Sistemi AAV e modelli murini per lo studio dell'espressione ectopica di Neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico

Stiamo esplorando l'espressione ectopica mediata da AAV di fattori di trascrizione neurogeni come potenziale trattamento per l'ictus ischemico. Il nostro obiettivo è vedere se l'espressione di Neurod1 nelle cellule che esprimono GFAP durante le fasi subacute e croniche dopo un ictus aumenta i neuroni trasdotti e si correla con i miglioramenti della funzione motoria. Recenti scoperte mostrano che l'espressione genica nella corteccia varia da regione a regione con lo stesso AAV La nostra ricerca ha scoperto che il promotore GFAP è più attivo nella corteccia prefrontale mediale che nella corteccia motoria, indicando che le cellule trasdotte rispondono in modo diverso a promotori specifici.

Pertanto, le terapie che coinvolgono fattori di trascrizione neurogeni dovrebbero essere adattate alla regione cerebrale bersaglio. Le sfide attuali includono la variabilità delle dimensioni delle lesioni da ictus a causa di variabili come i tassi di iniezione di ET-1 e l'efficienza di trasduzione tra le regioni del cervello. I titoli e il tropismo di AAV nelle regioni cerebrali e nei ceppi di topo possono influenzare l'efficienza della trasduzione, influenzando la valutazione cellulare dell'espressione ectopica di Neurod1 dopo l'ictus.

La sfida principale nella conversione degli astrociti in neuroni è distinguere i neuroni riprogrammati da quelli preesistenti. Il nostro laboratorio mira a confermare che questa riprogrammazione avviene in vivo sviluppando nuovi strumenti. In definitiva, cerchiamo di capire come l'espressione ectopica del fattore di trascrizione neuronale migliori il recupero negli animali con lesioni cerebrali.

Per iniziare, rimuovi l'animale anestetizzato dalla camera e posizionalo su una superficie pulita. Dopo aver pulito l'area chirurgica del topo, posizionare il naso nel cono del naso stereotassico e stabilizzare il cranio utilizzando le barre auricolari. Utilizzando una lama di bisturi numero 10, praticare un'incisione verticale parallela al piano sagittale da dietro il punto medio degli occhi fino all'osso parietale.

Quindi, ritrarre delicatamente la pelle per esporre il cranio. Quindi, usa un cotton fioc per interrompere la fascia sul cranio e lasciare che il cranio si asciughi per esporre completamente il bregma. Utilizzando un trapano stereotassico ad alta velocità, praticare tre fori di bava alle coordinate nella corteccia motoria sensoriale destra.

Quindi, sostituire il trapano con una siringa calibro 26 dotata di un ago che misura 0.375 pollici di lunghezza. Caricare nella siringa 1,5 microlitri di soluzione di endotelina-1 da 400 micromolari disciolta in PBS sterile. Rilascia un piccolo volume di endotelina-1 per osservare una goccia sulla punta dell'ago, garantendo un buon flusso.

Abbassare la punta dell'ago oltre il cranio nel foro centrale della bava senza forare la dura madre. Una volta allineato, abbassa l'ago di un millimetro nel cervello. Utilizzando la siringa Hamilton, erogare 0,1 microlitri alla volta e attendere un minuto prima di iniettare i successivi 0,1 microlitri.

Per evitare che l'ago si blocchi tra e dopo le iniezioni, rilasciare una piccola quantità di endotelina-1 fino a quando non appare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzando un cotton fioc sterile, rimuovere l'eccesso di endotelina-1 prima dell'iniezione. Infine, sutura la pelle sovrastante sul cranio usando una sutura sterile 4-0 per chiudere la ferita.

Dopo aver anestetizzato il topo trattato con endotelina-1, trasferire il topo nel telaio stereotassico. Usando le forbici chirurgiche, tagliare i punti di sutura sulla ferita. Con una pinza, rimuovere la crosta e ritrarre la pelle per esporre il cranio.

Quindi, usa un cotton fioc sterile per asciugare la superficie del cranio e individuare i fori delle sbavature. Impostare i bracci manipolatori dell'apparato stereotassico. Posizionare un portaaghi che trasporta una siringa calibro 26 con un ago che misura 0.375 pollici di lunghezza.

Ora, caricare 3,4 microlitri di soluzione AAV nella siringa. Abbassa la punta dell'ago oltre il cranio nel primo foro della bava più anteriore. Assicurarsi che l'ago non fori la dura madre, quindi abbassarla di un millimetro nel cervello.

Utilizzando la siringa di Hamilton, iniettare un microlitro di soluzione AAV erogando 0,1 microlitri alla volta, come dimostrato in precedenza. Quindi sutura la pelle sovrastante sul cranio per chiudere la ferita utilizzando una sutura in poliestere Polysorb 4-0. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e trasferirlo in una gabbia per animali pulita e preriscaldata nell'area di recupero.