Name: Sistemi AAV e modelli murini per lo studio dellespressione ectopica di Neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Scopri l'espressione ectopica di Neurod1 mediante vettori AAV in modelli murini dopo ictus ischemico. Questo metodo valuta la rigenerazione neuronale e il recupero motorio nelle fasi subacuta e cronica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sistemi AAV e modelli murini per studiare l'espressione ectopica di Neurod1 dopo l'ictus

<ol><li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+stroke%2C+1990-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).</li>
<li>Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+stroke%3A+Mechanisms%2C+modulation%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential.</a> J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).</li>
<li>Kuriakose, D., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+treatment+of+stroke%3A+Present+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).</li>
<li>Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+degeneration+of+neurons+in+the+penumbra+region+following+a+small%2C+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke.</a> Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).</li>
<li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+gliosis+and+the+multicellular+response+to+CNS+damage+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li>
<li>Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin-1+and+endothelin+receptor+antagonists+in+inflammatory+response+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+scar+is+more+than+just+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The glial scar is more than just astrocytes.</a> Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Adams, K. L., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+and+disparity+of+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diversity and disparity of the glial scar.</a> Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).</li>
<li>Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+overview+of+neuroinflammation+in+an+experimental+mouse+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model.</a> Sci Rep. 9 (1), 507(2019).</li>
<li>Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Bridging+the+gap+between+basic+science+and+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).</li>
<li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurod1+aav-based+gene+therapy+for+functional+brain+repair+after+ischemic+injury+through+in+vivo+astrocyte-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion.</a> Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).</li>
<li>Ghazale, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+phospho-site+mutations+enhance+neuronal+conversion+of+adult+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo.</a> Front Neurosci. 16, 917071(2022).</li>
<li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+astrocyte+to+neuron+conversion+with+lineage+tracing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo.</a> Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).</li>
<li>Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aav+tools+fail+to+detect+neurod1-mediated+neuronal+conversion+of+muller+glia+and+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo.</a> EBioMedicine. 90, 104531(2023).</li>
<li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promise+for+neuronal+repair%3A+Reprogramming+astrocytes+into+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo.</a> Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).</li>
<li>Hickmott, J. W., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-to-neuron+reprogramming+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Glia-to-neuron reprogramming to the rescue.</a> Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).</li>
<li>Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+reactive+glia+into+iPSCs+to+produce+new+neurons+in+the+cortex+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 22490(2016).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Livingston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+neurod1+is+sufficient+for+functional+recovery+following+a+sensory-motor+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke.</a> Biomedicines. 12 (3), 663(2024).</li>
<li>Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+through+in+vivo+cell+fate+reprogramming+for+neural+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair.</a> Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+conversion+of+striatal+astrocytes+into+gabaergic+neurons+in+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).</li>
<li>Roome, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+endothelin-1+model+of+forelimb+motor+cortex+stroke+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse.</a> J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).</li>
<li>Islam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+in+a+model+of+ischemic+stroke+leads+to+enhanced+cell+survival%2C+endogenous+neural+precursor+cell+activation+and+improved+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes.</a> Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).</li>
<li>Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+post-stroke+behavior+in+mouse+models+of+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-titer+AAV+disrupts+cerebrovascular+integrity+and+induces+lymphocyte+infiltration+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).</li>
<li>Jiang, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+reactive+astrocytes+to+induced+neurons+enhances+neuronal+repair+and+functional+recovery+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke.</a> Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).</li>
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<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+specificity+of+GFAP+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Expression specificity of GFAP transgenes.</a> Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).</li>
<li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+delivery+to+the+brain+using+AAV+and+ultrasound+depends+on+serotypes+and+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas.</a> J Control Release. 351, 667-680 (2022).</li>
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<li>Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+astrocyte+subtypes+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain.</a> Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).</li>
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<li>Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+Impact+to+brain+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease.</a> Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).</li>
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<li>Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+advanced+age+upon+astrocyte-specific+responses+to+acute+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).</li>
<li>Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tamoxifen-induced+cre+activity+and+its+effect+on+immune+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations.</a> Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).</li>
<li>Gresita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+efficiency+of+direct+reprogramming+of+astrocytes+into+neurons+in+the+brains+of+young+and+aged+mice+after+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia.</a> Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Punta da trapano #77 (.018")</td><td>David Kopf Instruments</td><td>8177</td><td></td></tr><tr><td>AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre</td><td>Vettore&nbsp; Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura Assorbibile con Ago Polysorb&trade; Ago in poliestere CV-15 3/8 cerchio conico misura 4 - 0 Intrecciato</td><td>Covidien</td><td>GL-881</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-NeuN (coniglio)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>ABN78&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Topi</td><td>Charles River</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di clorexidina</td><td>Partnar</td><td>PCH-020</td><td></td></tr><tr><td>Contec&trade; &nbsp; PREempt&trade; Soluzione disinfettante RTU</td><td>Fisher Scientific</td><td>29-636-6212</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>HM525 NX&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-23-3800-0.5MG</td><td></td></tr><tr><td>Feather Rasoio di Sicurezza Lame per Microtomo</td><td>Feather</td><td>12-631P</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Copri occhiali: Rettangoli</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mezzo di montaggio a fluorescenza</td><td>Agilent Technologies</td><td>S3023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton Company</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Trapano stereotassico ad alta velocità</td><td>David Kopf Instruments</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Metacam (Meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5-GFAP-iCre</td><td>Costruttore di vettori</td><td>P190924-1001suq</td><td></td></tr><tr><td>Unguento Polyderm USP</td><td>TARO</td><td>2181908</td><td></td></tr><tr><td>SOMNI Scientific&trade; &nbsp; Il termoforo per la temperatura animale</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-777-177</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti stereotassici</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modello 902</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Vetrini per microscopio, bianco</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>tdTomato Reporter Mice&nbsp;</td><td>Il Jackson Laboratory</td><td>007914</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Sistema di anestesia animale da tavolo da tavolo</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr></tbody></table>

sistemi aav e modelli murini per lo studio dell'espressione ectopica di neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico

AAV Systems and Mouse Models for Investigating Ectopic Expression of Neurod1 in Transduced Cells at Subacute and Chronic Times Post-Ischemic Stroke

Esaminare gli esiti cellulari dell'espressione ectopica di Neurod1 guidata dal promotore di breve GFAP (gfaABC(1)D) in ceppi reporter tdTom-Cre wild-type (C57BL/6J) e transgenici (in particolare, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 due sistemi basati su AAV5 sono stati utilizzati in topi con ictus ET-1 (Figura 1A-C). In un modello subacuto di ictus, Neurod1 è stato impacchettato nel sistema Cre-Flex AAV e somministrato a topi wild-type al giorno 7 dopo l'ictus (Figura 1B). Il secondo vettore Flex contiene la sequenza invertita per la GFP guidata dal promotore CAG che è affiancata da siti di ricombinazione eterotipici e antiparalleli di tipo loxP (Figura 1B). Entrambi i costrutti virali vengono iniettati insieme nello stesso momento dopo l'ictus. Una volta che Cre è espresso nelle cellule trasdotte, la GFP viene invertita e asportata nei siti di ricombinazione, orientando la sequenza nella direzione di senso, che consente l'espressione di GFP. Quindi, le cellule che esprimono Cre saranno GFP positive, indicando che sono state trasdotte dai vettori Cre-Flex. Nel modello subacuto, i topi sono stati sacrificati a 21 giorni dopo la trasduzione (cioè 28 giorni dopo l'ictus) e il numero di cellule trasdotte (GFP+), così come il numero di cellule NeuN+GFP+ (cellule trasdotte che esprimono NeuN), sono stati contati nel parenchima del cervello danneggiato dall'ictus. Come si vede nella Figura 2A, i neuroni vengono persi nel sito della lesione ischemica. La quantificazione delle cellule trasdotte nel paradigma subacuto utilizzando il sistema Cre-Flex AAV rivela un numero significativamente maggiore di neuroni marcati (cellule NeuN+GFP+/GFP+) nei topi trattati con Neurod1 rispetto ai topi di controllo Stroke-Cre (43,05 +/- 5,50% vs. 18,43 +/- 3,03% di cellule NeuN+GFP+/GFP+, in Stroke-Neurod1 vs. Topi trattati con Stroke-Cre (controllo), rispettivamente) (p = 0,0172) (Figura 2B, C).
In una serie separata di esperimenti, la conversione di AtN è stata eseguita in un modello cronico di ictus (Figura 1B, C). Il fattore di trascrizione Neurod1 è stato somministrato a topi reporter tdTom-Cre con lesioni da ictus ET-1 il giorno 21 dopo l'ictus (Figura 1C). Identico al sistema Cre-Flex utilizzato nei topi wild-type, l'espressione di Neurod1 è stata guidata dal promotore corto di GFAP. Tuttavia, in questo sistema, è stato utilizzato un singolo costrutto AAV con Cre ricombinasi dopo Neurod1 (Figura 1B). Quindi, le cellule che esprimono GFAP produrranno Cre ricombinasi, inducendo il reporter tdTom, indicando le cellule che sono state trasdotte da AAV. I topi sono stati sacrificati a 77 giorni dopo l'ictus (8 settimane dopo l'AAV) (Figura 1C). Come si vede nella Figura 3A, una lesione corticale è osservata al giorno 77 dopo l'ictus nei topi tdTom-Cre. Il numero di cellule trasdotte che esprimono il marcatore neuronale, NeuN+, è stato quantificato (percentuale relativa di (cellule NeuN+tdTom+/tdTom+) nella fase cronica post-ictus e ha scoperto che i topi che hanno ricevuto Stroke-Neurod1 avevano significativamente più neuroni marcati rispetto ai topi di controllo Stroke-Cre (74,81 +/- 4,835% vs. 53,05 +/- 5,028% NeuN+tdTom+/tdTom+ cellule in Stroke-Neurod1vs. Topi trattati con Stroke-Cre (controllo), rispettivamente) (p = 0,0355) (Figura 3B, C).
Nel complesso, i risultati dimostrano la trasduzione basale dei neuroni e un numero più elevato di cellule trasdotte che esprimono NeuN+ con la somministrazione di Neurod1 sia nella fase subacuta che in quella cronica post-ictus in topi reporter wild-type e tdTom-Cre, con due diversi sistemi basati su AAV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig01.jpg"> 
Figura 1: Espressione ectopica di Neurod1, vettori e linee temporali. (A) Rappresentazione grafica dell'induzione dell'ictus mediante iniezione di endotelina-1 (ET-1) nella corteccia motoria del topo. Il virus adeno-associato (AAV) è stato somministrato in 3 siti, nel sito di iniezione ET-1 e nei siti circostanti la lesione, 1 mm anteriormente e posteriormente. Pannello ingrandito che mostra le cellule trasdotte con AAV-Neurod1 nella corteccia motoria. (B) Schema dei due vettori AAV nel sistema Cre-Flex somministrati a topi wild-type (pannello superiore). Il vettore 1 di AAV5 contiene il promotore corto di GFAP, il fattore di trascrizione Neurod1 e la sequenza ricombinasi Cre affiancati da un sito loxP (triangolo nero) e da un sito lox2272 (triangolo bianco). Il vettore 2 di AAV5 trasporta la sequenza reporter del gene GFP invertita affiancata da una coppia di siti loxP e lox2272. La trasduzione di entrambi i vettori nelle cellule provoca l'escissione e l'inversione mediata da Cre, consentendo all'espressione di GFP di marcare le cellule trasdotte. Neurod1 è stato anche somministrato a topi tdTom-Cre utilizzando un vettore AAV5 (pannello inferiore). Nel vettore AAV5 1 sono raggruppati il promotore corto di GFAP, il fattore di trascrizione Neurod1 e la sequenza ricombinasi Cre. L'espressione di Cre nelle cellule trasdotte guida l'escissione del codone Stop nei siti loxP (triangolo nero), consentendo l'espressione di tdTomato. (C) Il sistema Cre-Flex è stato testato su topi wild-type con AAV iniettati nel periodo subacuto post-ictus (giorno 7 post-ictus). I topi wild-type sono stati sacrificati 21 giorni dopo la trasduzione dell'AAV (28 giorni dopo l'ictus). L'AAV è stato somministrato ai topi tdTom-Cre nel periodo cronico post-ictus (giorno 21 post-ictus) e i topi sono stati sacrificati 56 giorni dopo la trasduzione dell'AAV (77 giorni dopo l'ictus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig02v4.jpg"> 
Figura 2: La somministrazione ectopica di Neurod1 con gli AAV Cre-Flex nella fase subacuta post-ictus porta ad un aumento del numero di cellule trasdotte che esprimono NeuN. (A) Immunocolorazione delle sezioni coronali del cervello attraverso la corteccia motoria al giorno 28 dopo l'ictus da topi di controllo Stroke-Cre (a sinistra) e Stroke-Neurod1 (a destra). Si osserva una perdita neuronale nel sito della lesione (linee tratteggiate bianche). Nella corteccia si osservano cellule trasdotte (GFP+, verde), neuroni (NeuN+, rosso) e cellule NeuN+GFP+ (arancioni) colocalizzate. Barre della scala: 250 μm. (B) Immagini rappresentative del tessuto cerebrale di controllo Stroke-Cre (in alto) e Stroke-Neurod1 (in basso) che mostrano neuroni (NeuN+, rosso) e GFP+ trasdotta AAV (verde). I riquadri delineati in bianco mostrano un primo piano delle celle per ogni singolo canale. Le punte di freccia bianche indicano le cellule trasdotte da AAV (GFP+). Le frecce bianche indicano le cellule NeuN+GFP+ colocalizzate. Barre della scala: 125 μm. (C) Quantificazione delle cellule NeuN+GFP+/GFP+ in topi Stroke-Cre e Stroke-Neurod1 . N = 3 topi per gruppo. I dati sono rappresentati come media ± SEM. Test di Shapiro-Wilk (p = 0,3223). Test t non appaiato, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig03.jpg"> 
Figura 3: La somministrazione ectopica di Neurod1 nei topi reporter tdTom-Cre nella fase cronica post-ictus porta ad un aumento del numero di cellule trasdotte che esprimono NeuN. (A) Immunocolorazione di sezioni cerebrali coronali attraverso la corteccia motoria al giorno 77 dopo l'ictus da topi di controllo Stroke-Cre e Stroke-Neurod1 . La perdita neuronale si osserva nel sito della lesione ischemica (linee tratteggiate bianche). Le cellule trasdotte sono marcate con tdTom (rosso) nel peri-infarto. NeuN+tdTom+ (arancione) sono cellule trasdotte che esprimono marcatori neuronali. Barre della scala: 250 μm. (B) Immagini rappresentative del tessuto cerebrale di controllo Stroke-Cre (in alto) e Stroke-Neurod1 (in basso) che mostrano neuroni (NeuN+, verde) e cellule trasdotte AAV (tdTom+, rosso). I riquadri delineati in bianco mostrano un primo piano delle celle per ogni singolo canale. Le punte di freccia bianche indicano le cellule trasdotte AAV (tdTom+). Le frecce bianche indicano le celle NeuN+tdTom+ colocalizzate. Barre della scala: 125 μm. (C) La quantificazione delle cellule NeuN+tdTom+/tdTom+ nel paradigma cronico mostra un numero significativamente maggiore di cellule trasdotte che esprimono NeuN+ (cellule NeuN+tdTom+/tdTom+) nei topi trattati con Neurod1 . N = 3 topi per gruppo. I dati sono rappresentati come media ± SEM. Test di Shapiro-Wilk (p = 0,2044). Test t non appaiato, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Sistemi AAV e modelli murini per lo studio dell'espressione ectopica di Neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico

Ectopic expression of neurogenic factors in vivo has emerged as a promising approach for replacing lost neurons in disease models. The use of neural basic ...

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Sistemi AAV e modelli murini per lo studio dellespressione ectopica di Neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico (Video) | JoVE Journal

Sistemi AAV e modelli murini per lo studio dell'espressione ectopica di Neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico

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