Name: Ottimizzazione della raccolta lacrimale nei topi per lanalisi di mRNA e proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Impara a isolare proteine e RNA dalle lacrime di topo per la scoperta di biomarcatori. Questo metodo minimamente invasivo consente diagnosi precoci di malattie oculari e sistemiche attraverso biopsie liquide.

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Questo lavoro è stato sostenuto da VELUX STIFTUNG [progetto 1852] a M.L. e borse di studio post-laurea da CONAHCYT a M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) e A.M.F (CVU 1317418). Sincera gratitudine a tutti i membri del laboratorio, al Centro de Investigación sobre el Envejecimiento e al Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) per i loro contributi alle stimolanti discussioni.

Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato Etico Animale di Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Gli animali da laboratorio sono stati trattati e maneggiati in stretta conformità con le linee guida per l'uso degli animali della rivista e secondo la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla vista. La salute oculare prima e dopo le procedure è stata valutata valutando le secrezioni oculari, le palpebre gonfie, le anomalie oculari e i cambiamenti comportamentali.
1. Animali e preparazione dei reagenti
<ol><li>Utilizzare tre topi maschi C57BL/6 di 2 mesi per replica per la procedura, con un peso iniziale di ~25 g (Figura 1). Elabora ogni mouse individualmente e posizionalo su un termoforo per mantenere il calore.</li>
	<li>Per indurre la secrezione lacrimale, preparare una soluzione madre di pilocarpina a 20 mg/mL utilizzando acqua sterile.</li>
	<li>Tagliare le strisce reattive di Schirmer a 5 mm di lunghezza e piegare ogni striscia alla tacca a un angolo di 90°.</li>
	<li>Preparare 250 μL di acqua sterile con un inibitore della proteasi (1 compressa per 50 mL, secondo le istruzioni del produttore).</li>
</ol>2. Stimolazione e raccolta della produzione lacrimale
<ol><li>Pesare ogni topo individualmente per calcolare il dosaggio appropriato dei trattamenti.</li>
	<li>Per stimolare la produzione lacrimale, somministrare 30 mg/kg di pilocarpina per via intraperitoneale con una siringa da insulina da 6 mm (Figura 1B). Attendere 2 minuti dopo l'iniezione del farmaco affinché i suoi effetti si manifestino. NOTA: Non è stato possibile ottenere dati da animali non stimolati a causa della limitata disponibilità di liquido lacrimale.</li>
	<li>Raccogli le lacrime posizionando l'estremità di ogni frammento di striscia di Schirmer al centro della palpebra inferiore con un paio di pinzette e tienilo in posizione fino a quando la lacrima non raggiunge il limite della striscia (Figura 1C). Quindi, sostituisci la striscia. Posizionare in sequenza 2 strisce di Schirmer in ciascun occhio, con un intervallo di 2 minuti tra le strisce per la raccolta. Il processo di raccolta delle lacrime richiede circa quattro frammenti di striscia in 10 minuti per topo.</li>
	<li>Posizionare i frammenti della striscia di Schirmer in tubi sterili su ghiaccio per evitare la degradazione dei componenti. Non appena termina la raccolta, inizia l'elaborazione delle lacrime.</li>
</ol>3. Isolamento delle proteine
<ol><li>Mettere i frammenti di striscia in una provetta da microcentrifuga da 600 μl contenente 20 μl di acqua sterile con un inibitore della proteasi e centrifugare per 1 ora a 600 x g a 4 °C, come mostrato in precedenza17 (Figura 1D).</li>
	<li>Effettuare una puntura utilizzando un ago per iniettore in acciaio inossidabile da 7,5 cm sulla punta del tubo da 600 μL contenente il campione (Figura 1E). Quindi, trasferire questa provetta perforata in una nuova provetta sterilizzata da 1,5 ml e centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C, come riportato in precedenza17, per recuperare il volume delle lacrime diluite. Il volume del film lacrimale (surnatante) si troverà sul fondo del tubo.</li>
	<li>Creare un pool proteico combinando il surnatante recuperato da tutti i campioni. In questo esperimento è stato ottenuto un volume totale di circa 200 μL. NOTA: La produzione di strappi può durare più di 1 ora. Durante questo periodo, le lacrime possono ancora essere raccolte.</li>
	<li>Quantificare il contenuto proteico totale del pool lacrimale utilizzando il metodo standard di Bradford22.</li>
</ol>4. Analisi SDS-PAGE
<ol><li>Riscaldare i campioni di proteine a 99 °C per 4 minuti per denaturare le proteine. Agitare brevemente i campioni per mescolare i componenti.</li>
	<li>Caricare 30 μg di contenuto proteico quantificato da ciascun campione su un gel SDS-PAGE al 10% (Tabella 1) ed eseguire i campioni a 90 V per 2 ore utilizzando un metodo standard23.</li>
	<li>Dopo l'elettroforesi, coprire il gel con una soluzione colorante (Tabella 1) e incubare per 30 minuti per colorare le proteine.</li>
	<li>Sciacquare più volte il gel con la soluzione decolorante fino a quando lo sfondo diventa chiaro e le bande proteiche sono visibili.</li>
	<li>Acquisizione di immagini con un sistema di documentazione su gel.</li>
</ol>5. Isolamento dell'mRNA per qPCR e PCR digitale
<ol><li>Mettere le strisce in una provetta da microcentrifuga da 600 μl contenente 20 μl di acqua sterile. Praticare una puntura sulla punta della provetta contenente il campione, inserirlo in una nuova provetta sterilizzata da 1,5 ml e centrifugare, come precedentemente riportato in lacrime umane3, per 20 minuti a 2.000 x g a 4 °C (Figura 1E-H).</li>
	<li>Creare un pool da tutti gli esempi. Il volume recuperato di questo esperimento è stato di circa 22 μL di surnatante per ogni topo, cioè 66 μL di volume totale. Posizionare le provette su ghiaccio secco per evitare la degradazione delle biomolecole.</li>
	<li>Aggiungere 200 μl di soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidinio (ottenuto commercialmente) e omogeneizzare mediante pipettaggio. Lasciate riposare per 5 minuti a temperatura ambiente. In questa fase, i campioni possono essere conservati a -20 °C per diverse settimane o a -70 °C per diversi mesi.</li>
	<li>Aggiungere 40 μl di cloroformio e mescolare a vortice per 15 s. Lasciate riposare per 2 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 10.000 x g per 15 min a 4°C.</li>
	<li>Trasferire con cautela la fase acquosa (senza assumere l'interfase) in una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 μl di glicogeno (0,05 μg/μl) a 100 μl di isopropanolo e miscelare mediante pipettaggio. Il glicogeno è co-precipitato con l'RNA e non interferisce con i passaggi successivi.</li>
	<li>Lasciare riposare per 10 minuti a -20 °C. Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a 4 °C. Decantare rapidamente il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 200 μl di etanolo freddo al 75% e risospendere il pellet di RNA mediante vortex. Centrifugare a 8.000 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Decantare l'etanolo. Senza capovolgere il tubo, lasciarlo asciugare all'aria per 20-30 minuti. Aggiungere 20 μl di acqua priva di RNasi e risospendere.</li>
	<li>Procedere con la lettura della densità ottica nello spettrofotometro a microvolumi a 260 nm e 280 nm per valutare la purezza dell'RNA. I campioni devono essere su ghiaccio. NOTA: Le bande ribosomiali 28S e 18S non possono essere osservate utilizzando un gel di agarosio a causa della natura del campione. La presenza di altri RNA, come miRNA o mRNA, può essere analizzata utilizzando un bioanalizzatore, come mostrato in precedenza18.</li>
	<li>Sintetizzare il cDNA dall'RNA lacrimale utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.<ol><li>Inizia con un RNA in ingresso in un intervallo da 10 ng-5000 ng; a seconda del kit utilizzato, mescolarlo con 1 μL di Oligo (dT) e fino a 12 μL di acqua priva di RNasi. Centrifugare a 500 x g per 30 s e incubare a 65 °C per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere alla provetta di miscelazione 4 μl di tampone di reazione 5x, 1 μl di inibitore della RNasi, 2 μl di miscela dNTP e 1 μl di trascrittasi inversa.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 500 x g per 30 s per tirare giù la miscela. Quindi, incubare la provetta a 42 °C per 60 minuti. Terminare la reazione incubando la provetta a 70 °C per 10 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>A causa della bassa concentrazione di mRNA nelle lacrime, si consiglia di utilizzare cDNA non diluito per la qPCR24. Per questo esperimento sono stati utilizzati 150 ng di cDNA. Eseguire la qPCR utilizzando i primer DNMT3a : Avanti: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Rovescio: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA e GAPDH primer: Avanti: ACTGGCATGGCCCCGTGTTCTTA, Indietro: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC seguendo le istruzioni dei produttori e le procedure delle apparecchiature.<ol><li>Per il ciclo qPCR, utilizzare il seguente programma: Denaturazione iniziale: 95 °C per 10 minuti seguiti da 45 cicli di C 95°C - 15 s, 60 °C - 30 s e 72 °C - 30 s, terminare con un'estensione finale a 72 °C per 5 minuti.</li>
		<li>Eseguire un'analisi della curva di fusione per valutare la presenza di dimeri di primer o ampliconi non specifici nella reazione. La rampa di temperatura è partita da 50 °C fino a 99 °C finali, con una tenuta iniziale di 90 s per il primo passaggio e una tenuta di 5 s tra ogni fase.</li>
		<li>Per la dPCR25, eseguire diluizioni seriali per ottimizzare la quantità di cDNA necessaria per rilevare l'mRNA di interesse. In questo esperimento, utilizzare le seguenti diluizioni di cDNA in acqua priva di nucleasi: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng e 18,75 ng di cDNA. Sono stati utilizzati i primer per DNMT3a precedentemente menzionati. Per il ciclo dPCR, utilizzare il seguente programma: denaturazione iniziale: 95 °C per 2 minuti seguiti da 40 cicli di 95 °C - 15 s e 60 °C - 30 s.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protocollo per l'estrazione delle proteine lacrimali in modelli animali sperimentali

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<li>Masoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+human+tear+film%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of human tear film: A review.</a> Exp Eye Res. 220, 109101(2022).</li>
<li>Dara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+RNA+extraction+method+from+human+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel RNA extraction method from human tears.</a> Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).</li>
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<li>Arslan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+biochemical+analyses+of+human+tear+fluid%3A+Polyvalent+faces+of+the+Schirmer+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip.</a> Exp Eye Res. 237, 109679(2023).</li>
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<li>Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+and+ocular+surface+disorders%3A+Usefulness+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers.</a> J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).</li>
<li>Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+as+a+source+of+biomarkers+for+ocular+and+systemic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases.</a> Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).</li>
<li>Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+fluid+collection+methods%3A+Review+of+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Tear fluid collection methods: Review of current techniques.</a> Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).</li>
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<li>Zhao, J., Nagasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+as+the+major+source+of+mouse+tear+factors+that+are+cytotoxic+to+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes.</a> Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).</li>
<li>Khanna, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+lipidomics+approaches+in+human+tears%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review.</a> Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).</li>
<li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid%3A+From+sampling+to+preanalytical+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing.</a> Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).</li>
<li>Koduri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+tear+protein+elution+from+Schirmer%27s+strips+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease.</a> Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).</li>
<li>Kakan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+miRNAs+identified+in+a+murine+model+of+sjogren%27s+syndrome+as+potential+diagnostic+biomarkers+and+indicators+of+disease+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism.</a> Front Immunol. 13, 833254(2022).</li>
<li>Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+secretion+by+lacrimal+glands+in+transgenic+mice+lacking+water+channels+aqp1%2C+aqp3%2C+aqp4+and+aqp5%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5.</a> Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il liquido lacrimale è facilmente accessibile e la determinazione dei biomarcatori nelle lacrime può essere impiegata come tecnica complementare di successo per la diagnosi precoce di varie malattie umane27. Mentre l'analisi biochimica della composizione lacrimale in modelli animali sperimentali integra questo approccio e promette progressi significativi nella comprensione delle basi molecolari delle malattie, c'è una scarsità di dati e protocolli disponibili, che ci ha portato a svilupparne uno. Il metodo descritto in questo rapporto è tecnicamente semplice da eseguire e consente l'identificazione preliminare dell'espressione differenziale di diverse molecole candidate associate alla malattia.
La raccolta delle lacrime può essere ottenuta attraverso vari metodi come tubi capillari e strisce di Schirmer16,17, tamponi28e spugne29. Il metodo a strisce di Schirmer è stato preferito per la sua facilità di accesso, le capacità quantitative, l'adattabilità durante la raccolta dei campioni, il costo e la semplicità nell'estrazione dei componenti lacrimali per l'elaborazione in laboratorio. Inoltre, questo metodo è economico, minimamente invasivo e non comporta alcun rischio di lesioni o danni alla cornea, grazie alla composizione della striscia filtrante di carta16,17. Le fasi critiche di questo protocollo includono la necessità di una stimolazione farmacologica della produzione lacrimale utilizzando pilocarpina e la selezione di un tampone di eluizione appropriato.
La pilocarpina è un agonista colinergico che si lega ai recettori muscarinici M3 e può causare stimolazione farmacologica delle ghiandole esocrine, aumentando la produzione di lacrime, la secrezione salivare e la minzione. Sebbene gli studi sull'uomo abbiano dimostrato che la stimolazione lacrimale non modifica l'osmolarità del fluido raccolto30, influenza chiaramente i profili proteici31. L'uso di pilocarpina come stimolatore farmacologico colinergico delle ghiandole esocrine e potenziatore della secrezione lacrimale è stato riportato con successo in conigli e topi 19,32,33, ma l'effetto della stimolazione sul contenuto proteico non è stato valutato. Per evitare questa limitazione e consentire un confronto accurato dei profili lacrimali tra le condizioni sperimentali, è fondamentale considerare le impostazioni di raccolta specifiche. Allo stesso modo, l'introduzione di una fase di risciacquo prima della raccolta delle lacrime potrebbe essere utile per evitare una precedente contaminazione della superficie oculare. In questo protocollo, è stata impiegata una concentrazione di 30 mg/kg di pilocarpina13. Poiché i topi sono rimasti immobili e calmi dopo l'iniezione di questo farmaco, le lacrime sono state raccolte senza anestesia, facilitando la raccolta del campione.
La scelta di un tampone di eluizione appropriato è strettamente correlata al metodo selezionato per analizzare la composizione biochimica di un campione lacrimale e il tasso di recupero del materiale biologico dalla striscia. Ad esempio, in uno studio comparativo incentrato sulla ritenzione proteica dalle strisce di Schirmer nei pazienti, è stato stabilito che un tampone contenente 100 mM di bicarbonato di ammonio insieme allo 0,25% di Nonidet P40 (NP40) ha prodotto risultati superiori per la proteomica o le applicazioni di analisi ELISA multiplex17. Nelle nostre mani, l'uso di acqua sterile si è rivelato sufficiente per visualizzare estratti proteici totali in SDS-PAGE e per rilevare l'mRNA dei geni di interesse mediante PCR.
Per valutare la presenza di DNMT3a e mRNA GAPDH nelle lacrime di topo, abbiamo confrontato le prestazioni di qPCR e dPCR. La presenza di dimeri di primer osservata nella curva di fusione della qPCR è attribuita alla bassa abbondanza del trascritto DNMT3a . Come dimostrato, la dPCR ha una sensibilità e un'efficacia significativamente maggiori nel rilevare l'mRNA target in questi campioni in campioni non diluiti e diluiti. Questa precisa capacità di rilevamento rende la dPCR il metodo preferito per l'analisi delle lacrime nei topi, offrendo a ricercatori e medici uno strumento affidabile per studi futuri e potenziali applicazioni cliniche.
Lo sviluppo di un protocollo standardizzato per la raccolta di campioni lacrimali in modelli animali rappresenta un progresso significativo nella ricerca. Questo protocollo non solo facilita la raccolta sistematica e precisa di campioni lacrimali, ma apre anche un'ampia gamma di possibilità per la loro applicazione in varie aree di studio. La capacità di ottenere campioni lacrimali da modelli animali consente lo studio di un ampio spettro di malattie e condizioni, nonché l'esplorazione di nuovi biomarcatori e potenziali terapie. Inoltre, stabilendo un protocollo standardizzato, viene promossa la riproducibilità dei risultati tra diversi studi e laboratori, contribuendo così alla validità e all'affidabilità della ricerca. In definitiva, questo progresso nella metodologia di raccolta dei campioni lacrimali nei modelli animali ha il potenziale per portare a importanti scoperte e migliorare la comprensione della fisiopatologia di varie malattie, aprendo nuove strade per la diagnosi, il trattamento e la prevenzione.

Le lacrime sono considerate un ultrafiltrato plasmatico e sono state anche descritte come un fluido intermedio tra il siero plasmatico e il liquido cerebrospinale a causa di una significativa sovrapposizione nelle biomolecole che condividono1. È stato riportato che le lacrime umane contengono proteine, lipidi lacrimali, metaboliti ed elettroliti2. Recentemente, sono state identificate anche altre biomolecole come mRNA, miRNA e vescicole extracellulari 3,4,5,6,7.
Nell'uomo, le lacrime basali si trovano nel film lacrimale, che consiste di tre strati: lo strato lipidico esterno, che mantiene liscia la superficie lacrimale per permetterci di vedere attraverso di essa e prevenire l'evaporazione delle lacrime; lo strato acquoso intermedio, che mantiene l'occhio idratato, respinge i batteri, protegge la cornea e costituisce il 90% del film lacrimale; e infine, lo strato di mucina, una famiglia di proteine ad alto peso molecolare che sono a contatto con la cornea e permettono alla lacrima di aderire all'occhio8. La distribuzione lacrimale sulla superficie oculare inizia con la secrezione dalla ghiandola lacrimale. Questo fluido viene quindi guidato attraverso i dotti lacrimali per passare sulla superficie dell'occhio e fluire nei canali di drenaggio. Ogni battito di ciglia consente alle lacrime di disperdersi uniformemente su tutto l'occhio, mantenendolo umido9.
Il film lacrimale è un biofluido altamente dinamico in grado di riflettere i cambiamenti molecolari che avvengono non solo sulla superficie oculare ma anche in altri tessuti e organi. L'analisi dell'espressione differenziale in questo biofluido rappresenta un approccio promettente per la scoperta di biomarcatori nelle malattie umane 10,11. L'utilizzo del film lacrimale come fonte di biomarcatori per la diagnosi precoce in varie patologie è stato notevolmente facilitato dalla presenza di metodi di raccolta non invasivi. Il metodo più comune per la raccolta delle lacrime nelle cliniche umane e veterinarie prevede un supporto a membrana (striscia di Schirmer), che opera secondo il principio dell'azione capillare, consentendo all'acqua nelle lacrime di viaggiare lungo la lunghezza di una striscia reattiva di carta o di tubi capillari posizionati nel sacco congiuntivale inferiore del soggetto 12,13,14. Nonostante la limitazione intrinseca dell'ottenimento di un piccolo volume di campione attraverso questo metodo, l'analisi biochimica della composizione lacrimale utilizzando varie tecniche sensibili ha facilitato l'identificazione di potenziali molecole biomarcatrici11,15. I protocolli per l'ottimizzazione e la valutazione dell'eluizione delle proteine lacrimali dalle strisce di Schirmer e dai capillari in pazienti umani sono ben documentati16,17. Tuttavia, sono disponibili descrizioni complete di protocolli ottimizzati specificamente progettati per estrarre informazioni molecolari relative alle lacrime da modelli animali sperimentali, ma scarse. I metodi esistenti, come l'induzione lacrimale attraverso la stimolazione diretta della ghiandola lacrimale18, pur consentendo la raccolta di volumi maggiori, sono invasivi e possono causare disagio agli animali. Metodi non invasivi, come la raccolta di lacrime dalla superficie oculare, sono stati descritti come un modo per isolare il DNA e i miRNA19,21.
Questo protocollo mira a stabilire un metodo economico e ottimizzato per la raccolta e l'elaborazione delle lacrime nei topi. Il metodo dà la priorità alla non invasività e ottiene volumi lacrimali sufficienti adatti all'analisi molecolare attraverso tecniche come SDS-PAGE, qPCR e dPCR. Le informazioni estratte sul contenuto di proteine e mRNA possono quindi essere utilizzate per identificare potenziali biomarcatori nei modelli sperimentali esistenti di malattia.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>1985023</td><td></td></tr><tr><td>2x tampone Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>16-0737</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Quimica Meyer</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice: A4058</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1003045143</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blu R 250</td><td>Biologico statunitense</td><td>6104-59-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Quimica Rique</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb più scala del DNA</td><td>Thermofisher scientifico</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Biologico statunitense</td><td>G8145</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC- 29096</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Quimica Rique</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Quimica Rique</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Quimica Meyer</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Micro provette da 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette 600 & micro; l</td><td>Axygen</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR e Strisce</td><td>Novasbio</td><td>PCR 0104</td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6503-10g</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR QIAcuity EvaGreen (5mL)</td><td>Qiagen</td><td>250112</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity Nanopiastra 26k 24 pozzetti (10)</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>Reale qPlus 2x Master Mix Verde</td><td>Ampliqon</td><td>A323402</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Kit di sintesi del cDNA First Strad</td><td>Thermofisher scientifico</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Strisce reattive di Schirmer</td><td>Laboratorio Santgar</td><td>SANT1553</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma aldrich</td><td>102560430</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424-200ML</td><td>soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidinio</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biologico statunitense</td><td>T8650</td><td></td></tr><tr><td>Base tris</td><td>Chem Cruz</td><td>sc-3715A</td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione della raccolta lacrimale nei topi per l'analisi di mrna e proteine

Optimizing Tear Collection in Mice for mRNA and Protein Analysis

Il film lacrimale è un biofluido altamente dinamico in grado di riflettere i cambiamenti molecolari associati alla patologia, non solo nella superficie oculare ma anche in altri tessuti e organi. L'analisi molecolare di questo biofluido offre un modo non invasivo per diagnosticare o monitorare le malattie, valutare l'efficacia del trattamento medico e identificare possibili biomarcatori. A causa del volume limitato del campione, la raccolta di campioni lacrimali richiede competenze specifiche e strumenti appropriati per garantire un'elevata qualità e la massima efficienza. Varie metodologie di campionamento lacrimale sono state descritte in studi sull'uomo. In questo articolo viene presentata una descrizione completa di un protocollo ottimizzato, specificamente studiato per l'estrazione di informazioni proteiche relative alle lacrime da modelli animali sperimentali, in particolare topi. Questo metodo include la stimolazione farmacologica della produzione lacrimale in topi di 2 mesi, seguita dalla raccolta del campione utilizzando strisce di Schirmer e dalla valutazione dell'efficacia e dell'efficienza del protocollo attraverso procedure standard, SDS-PAGE, qPCR e PCR digitale (dPCR). Questo protocollo può essere facilmente adattato per lo studio della firma della proteina lacrimale in una varietà di paradigmi sperimentali. Stabilendo un protocollo di campionamento lacrimale conveniente, standardizzato e ottimizzato per i modelli animali, l'obiettivo era quello di colmare il divario tra la ricerca umana e quella animale, facilitando gli studi traslazionali e accelerando i progressi nel campo della ricerca sulle malattie oculari e sistemiche.

Il protocollo descritto in questo documento fornisce un metodo semplice ed economico per ottenere informazioni molecolari dal liquido lacrimale utilizzando tecniche comunemente disponibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare. Inoltre, il protocollo può essere ampliato impiegando tecniche altamente sensibili come l'ELISA per il rilevamento dell'attività enzimatica.
Dopo queste procedure, la resa proteica totale è stata di circa 3-4 μg/μL. L'analisi della pagina SDS colorata con Coomassie degli estratti proteici totali rivela modelli di espressione proteica nella retina totale e nelle lacrime (Figura 2A).
L'RNA isolato aveva un rapporto di assorbimento UV 260/280 compreso tra 1,9 e 2,0. La resa media è stata di 134,8 ng/μL. La qPCR è stata eseguita utilizzando set di primer per un gene housekeeping (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi, GAPDH)3 e un gene biomarcatore putativo (DNA-metil transferasi 3a, DNMT3a)26. È stato utilizzato un campione di cDNA non diluito 1:1 (150 ng).
È stata eseguita un'analisi della curva di fusione e i tassi di Ct sono stati calcolati nel software qPCR. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. L'analisi ha rivelato valori di Ct compresi tra 20 e 24, che è un intervallo adeguato della quantità iniziale di mRNA target nel campione (Figura 2B). Tuttavia, l'analisi della curva di fusione nella Figura 2C suggerisce la bassa presenza di mRNA bersaglio. Ciononostante, il gel di agarosio al 2% ha confermato la presenza di ampliconi alla dimensione prevista (Figura 2D).
La dPCR è stata eseguita utilizzando la stessa coppia di set di primer per DNMT3a. Le diluizioni dei campioni di cDNA utilizzati sono state 1:1 (150 ng), 1:2 (75 ng), 1:4 (37,5 ng), 1:8 (18,75 ng). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. La dPCR è stata in grado di rilevare da 1,33 copie/μL nel campione non diluito, a 0,45 copie/μL nel campione diluito 8 volte (Figura 3A, 3B). Pertanto, la dPCR ha mostrato una maggiore sensibilità all'mRNA bersaglio presente nelle lacrime rispetto alla qPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig01.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo di estrazione lacrimale dai topi. (a) Raccolta delle lacrime. Sono stati utilizzati tre topi C57BL/6J di 2 mesi. (B) La produzione lacrimale è stata farmacologicamente indotta dalla somministrazione intraperitoneale di pilocarpina. Fotografia che illustra il posizionamento della striscia di Schirmer. (c) Trattamento delle lacrime. Le lacrime sono state quindi raccolte utilizzando strisce di Schirmer per 10 minuti e trasferite in provette da microcentrifuga. (D) Le lacrime raccolte nelle strisce di Schirmer sono state centrifugate con acqua sterile e inibitori della proteasi o solo acqua sterile. (E, F) Queste provette sono state perforate nella parte inferiore e successivamente trasferite in una nuova provetta sterilizzata da 1,5 ml per facilitare l'eluizione dei liquidi. (G, H) Le lacrime vengono raccolte nella provetta da 1,5 mL. (I) Fotografia rappresentativa della procedura di raccolta delle lacrime. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig02.jpg"> Figura 2: Analisi a valle del film lacrimale per applicazioni molecolari. (A) SDS-PAGE di lacrime di topo e un estratto di proteina retinica. MW: Marcatore di peso molecolare.; corsia 1: Profili proteici della retina (30 μg); Corsia 2: Profili proteici delle lacrime (30 μg). (B) qPCR per GAPDH e DNMT3a in lacrime di topo. La TC e la ΔCT medie sono mostrate nella Tabella 2. (C) Analisi della curva di fusione per prodotti DNMT3a e GAPDH PCR. L'asse y rappresenta la velocità di variazione della fluorescenza nella reazione di amplificazione (dF/dT) e l'asse x rappresenta la temperatura in °C (D) Analisi dell'amplicone PCR nell'elettroforesi su gel di agarosio al 2% contenente 0,5 μg/mL di bromuro di etidio. Corsia M: 1 kb più scala DNA. Corsia 1,2: Amplicone per PCR GAPDH e DNMT3a , rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig03v2.jpg"> Figura 3: PCR digitale (dPCR) per l'espressione di DNMT3a nelle lacrime di topo. (A) I risultati della dPCR vengono visualizzati come un grafico a dispersione 1D che mostra in punti blu le copie della trascrizione di DNMT3a . I punti neri sono partizioni senza la presenza delle copie della trascrizione DNMT3a . (B) È stata generata una serie di diluizioni di cDNA per determinare la concentrazione ottimale per quantificare le copie di trascrizione di DNMT3a . Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig03largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome del materiale</td>
			<td colspan="5">Descrizione</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">10% Gel SDS</td>
			<td colspan="5">Per un gel separatore: 3,8 ml di H2O distillato; 2,6 ml di Tris; pH 8,8; 1,5 M 3,4 ml di acrilammide; 100 μL 10% SDS; 100 μl 10% APS; 4 μl di TEMED.</td>
		</tr><tr><td colspan="5">Per un gel di raccolta: 2,72 ml di H2O distillato, 0,52 ml di Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,68 mL di acrilammide, 40 μL 10% SDS, 40 μL 10% APS 4 μL TEMED.</td>
		</tr><tr><td>Tampone per elettroforesi</td>
			<td colspan="5">250 mM di base Tris, 2 M di glicina, 1% SDS</td>
		</tr><tr><td>Soluzione colorante</td>
			<td colspan="5">Sciogliere i seguenti reagenti in 43 mL di acqua (conservare a temperatura ambiente in un flacone ambrato): Coomassie 0,25 g; acido acetico 7 mL; metanolo 50 mL</td>
		</tr><tr><td>Soluzione decolorante</td>
			<td colspan="5">Sciogliere i seguenti reagenti in 63 mL di acqua (conservare a temperatura ambiente): acido acetico 7 mL; etanolo 30 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1. Impostazione per SDS-Page. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome del gene</td>
			<td>CT1</td>
			<td>CT2</td>
			<td>Media con SD</td>
			<td>ΔCT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH</td>
			<td>20.14</td>
			<td>20.73</td>
			<td>20.44±0.17</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DNMT3a</td>
			<td>24.59</td>
			<td>24.97</td>
			<td>24.78±0.07</td>
			<td>4.35</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2. Valori Ct di DNMT3a e GAPDH nelle lacrime dei topi.

L'identificazione di biomarcatori di RNA e proteine dalle lacrime in modelli murini è molto promettente per la diagnostica precoce in varie malattie. Questo manoscritto fornisce un protocollo completo per ottimizzare l'efficacia e l'efficienza dell'isolamento dell'mRNA e delle proteine dalle lacrime di topo.

Ottimizzazione della raccolta lacrimale nei topi per l'analisi di mRNA e proteine

The tear film is a highly dynamic biofluid capable of reflecting pathology-associated molecular changes, not only in the ocular surface but also in other ...

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