Name: Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Scopri il protocollo di targeting genico retrovirale con CRISPR/Cas9 per studiare la differenziazione delle cellule Th17 in vitro. Questo metodo consente di analizzare la funzione genica nelle risposte immunitarie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Trasduzione retrovirale dell'RNA guida per l'editing genico nella differenziazione Th17

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura per cellule e tessuti da 100 mm</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (acido libero, sterile)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare e tissutale a 24 pozzetti</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare e tissutale a 48 pozzetti</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin Una soluzione (1.000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD4 anti-topo Brilliant Violet 650 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD3e (145-2C11), grado funzionale, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Anticorpo monoclonale (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectina) Anticorpo monoclonale (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &mu; m)</td><td>biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (70 &mu; m)</td><td><a name="GAMMA! Centrifuga B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5425&nbsp; Centrifuga R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II Kit di clonazione in un solo passaggio</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; Cellule competenti</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD4+ Kit di isolamento delle cellule T</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Colorante di vitalità fissabile eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>Kit di mini plasmidi EndoFree II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione ExFect</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, Premium Plus</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo IL-17A Anticorpo (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix per qPCR?+gDNA?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>Topo GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Siero ridotto Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>siero ridotto Medium</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-topo Anticorpo CD4 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>PE/Cianina7 anticorpo CD25 anti-topo (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cianina7 anti-topo CD4 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9 mouse</td><td>Centro per organismi modello di Shanghai</td><td>N. di cat. NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante umana TGF-beta 1 (CHO-Expressed), CF</td><td>R& D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di cellule di ricerca murina ricombinante</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore di cellule di ricerca</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Termociclatore PCR Sistema</td> di <td>biosistemi applicati</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Anticorpo CD28 purificato anti-topo (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF IFN purificato anti-topo-&gamma; Anticorpo (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Anticorpo IL-4 purificato anti-topo (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Anticorpo IL-12/IL-23 p40 purificato (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

targeting genico retrovirale mediato da crispr/cas9 per lo studio della differenziazione th17 in vitro

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

Nello studio, abbiamo clonato il bersaglio dell'sgRNA in Rorc e le sequenze codificanti non mirate all'sgRNA nel vettore pMX-U6-MCS con la proteina fluorescente mCherry (Figura 1A, B). La produzione di retrovirus è stata effettuata secondo il protocollo delineato nella Figura 2. La trasfezione è stata avviata il giorno 0 e il prelievo retrovirale è avvenuto il giorno 2. L'efficienza di trasfezione può essere testata dall'intensità di fluorescenza di mCherry (Figura 1C). Prima di raccogliere il virus, le cellule T CD4+ naive sono state selezionate e attivate. Queste cellule T CD4+ attivate sono state quindi infettate utilizzando l'infezione da spin, seguita dalla continuazione delle fasi di differenziazione come descritto. Infine, l'efficienza della trasduzione e i risultati della differenziazione sono stati valutati utilizzando l'analisi di citometria a flusso e l'analisi qPCR.
La Figura 3 illustra la strategia di gating applicata per lo smistamento delle cellule T CD4+ naive. Dopo aver selezionato la popolazione cellulare principale e le cellule singoletto (come mostrato nei primi due gate della Figura 3), le cellule FVD-CD4+ sono state gated per distinguere le cellule T CD4 nelle cellule polarizzate in cellule Th17 da quelle nelle APC. Infine, l'IL-17A prodotta dalle cellule T CD4 rappresenta l'efficienza di differenziazione Th17, che indicava l'efficienza di knockout. La percentuale di cellule mCherry-positive riflette l'efficienza dell'infezione retrovirale, mentre l'efficienza del knockout è indicata dalla percentuale di cellule IL-17A-positive. Per migliorare la vitalità cellulare e ridurre al minimo la durata dello smistamento, gli splenociti sono stati arricchiti utilizzando un kit di isolamento delle cellule T CD4+ di topo, ottenendo un'efficienza di arricchimento superiore al 90%.
L'efficienza dell'infezione da retrovirus, indicata dalla presenza di cellule mCherry-positive, è tipicamente di circa il 40% (Figura 4A). Sebbene l'efficienza dell'infezione possa essere aumentata attraverso la concentrazione del virus, questo approccio va a scapito di una durata sperimentale prolungata e di costi più elevati. Nei nostri esperimenti, le cellule infette coltivate senza il cocktail di differenziazione cellulare Th17 sono servite come controllo negativo della differenziazione Th17, designato come Th0. Come controllo positivo è stato utilizzato un sgRNA non mirato, denominato sgNT. Per l'editing genico, abbiamo impiegato il gRNA mirato al gene RORγt (sgRNA-Rorc), che ha ridotto significativamente l'efficienza di differenziazione di Th17 (Figura 4A). Questo intervento ha anche portato a una sostanziale diminuzione dei livelli di espressione di Rorc e IL-17a (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
Figura 1: Esempio di sgRNA sub-clonato in un vettore retrovirale ed efficienza di trasfezione. Il vettore pMX-U6-MCS è stato utilizzato come costrutto iniziale. Lo scaffold del gRNA, insieme alle sequenze di sgRNA (la parte arancione) che hanno come bersaglio il sito (A) scramble e (B) Rorc, sono stati inseriti a valle del promotore U6 (la parte verde come sezione per il sequenziamento con primer U6). Le posizioni dei primer contenenti sgRNA e dei siti di primer di sequenziamento sono indicate sotto il vettore circolare I nomi completi delle abbreviazioni sul plasmide sono i seguenti. Abbreviazioni: AmpR = resistenza all'ampicillina, alla carbenicillina e agli antibiotici correlati; LTR = ripetizione terminale lunga; MMLVψ = segnale di impacchettamento del virus della leucemia murina di Moloney; gag = gene gag troncato del virus della leucemia murina di Moloney (MMLV) privo del codone iniziale. (C) Imaging al microscopio di mCherry in cellule Plat-E trasfettate con DNA plasmidico. Barra della scala: 500 px. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
Figura 2: Illustrazione schematica del protocollo. Il giorno prima della trasfezione, la densità delle cellule Plat-E deve essere regolata in un intervallo adeguato. Il giorno successivo (giorno 0), eseguire la trasfezione e sostituire il terreno 12 ore dopo. Il giorno 1, ordina e attiva le cellule T naive dai topi che esprimono Cas9. Successivamente (giorno 2), raccogliere il surnatante di coltura contenente il virus e combinarlo con le cellule T attivate per la trasduzione retrovirale. Le cellule infette vengono quindi differenziate in cellule Th17 per 3-4 giorni e analizzate utilizzando FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
Figura 3: Strategia di gating per lo smistamento delle cellule T naïve ai CD4. La colorazione superficiale è stata eseguita sulle cellule T CD4 arricchite per marcare CD4, CD25, CD44 e CD62L. La strategia di gating impiegata è stata la seguente: inizialmente, i linfociti sono stati gated in base ai parametri di dispersione diretta e laterale. Successivamente, le singole cellule sono state identificate utilizzando FSC-H e FSC-W. Le cellule CD4+CD25- sono state quindi gated per escludere le cellule T regolatorie (Treg). Infine, sono state identificate le cellule T naiveCD44 basse CD62Lalte. Le cellule T isolate CD4+ naïve sono state raccolte per esperimenti successivi. Abbreviazioni: FSC = dispersione in avanti; SSC = dispersione laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
Figura 4: Esempio di trasduzione riuscita di cellule T attivate e differenziazione di Th17. (A) L'efficienza di differenziazione di Th17 è ridotta in modo significativo, il che è modificato dal gRNA RORγt (gating on mCherry+ IL-17a+ popolazione). (B) Espressione relativa dell'mRNA di Rorγt e IL-17a in Th0 (cellule infette coltivate senza cocktail di differenziazione cellulare Th17), sgNT (sgRNA non bersaglio) e sgRNA-Rorc (sgRNA che ha come bersaglio il gene RORγt ). p &lt; 0,001 (test t di studente a due code non accoppiato; i dati sono presentati come media ± SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Componenti della reazione PCR</td>
			<td colspan="4">Programma PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Volume (μL)</td>
			<td>Passo</td>
			<td>Temp.</td>
			<td>Ore</td>
			<td>Ciclo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × Phanta Mix (Dye Plus)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>3 minuti</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>15 secondi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer-F (10 μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56 ºC</td>
			<td>15 secondi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Primer-R (10 μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72 ºC</td>
			<td rowspan="2">5 minuti 30 secondi</td>
			<td>Vai al passaggio 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modello (~30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72 ºC</td>
			<td>5 minuti</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12 ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Componenti di reazione PCR e programma PCR per la costruzione di vettori di gRNA.

Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

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