di SE-FRET si sono ripresi vicino al basale (Figura 5A), corrispondenti alla diminuzione delle correnti di VRAC nella soluzione del bagno ipertonico durante il trattamento con il ligandoFas 58 che induce l'apoptosi. Il trattamento delle cellule con DMSO, il solvente per TNF-α e CHX, non ha portato alla riduzione di SE-FRET. TNF-α + CHX non hanno influenzato SE-FRET di CFP-18aa-YFP, un costrutto tandem EYFP ed ECFP come controllo FRET59, dimostrando la specificità per LRRC8/VRAC (Figura 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg"> 
Figura 5: Attivazione isosmotica di VRAC mediante apoptosi mediata dal recettore di morte. (A) Valori normalizzati di SE-FRET da cellule HeLa che esprimono LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen (n = 8 piatti, 23 cellule) nel tempo. Dopo 15 cicli in tampone di imaging isotonico (basale), la soluzione del bagno è stata sostituita da un tampone isotonico integrato con 2 ng/mL di TNF-α e 1 μg/mL di cicloesimide (CHX) per 30 cicli, seguiti da 20 cicli di tampone di imaging ipertonico con TNF-α e CHX. Il valore SE-FRET medio grezzo di ciascun ROI e punto temporale è stato normalizzato alla media del valore basale (isotonico) per il rispettivo ROI. (B) Quantificazione dei valori normalizzati SE-FRET di cellule HeLa che esprimono LRRC8A/E come in A con soluzione isotonica contenente DMSO come veicolo di controllo per CHX (n = 5 piatti, 12 cellule) o tampone isotonico contenente induttori dell'apoptosi come in A (n = 8 piatti, 23 cellule), o di cellule HeLa che esprimono CFP-18aa-YFP con induttori dell'apoptosi (n = 3 piatti, 9 cellule). I dati rappresentano la media degli ultimi 10 punti temporali nel rispettivo buffer delle singole celle (simboli) e la media di tutte le celle ± SD; ** p &lt; 0,01 ANOVA unidirezionale ordinaria seguita dal test post-hoc di confronto multiplo di Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Monitoraggio dell'attività di ripetizione ricca di leucina contenente 8 canali (LRRC8/VRAC) utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster a emissione sensibilizzata (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

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