Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

Questo studio fornisce un protocollo standard per studiare la differenziazione delle cellule Th17, un sottoinsieme di cellule T helper che svolgono un ruolo chiave nelle risposte immunitarie. Attraverso la trasduzione retrovirale dell'RNA guida in cellule T primarie da topi transgenici Cas9, gli scienziati possono studiare la particolare funzione dei geni nella regolazione della differenziazione Th17. Questo studio utilizza la tecnologia CRISPR-Cas9 per l'editing genetico preciso e ha utilizzato la trasduzione retrovirale per indirizzare in modo efficiente geni specifici nelle cellule T primarie.

La citometria a flusso viene utilizzata per valutare l'efficienza di trasduzione e monitorare la differenziazione cellulare. Le polarizzazioni Th17 in vitro sono condotte per stimolare la differenziazione delle cellule CT4+T. La nostra ricerca mira a colmare le lacune nella comprensione di come geni specifici regolano il differenziamento Th17.

Stiamo utilizzando CRISPR-Cas9 insieme alla trasduzione retrovirale, che offre un'alternativa più rapida ed economica ai tradizionali modelli murini knockout. Il nostro protocollo non solo descrive in dettaglio la trasduzione retrovirale delle cellule T CD4, ma fornisce anche una guida completa sulla nostra formazione delle sequenze di sgRNA e sulla costruzione di plasmidi, che è trascurata in altri protocolli. Questo documento delinea ogni fase del processo sperimentale, assicurando che altri ricercatori possano facilmente replicare la metodologia.

Per iniziare, utilizzare lo strumento CRISPick per progettare l'RNA a guida singola per il knockout ROR Gamma T. Impostare il genoma di riferimento su Mouse GRCM 38 e specificare la sequenza PAM come NGG, in base al sistema di guida CRISPRko. Inserisci il nome del gene bersaglio nella casella di ricerca sotto la colonna Ricerca rapida del gene.

Verificare che il sistema visualizzi l'ID del gene corretto e il nome completo del gene target per garantire una selezione accurata. Scegli un singolo RNA guida mirato sulla sequenza RORC in base all'elevato rango combinato e all'ordine di selezione per ridurre al minimo le corrispondenze fuori bersaglio e aumentare l'efficacia sul bersaglio. Selezionare la sequenza di RNA guida singola non mirata dalle librerie Mouse Gecko V2.

Amplificare le sequenze codificanti non target RORC a guida singola e a guida singola utilizzando la DNA polimerasi in una PCR con primer progettati per le regioni di RNA guida singola e sequenza vettoriale. Clonare le sequenze amplificate nel vettore PMXU 6MCS, posizionandole tra il promotore U6 e l'impalcatura dell'RNA guida in frame con la proteina fluorescente mCherry. Quindi imposta un programma PCR per la costruzione di vettori.

Un giorno prima della trasfezione, seminare circa otto volte 10 alla potenza di sei cellule Plat-E in un piatto di 10 centimetri contenente DMEM integrato con il 10% di FBS, penicillina e streptomicina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza. Un'ora prima della trasfezione, sostituire il terreno di coltura cellulare con otto millilitri di terreno sierico caldo ridotto senza rosso fenolo, contenente il 5% di FBS, ma senza penicillina o streptomicina.

Preparare la trasfezione Mix 1 e Mix 2. Goccia a goccia, aggiungere il mix 2 al mix 1 e mescolare delicatamente. Incubare la miscela per 15-20 minuti a 20-25 gradi Celsius.

Mentre si agita delicatamente la piastra, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia alle cellule Plat-E. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sei-dodici ore. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno con 10 millilitri di terreno di coltura cellulare fresco e continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore.

Valutare l'efficienza della trasfezione nelle cellule Plat-E rilevando il tag del vettore retrovirale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Quindi, centrifugare il surnatante di coltura contenente virus a 1.500 G per 10 minuti per rimuovere i frammenti cellulari. Aliquotare il surnatante contenente il virus in flaconcini da un millilitro.

Per iniziare, rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti con due microgrammi per millilitro di Anti CD3 Epsilon e quattro microgrammi per millilitro di Anti CD28 in 500 microlitri di PBS. Avvolgere la piastra in Parafilm e incubare a quattro gradi Celsius per una notte. Dopo aver raccolto la milza di topo, macinarla in tampone FACS utilizzando vetro smerigliato sterilizzato per omogeneizzare il tessuto in una sospensione a singola cellula.

Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare la sospensione di cellule spleniche a 800 G per cinque minuti e risospendere il pellet in due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi. Lasciare riposare il composto a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi aggiungere il tampone FACS per raggiungere un volume totale di 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere gli splenociti nel tampone FACS e filtrarli attraverso un colino cellulare da 40 micrometri. Regolare il volume finale a un millilitro con il tampone FACS e isolare le cellule CD4+T utilizzando kit di reagenti commerciali, seguendo le istruzioni del produttore.

Etichettare le cellule T CD4+con una miscela di anticorpi fluorescenti. Dopo aver lavato le cellule colorate con tampone FACS, isolare le cellule CD4+T naive utilizzando un selezionatore di celle a flusso. Ora, dopo aver rimosso il surnatante di stimolazione legato alla piastra, sciacquare due volte ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di PBS.

Placcare una volta per 10 alla potenza di sei cellule T CD4+naive in un millilitro di terreno di coltura linfocitaria in ciascun pozzetto e incubare per 18-24 ore. Il giorno successivo, raccogliere le cellule attivate in provette da 1,5 millilitri e centrifugare a 800 G per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare in un millilitro della miscela di infezione e aggiungere un millilitro di miscela nei pozzetti di una piastra a 48 pozzetti.

Avvolgere la piastra con Parafilm e centrifugare a 800 G per 90 minuti a 32 gradi Celsius, con accelerazione e decelerazione impostate a tre. Dopo la centrifugazione, rimuovere il Parafilm e incubare le cellule per quattro ore. Per preparare le cellule presentanti l'antigene, o APC, risospendere gli splenociti in un millilitro di terreno di coltura linfocitario contenente 50 microgrammi per millilitro di mitomicina in una provetta da 15 millilitri.

Incubare gli splenociti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere PBS fino a 15 millilitri e centrifugare a 800 G per cinque minuti. Risospendere gli splenociti in un millilitro di terreno di coltura linfocitaria e contare il numero di cellule su una macchina contacellulare.

Dopo l'infezione retrovirale, centrifugare le cellule CD4+T trasdotte in provette da 1,5 millilitri e risospendere le cellule infette in 600 microlitri di PBS. Posizionare 0,5 volte 10 alla potenza di sei cellule CD4+T trasdotte in un millilitro di terreno di coltura linfocitaria con 1,5 volte 10 alla potenza di sei cellule APC in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Integrare con due microgrammi per millilitro di Anti CD3 Epsilon, due microgrammi per millilitro di Anti CD28 e un cocktail di differenziazione Th17.

Coltivare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni, centrifugare la sospensione cellulare in provette da 1,5 millilitri e risospendere il pellet in un millilitro di terreno di coltura linfocitaria contenente tre nanogrammi per millilitro di TGF Beta e 30 nanogrammi per millilitro di interleuchina 6. Trasferire le cellule nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti per due giorni.

Trattare le cellule differenziate con 50 nanogrammi per millilitro di PMA, 500 nanogrammi per millilitro di ionomicina e cinque microgrammi per millilitro di brefelden A in 500 microlitri di terreno di coltura linfocitaria in un nuovo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore. Raccogliere le cellule trattate in provette da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di tampone FACS.

Dopo la centrifugazione, colorare le cellule con PBS contenente una miscela di anticorpi fluorescenti a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Lavare le cellule colorate con 300 microlitri di PBS prima di fissarle con 300 microlitri di formaldeide tamponata con fosfato al 2% a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Dopo aver lavato le cellule con PBS, risospenderle in 600 microlitri di tampone di permeabilizzazione e centrifugare a 800G per cinque minuti.

Colorare le cellule con anticorpo anti-interleuchina 17A in 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione per 60 minuti a temperatura ambiente. L'efficienza dell'infezione retrovirale, come indicato dalle cellule mCherry positive, era di circa il 40%L'efficienza di differenziazione del Th17 era significativamente ridotta nelle cellule trattate con RNA guida singolo bersaglio del gene ROR Gamma T. I livelli di espressione di RORC e interleuchina 17A sono stati sostanzialmente ridotti nelle cellule trattate con RNA guida singola RORC.