Name: Identificazione guidata da biotest di prodotti naturali per il biocontrollo mediante cromatografia su strato sottile-Bioautografia diretta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Scopri l'identificazione di prodotti naturali microbici per il biocontrollo di Sclerotinia sclerotiorum mediante cromatografia su strato sottile-bioautografia diretta. Questo metodo consente di valutare l'attività antifungina degli estratti batterici.

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Ringraziamo Agriculture and Agri-Food Canada per il finanziamento grazie al quale questa ricerca è stata resa possibile (progetti J-001843 e J-002021). Ringraziamo Brett van Heyningen per aver girato il contenuto video per questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare gli ex studenti laureati (Jennifer Vacon e Mark Nabuurs) per le loro intuizioni sui metodi descritti in questo manoscritto.

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Selezione dei candidati al biocontrollo microbico
<ol><li>Utilizzando saggi su piastra di competizione, selezionare isolati microbici che mostrano antagonismo contro l'agente patogeno di interesse. NOTA: Sono stati selezionati nove isolati di Bacillus che mostravano antagonismo contro S. sclerotiorum , tra cui le specie Bacillus atrophaeus, mojavensis e subtilis , per dimostrare questo protocollo.</li>
</ol>2. Preparazione dei terreni
<ol><li>Preparare l'agar destrosio di patate (PDA) sciogliendo 39 g di terreno per litro d'acqua.</li>
	<li>Preparare Pseudomonas F agar aggiungendo 45 g di terreno per litro d'acqua.</li>
	<li>Preparare il brodo di destrosio di patate (PDB) con l'1% di agar aggiungendo 24 g di terreno e 0,24 g di agar per litro d'acqua.</li>
	<li>Preparare il brodo di lievito-glucosio-manganese (YGM). Creare una soluzione tampone composta da 2,5 g di KH2PO4 e 2,5 g di K2HPO4 in 100 mL di acqua e una soluzione salina composta da 0,58 g di MnSO4. H20, 0,5 g di NaCl e 0,05 g di FeSO4,7H 20 in 100 mL di acqua.<ol><li>Successivamente, aggiungere 1 g di estratto di lievito, 1,25 g di destrosio, 400 ml di acqua, 5 ml di soluzione tampone, 5 ml di soluzione salina e 90 ml di acqua per garantire che i sali metallici non precipitino in soluzione.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilizzare il terreno in autoclave, versare l'agar in piastre Petri da 100 x 15 mm e lasciare raffreddare il tutto a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
</ol>3. Preparazione di agenti patogeni
<ol><li>Coltura di cinque piastre di Sclerotinia sclerotiorum su PDA (preparate al punto 2.1) e incubazione a 25 °C per 3 giorni.</li>
</ol>4. Preparazione dell'estratto di prodotto naturale
<ol><li>Coltivare ogni isolato batterico su Pseudomonas F Agar (preparato al punto 2.2) e crescere fino a quando non si osservano singole colonie.</li>
	<li>Subcoltura di singole colonie batteriche in 25 mL di terreno YGM in centrifuga o provette di coltura e incubazione con agitazione per 3 giorni.</li>
	<li>Trasferire 5 mL di aliquote di ciascun estratto in 1 L di YGM e incubare nelle stesse condizioni per altri 3 giorni.</li>
	<li>Centrifugare ogni coltura a 3000 x g per 15 minuti a 25 °C per pellettare le cellule.</li>
	<li>Decantare e lavare il surnatante tre volte con acetato di etile per estrarre i metaboliti dal terreno di coltura.</li>
	<li>Combinare e asciugare lo strato di acetato di etile di ciascuno utilizzando l'evaporazione rotativa.</li>
	<li>Sciogliere nuovamente l'estratto in una quantità minima di metanolo, trasferirlo in una piccola fiala di scintillazione e asciugarlo nuovamente mediante evaporazione rotativa. NOTA: Se l'estratto si asciuga in un materiale oleoso o resinoso, liofilizzare il materiale per ottenere una polvere secca che può essere pesata accuratamente.</li>
</ol>5. Preparazione della piastra TLC
<ol><li>Preparare il piatto TLC 20 cm x 20 cm tracciando una linea a 2 cm dal basso e a 2 cm dalla parte superiore del piatto. Sulla linea inferiore, posiziona nove punti a 2 cm di distanza. Sopra la linea superiore, posizionare quattro punti a 4 cm di distanza.</li>
	<li>Sciogliere 5 mg di ciascun estratto in 15 μL di metanolo e applicare 5 μL di ciascun estratto sui nove punti contrassegnati sulla riga inferiore utilizzando una pipetta. Lasciare asciugare ogni punto di estratto sulla piastra TLC e applicare un'altra aliquota di 5 μl nello stesso punto. Ripetere l'operazione fino a quando tutto il materiale non è caricato sulla piastra TLC.</li>
	<li>Sviluppare la piastra TLC in un serbatoio di sviluppo utilizzando una soluzione 1:2 di diclorometano e metanolo fino a quando il solvente raggiunge la linea contrassegnata a 2 cm dalla parte superiore della piastra (circa 45 minuti).</li>
	<li>Una volta sviluppata, rimuovere la piastra TLC e applicare una serie di controlli positivi sui quattro punti contrassegnati sopra la linea del solvente. Vengono utilizzate quattro concentrazioni dello stesso controllo. Per S. scl., 0,5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL e 500 μg/mL di igromicina B sono controlli positivi.</li>
	<li>Prima che tutto il solvente evapori dalla piastra, metterla in una scatola di piastre TLC sterilizzata con etanolo.</li>
</ol>6. Saggio di bioautografia diretta
<ol><li>Autoclavare i materiali da utilizzare nel test (componenti in vetro dello spruzzatore per cromatografia, spatola metallica, quattro fogli di carta assorbente, cellulosa o carta da filtro, acqua e terreno) in un grande becher ricoperto di carta stagnola. NOTA: I materiali cartacei (tovagliolo di carta, carta di cellulosa) devono essere avvolti in carta stagnola per evitare di bagnarsi nell'autoclave.</li>
	<li>Collegare una fonte d'aria, un manometro e uno spruzzatore per cromatografia utilizzando un tubo in PTFE sterilizzato con etanolo. Collegare un filtro HEPA tra lo spruzzatore per cromatografia e il manometro.</li>
	<li>Raccogliere il tappetino miceliale delle cinque piastre per agenti patogeni utilizzando la spatola metallica sterile in una provetta da centrifuga da 50 ml utilizzando una spatola sterile. NOTA: Utilizzare un piccolo volume di brodo liquido per aiutare a rimuovere i miceli, se necessario, e trasferire con una pipetta sterile.</li>
	<li>Aggiungere 25 mL di PDB modificato con agar e perle di vetro sterili alla provetta da centrifuga da 50 mL e agitare per 5 minuti per rompere il tappetino miceliale.</li>
	<li>Trasferire la sospensione miceliale in uno spruzzatore per cromatografia utilizzando una siringa sterile con la punta dell'ago per garantire che grossi pezzi di micelio non ostruiscano lo spruzzatore per cromatografia.</li>
	<li>Posizionare le piastre TLC sviluppate in precedenza su salviette di carta sterili in una cappa a flusso laminare per ridurre il contatto delle mani con la lastra durante l'applicazione della sospensione del terreno.</li>
	<li>Aumentare la pressione dell'aria a circa 4 bar e applicare tre mani di sospensione sulla piastra TLC, lasciando che la piastra si asciughi completamente tra un'applicazione e l'altra. NOTA: Tre strati sono risultati essere la quantità ottimale. Meno di questo, e l'agente patogeno non ha abbastanza terreno su cui crescere. Inoltre, il terreno è troppo denso, il che potrebbe non consentire il contatto degli agenti patogeni con i metaboliti attivi.</li>
	<li>Aggiungere 500 ml di acqua sterile in una scatola di plastica sterilizzata e posizionare fogli di cellulosa piegati sterilizzati o carta da filtro su ciascun lato per trattenere l'umidità.</li>
	<li>Posizionare la piastra di analisi completata su quattro piastre di Petri vuote nella scatola.</li>
	<li>Incubare il test per 3 giorni o 1 settimana o fino a quando uno strato uniforme di miceli cresce uniformemente su tutta la piastra TLC, ad eccezione dei controlli positivi e della zona di inibizione (ZOI).</li>
</ol>7. Analisi di spettrometria di massa con cromatografia liquida
<ol><li>Immagine del saggio completato utilizzando la fotografia.</li>
	<li>Calcola il fattore di ritenzione per ciascuna zona di inibizione dividendo la distanza dalla linea inferiore allo ZOI per la distanza dalla linea inferiore alla linea superiore.</li>
	<li>Raschiare la silice dalle zone di inibizione e metterla in provette da microcentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 500 μl di metanolo a ciascuna provetta e vorticare per estrarre i metaboliti dalla silice.</li>
	<li>Centrifugare a 8.500 x g a 20 °C per 10 minuti e trasferire il surnatante in una piccola fiala.</li>
	<li>Evaporare a secco per evaporazione rotativa o sotto un flusso di azoto.</li>
	<li>Risospendere l'estratto in 50 μL di metanolo in un flaconcino LC.</li>
	<li>Analizzare i metaboliti nella zona di inibizione da parte di LC-MS e confrontarli con i metaboliti nell'estratto grezzo per determinare quali metaboliti nell'estratto grezzo sono responsabili dell'inibizione del patogeno16.</li>
	<li>Utilizzando il genere e la specie del microrganismo di origine e le masse identificate nello ZOI, cercare nella letteratura e nei database pertinenti come Antibase e il Dictionary of Natural Products per identificare i metaboliti.</li>
</ol>

Utilizzo del saggio di bioautografia TLC-Direct per identificare i prodotti naturali per il biocontrollo

<ol><li>Fisher, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+fungal+threats+to+animal%2C+plant+and+ecosystem+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health.</a> Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).</li>
<li>Savary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+pathogens+and+pests+on+major+food+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">The global burden of pathogens and pests on major food crops.</a> Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).</li>
<li>Lin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resilience+in+agriculture+through+crop+diversification%3A+Adaptive+management+for+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22BioSci%22%5BJournal%5D)">Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change.</a> BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).</li>
<li>Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+crop+disease+resistance%3A+Lessons+from+research+on+arabidopsis+and+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato.</a> Front Plant Sci. 5, 671(2014).</li>
<li>Damalas, C., Koutroubas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+recent+developments+in+biopesticide+use%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%22%5BJournal%5D)">Current status and recent developments in biopesticide use.</a> Agriculture. 8 (1), 13(2018).</li>
<li>Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+microbial+biocontrol+strategies+for+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens.</a> Plant Sci. 267, 102-111 (2018).</li>
<li>Tudi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+routes+and+health+risks+associated+with+pesticide+application%5BTitle%5D)+AND+%22Toxics%22%5BJournal%5D)">Exposure routes and health risks associated with pesticide application.</a> Toxics. 10 (6), 335(2022).</li>
<li>Santos, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+thuringiensis%3A+From+biopesticides+to+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents.</a> Biochimie. 192, 83-90 (2022).</li>
<li>Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+some+biopesticides+and+their+importance+in+plant+protection+for+commercial+acceptance%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance.</a> Plants. 10 (6), 1185(2021).</li>
<li>Marrone, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticidal+natural+products+-+status+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Pesticidal natural products - status and future potential.</a> Pest Manag Sci. 75 (9), 2325-2340 (2019).</li>
<li>Ayilara, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopesticides+as+a+promising+alternative+to+synthetic+pesticides%3A+A+case+for+microbial+pesticides%2C+phytopesticides%2C+and+nanobiopesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides.</a> Front. Microbiol. 14, 1040901(2023).</li>
<li>Abdelaziz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocontrol+of+soil+borne+diseases+by+plant+growth+promoting+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trop.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria.</a> Trop. Plant Pathol. 48 (2), 105-127 (2023).</li>
<li>Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanism+of+Bacillus+amyloliquefaciens+SC-B15+and+its+application+in+cereal+mildewproof+and+grape+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Biosci%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation.</a> Food Biosci. 56, 103287(2023).</li>
<li>Jamshidi-Aidji, M., Dimkic, I., Ristivojevic, P., Stankovic, S., Morlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-directed+screening+of+bacillus+lipopeptide+extracts+via+hyphenated+high-performance+thin-layer+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Effect-directed screening of bacillus lipopeptide extracts via hyphenated high-performance thin-layer chromatography.</a> J Chromatogr A. 1605, 460366(2019).</li>
<li>Prichystal, J., Schug, K. A., Lemr, K., Novak, J., Havlicek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of natural products.</a> Anal Chem. 88 (21), 10338-10346 (2016).</li>
<li>De Souza, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+lipopeptide+isoforms+by+UPLC-MS+in+the+fermentation+broth+from+Bacillus+subtilis+CNPMS22%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of lipopeptide isoforms by UPLC-MS in the fermentation broth from Bacillus subtilis CNPMS22.</a> Anal Bioanal Chem. 410 (26), 6827-6836 (2018).</li>
<li>Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., Dua, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioautography+and+its+scope+in+the+field+of+natural+product+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Anal%22%5BJournal%5D)">Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry.</a> J Pharm Anal. 5 (2), 75-84 (2015).</li>
<li>Choma, I., Jesionek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC-direct+bioautography+as+a+high+throughput+method+for+detection+of+antimicrobials+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatography%22%5BJournal%5D)">TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants.</a> Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).</li>
<li>Attia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography-bioautographic+method+for+the+detection+of+arginase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors.</a> J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).</li>
<li>Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC-bioautography+as+a+fast+and+cheap+screening+method+for+the+detection+of+alpha-chymotrypsin+inhibitors+in+crude+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts.</a> J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).</li>
<li>Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+thin-layer+chromatography+linked+with+%28bio%29assays+and+FTIR-ATR+spectroscopy+as+a+method+for+discovery+and+quantification+of+bioactive+components+in+native+Australian+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants.</a> J Pharm Biomed Anal. 184, 113208(2020).</li>
<li>Hilaire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+screening+anti-leishmania+compounds+in+plants+extracts+by+HPTLC-bioautography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">New method for screening anti-leishmania compounds in plants extracts by HPTLC-bioautography.</a> J Chromatogr B. 1188, 123061(2022).</li>
<li>Stankovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPTLC-direct+bioautography-guided+isolation+of+isogeranic+acid+as+the+main+antibacterial+constituent+of+Artemisia+santonicum+essential+oil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Serb+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">HPTLC-direct bioautography-guided isolation of isogeranic acid as the main antibacterial constituent of Artemisia santonicum essential oil.</a> J Serb Chem Soc. 84 (12), 1355-1365 (2019).</li>
<li>Su, Y., Qi, Y., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+sporulation+in+plant+pathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Mycology%22%5BJournal%5D)">Induction of sporulation in plant pathogenic fungi.</a> Mycology. 3, 195-200 (2012).</li>
<li>Wedge, E., Nagle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J Nat Prod. 63, 1050-1054 (2000).</li>
</ol>

La dottoressa Susan Boyetchko è deceduta prima della presentazione di questo lavoro (8 febbraio 2023). Tutti gli altri autori hanno dichiarato di non avere conflitti di interesse.

TLC-DB è uno strumento di ricerca NP prezioso e ben consolidato e un'alternativa semplice ed economica ai metodi di isolamento guidati da biosaggi su micropiastre17. Richiede tempo e risorse materiali minimi rispetto ai saggi su micropiastra, che richiedono la separazione dei metaboliti mediante tecniche di cromatografia liquida. Si tratta di un test altamente versatile che può essere utilizzato per rilevare NP antibatteriche, antimicotiche, antiparassitarie e antiossidanti oltre agli inibitori enzimatici 18,19,20,21,22,23. Sebbene sia più comunemente utilizzato per rilevare e identificare sostanze fitochimiche bioattive, lo stesso metodo può essere applicato per le NP batteriche, come esplorato in questo protocollo18. Inoltre, il protocollo può essere ottimizzato per l'uso con una varietà di fonti di NP e patogeni bersaglio per aiutare nella scoperta e nella valutazione di nuove NP bioattive.
I terreni utilizzati per la crescita batterica e il solvente utilizzato per l'estrazione possono influire notevolmente sui risultati naturali della scoperta dei prodotti. I terreni utilizzati in questo protocollo sono ottimizzati per i batteri che producono lipopeptidi ciclici, tra cui Pseudomonas e Bacillus spp. Ma altri mezzi e fonti di nutrienti dovrebbero essere presi in considerazione se si esplorano altri generi. Si può scegliere di completare la TLC-DB utilizzando lo stesso microrganismo coltivato in una gamma di terreni per valutare l'intera gamma di diversità dei metaboliti da un isolato o utilizzare condizioni di crescita identiche per una gamma più ampia di isolati. La scelta del solvente di estrazione influisce anche sui prodotti naturali rilevati. È generalmente noto che la maggior parte delle NP bioattive ha una polarità da bassa a moderata, rendendo l'acetato di etile una scelta adatta grazie al suo basso punto di ebollizione, che lo rende facile da rimuovere. Tuttavia, se si desidera esaminare anche le frazioni polari e non polari, è possibile effettuare estrazioni multiple con altri solventi. In alternativa, l'estratto privo di cellule può essere liofilizzato e utilizzato nel test per vedere tutti i metaboliti rilasciati nel terreno. Tuttavia, spesso è necessario caricare più materiale sulla piastra TLC per tenere conto dei componenti del materiale essiccato nel materiale liofilizzato. Allo stesso modo, se questo metodo viene utilizzato con un patogeno diverso, come l'inoculo, i terreni utilizzati e le condizioni di incubazione devono essere ottimizzati per ottenere le 5 piastre di micelio agar utilizzate per il test TLC-DB.
La TLC-DB è vantaggiosa rispetto alla bioautografia a contatto e a immersione in quanto utilizza lo strato più sottile di agar e inoculo, riducendo al minimo la dipendenza dalla diffusione dei metaboliti nello strato di agar, che può consentire a quantità minori di prodotti naturali di indurre l'inibizione dei patogeni17. I risultati pubblicati in precedenza utilizzando metodi bioautografici TLC hanno utilizzato una sospensione di spore del patogeno per completare il test17. Sebbene ciò consenta un controllo preciso sulla concentrazione della sospensione, può essere estremamente difficile e dispendioso in termini di tempo indurre la sporulazione di alcuni funghi24. Questa modifica semplifica notevolmente il test e consente di completare il test utilizzando agenti patogeni fungini difficili da sporulare e che potrebbero essere stati precedentemente evitati con questo metodo.
La massa di estratto batterico utilizzata nel test può influire sui risultati. Se viene applicato troppo poco estratto alla piastra TLC, è possibile che la concentrazione inibitoria minima di un composto attivo non venga superata e che la bioattività non venga rilevata. Di conseguenza, in alcuni casi, e come si vede nella Figura 1 e nella Figura 2, vale la pena sovraccaricare la piastra TLC, compromettendo la separazione per la capacità di rilevare facilmente l'attività. Allo stesso modo, il carico di agenti patogeni spruzzato sulla piastra non deve essere troppo basso, poiché non ci saranno abbastanza mezzi applicati per supportare la crescita degli agenti patogeni. Questo metodo può essere facilmente regolato per adattarsi a una varietà di estratti batterici e agenti patogeni e le quantità di estratto microbico e inoculo delineate nel protocollo hanno garantito che la bioattività possa essere rilevata per più agenti patogeni ed estratti microbici. Se al termine del test non si osservano zone di inibizione, può indicare una delle seguenti condizioni. In primo luogo, i metaboliti attivi potrebbero non essere presenti nell'estratto applicato a causa dell'utilizzo di terreni incompatibili per la crescita batterica o a causa dell'attività dei batteri che non è il risultato della produzione di NP. Un saggio di diffusione su disco con l'estratto può essere completato per confermare o negare l'esistenza di NP attive nell'estratto. Se il test di diffusione su disco non mostra alcuna soppressione dei patogeni, è possibile testare altri terreni per determinare se altre condizioni producono NP bioattive. Se il test di diffusione su disco indica che l'estratto sopprime l'agente patogeno, potrebbe essere necessario applicare una massa maggiore di estratto batterico alla piastra TLC, nel qual caso è possibile tentare un altro test.
Il confronto dei metaboliti dello ZOI con l'estratto grezzo è essenziale per identificare le NP attive. Nel test, i metaboliti dell'estratto grezzo possono essere metabolizzati o modificati dal patogeno, che può essere osservato tramite LC-MS. Pertanto, solo i metaboliti che si trovano sia nell'estratto grezzo che nello ZOI possono essere considerati NP prodotti dai batteri in studio. Se non è possibile correlare i metaboliti estratti dallo ZOI ai metaboliti nell'estratto grezzo, è possibile preparare una piastra TLC, come descritto nella fase 5. Senza completare il test bioautografico, estrarre i metaboliti dalla piastra TLC allo stesso tempo di ritenzione osservato nel test completato. Ciò dovrebbe consentire una più facile correlazione tra i metaboliti negli ZOI e l'estratto grezzo, causando la soppressione degli agenti patogeni.
Uno svantaggio delle TLC-DB è che la risoluzione delle TLC è notevolmente inferiore a quella ottenuta utilizzando le tradizionali tecniche di screening dei micropozzetti, che richiedono la cromatografia liquida per la separazione. Pertanto, è comune che nella zona di inibizione esistano più metaboliti in cui alcuni metaboliti potrebbero non contribuire alla bioattività. Questo problema può essere ulteriormente causato dalla pratica di sovraccaricare la piastra TLC per osservare la bioattività più chiaramente. Lavori recenti sono stati pubblicati utilizzando TLC ad alte prestazioni (HP-TLC), che migliora notevolmente la risoluzione e può consentire l'automazione dello sviluppo TLC che è altrimenti impossibile quando si utilizza TLC 14,21,22,23 convenzionale. Inoltre, le piastre possono essere sviluppate in una seconda dimensione (2D-TLC) per separare ulteriormente i metaboliti con tempi di ritenzione simili. Detto questo, si dovrebbe valutare se l'aumento del tempo e del costo del materiale sia un compromesso utile per una maggiore risoluzione ottenuta da HP e 2D-TLC25.

I patogeni agricoli fungini causano perdite significative della qualità e della resa delle colture in tutto il mondo, contribuendo alle sfide economiche e di approvvigionamento di un sistema di produzione alimentare globale stabile 1,2. I danni causati dai patogeni possono essere prevenuti allevando cultivar resistenti all'infezione e utilizzando sistemi di gestione integrata delle colture, comprese le rotazioni delle colture e le pratiche di gestione del territorio per sopprimere la proliferazione dei patogeni 3,4. Sebbene questi metodi riducano i danni alle colture, i pesticidi chimici sono generalmente utilizzati in tandem per uccidere attivamente le strutture riproduttive fungine sul campo e prevenire ulteriormente i danni e la riduzione della resa. Sebbene efficace, l'uso di pesticidi chimici presenta molti inconvenienti, tra cui danni agli ecosistemi circostanti, un calo della fertilità del suolo, rischi associati per la salute umana e lo sviluppo di resistenza ai patogeni, quest'ultimo causando la necessità di dosi più elevate di pesticidi ogni anno 5,6,7.
I prodotti per la gestione dei parassiti e degli agenti patogeni a base microbica sono stati a lungo considerati potenziali alternative o complementari ai pesticidi sintetici. Dall'inizio del 1900, il Bacillus thuringiensis è stato ampiamente utilizzato per controllare i parassiti e gli agenti patogeni agricoli come trattamento delle sementi, come spray fogliare e nel trattamento diretto del suolo8. Tali prodotti sono stati denominati biopesticidi e sono caratterizzati come microrganismi presenti in natura o sostanze biochimiche in grado di uccidere, sopprimere o ridurre il vigore di un parassita o di un agente patogeno bersaglio. I biopesticidi possono controllare la crescita di un agente patogeno attraverso vari meccanismi, ma più comunemente lo fanno attraverso la secrezione di metaboliti secondari9. I metaboliti secondari, spesso indicati come prodotti naturali, non sono coinvolti nel metabolismo primario, ma sono prodotti come vantaggio evolutivo per superare altri microrganismi10.
I biopesticidi offrono molti vantaggi rispetto alle loro controparti sintetiche. Rappresentano un basso rischio di tossicità per l'ambiente, la fauna e l'uomo rispetto ai prodotti sintetici per la gestione dei parassiti 9,10. Poiché la maggior parte dei biopesticidi esiste naturalmente nell'ambiente da millenni, nell'ambiente esistono percorsi di biodegradazione per i metaboliti microbici, limitando la possibilità di contaminazione del suolo o dell'ecosistema e riducendo i tempi di residenza che contribuiscono a rendere i pesticidi sintetici così distruttivi per l'ambiente11. Inoltre, molti biopesticidi utilizzati per mitigare l'infezione da agenti patogeni mostrano anche proprietà di promozione della crescita delle piante, che possono aumentare la biodisponibilità dei nutrienti e indurre la resistenza sistemica delle piante12.
Più comunemente, i biopesticidi vengono applicati sotto forma di inoculo microbico e le NP vengono secrete da microrganismi vivi in situ12,13. In tal caso, identificare la fonte dell'attività di un biopesticida è di grande valore. In questo modo si fornisce una visione del meccanismo d'azione del biopesticida, si aiuta a costruire un caso per la protezione di un microrganismo con un brevetto e si può avere un impatto scientifico significativo se le loro strutture sono nuove. La cosa più importante, tuttavia, è che l'identificazione della fonte bioattiva informa le possibilità di formulazione di un prodotto biopesticida a valle. Se la NP stessa è attiva, si può utilizzare il microrganismo come fabbrica di biomolecole per la produzione di biopesticidi su larga scala. Inoltre, molte NP che sono state esplorate per il biocontrollo hanno anche potenziali applicazioni nella medicina umana, rendendole ancora più preziose dal punto di vista economico8.
I saggi TLC-DB (Thin Layer Chromatography-Direct Bioautograph) sono un metodo semplice ed economico per l'isolamento e l'identificazione di metaboliti biopesticidi guidati dalla bioattività. Sebbene la tecnica sia comunemente utilizzata per separare i test di bioattività delle sostanze fitochimiche dagli estratti vegetali grezzi, ha anche un grande potenziale per l'analisi degli estratti microbici14. La TLC fornisce una separazione rapida ed economica delle NP in un estratto microbico grezzo e, dopo il rivestimento con una sospensione di patogeni media, le zone che contengono metaboliti attivi sono facilmente visualizzabili. Queste zone possono essere raschiate dalla piastra ed estratte per l'analisi chimica mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni abbinata alla spettrometria di massa (UPLC-MS) per identificare i metaboliti noti. I metaboliti che non corrispondono ai composti precedentemente riportati possono essere isolati in quantità maggiori tramite cromatografia liquida per sottoporsi a studi di chiarimento della struttura utilizzando tecniche come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e la cristallografia a raggi X15.
Questo articolo descrive un sistema modello per la scoperta e l'identificazione di NP di biopesticidi utilizzando TLC-DB con Bacillus spp. e il patogeno agricolo Sclerotinia sclerotiorum. La Figura 1 fornisce una panoramica schematica della procedura TLC-DB.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica dei passaggi 4-7 della procedura di TLC-DB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Pipetta monocanale da 0,5-5 mL</td><td>VWR</td><td>CA11020-004</td><td></td></tr><tr><td>Spruzzatore per cromatografia su strato sottile da 10 mL</td><td>VWR</td><td>KT422530-0010</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>89038-970</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &; L puntali per pipette</td><td>VWR</td><td>76322-164</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &; Pipetta monocanale L</td><td>VWR</td><td>76169-240</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga sterili da 15 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Flacone di vetro da 1 L</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS13951L</td><td>Deve essere sicuro per l'autoclave</td></tr><tr><td>Siringa sterile da 1 mL con ago</td><td>Thomas Scientific</td><td>8935L75</td><td>Si consiglia un ago staccabile</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 2 mL</td><td>VWR</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga sterili da 50 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette da 5 mL</td><td>VWR</td><td>CA11020-008</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di scintilazione da 7 mL</td><td>VWR</td><td>76538-962</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo al 95%</td><td>Autoclave Thermo Fisher Scientific</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-01850-34</td><td>8 L, 115 VAC</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>bin</td><td>Thomas Scientific</td><td>1216H91</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano &ge; 99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1113-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile &ge; 99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1123-4LG</td><td></td></tr> Carta <tr><td>da filtro</td><td>VWR</td><td>CA28297-846</td><td></td></tr><tr><td>Perle abrasive</td><td>VWR</td><td>12621-148</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>VWR</td><td>CA80501-074</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ferro eptaidrato</td><td>VWR</td><td>97061-542</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>CleanTech</td><td>1000-6-A</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS</td><td>Waters</td><td>LITR10064178</td><td>Sistema UPLC/MS/MS TQD</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>700201000</td><td>Collettore di temperatura&nbsp;-50 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Solfato di manganese idrato</td><td>VWR</td><td>CAAA10807-14</td><td></td></tr><tr><td>metanolo &ge; 99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH2018-5GLP</td><td></td></tr><tr><td>Tovagliolo di carta</td><td>VWR</td><td>89402-824</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio di patate Agar</td><td>VWR</td><td>CA90000-758</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di destrosio di patate</td><td>VWR</td><td>CA90003-494</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>VWR</td><td>470302-246</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>VWR</td><td>470302-252</td><td></td></tr><tr><td>Manometro 6mm Raccordo Dritto 0-10 bar (0-145 psi)</td><td>Tameson</td><td>F25U6</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas F Agar</td><td>VWR</td><td>90003-352</td><td>Conosciuto anche come Flo Agar</td></tr><tr><td>PTFE Tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58697-U</td><td>1/16 pollici diametro interno&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spatola</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td></td></tr><tr><td>Anelli di inoculazione sterili con ago</td><td>VWR</td><td>76534-512</td><td></td></tr><tr><td>Stagnola</td><td>Thomas Scientific</td><td>1086F24</td><td>Può essere acquistato dal supermercato</td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Lastre di vetro 20 X 20 cm</td><td>Thomas Scientific</td><td>1205Q12</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Labconco</td><td>1472100</td><td>98 L/min</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>76549-928</td><td>Deve contenere provette da centrifuga da 15 mL e 50 mL Whatman</td></tr><tr><td>in linea HEPA-VENT</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA67235000</td><td>10 filtri, ingresso/uscita da 1/4 a 3/8 di pollice</td></tr><tr><td>VWR</td><td>97063-370</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione guidata da biotest di prodotti naturali per il biocontrollo mediante cromatografia su strato sottile-bioautografia diretta

Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

La cromatografia su strato sottile-bioautografia diretta (TLC-DB) è un test biologico consolidato utilizzato per separare e identificare prodotti naturali (NP) antagonisti contro un patogeno bersaglio. Si tratta di un'opzione rapida, economica e semplice per l'isolamento e l'identificazione di NP guidata da biosaggi che si basa sulla separazione mediante TLC accoppiata con l'applicazione diretta di un patogeno bersaglio per esaminare la bioattività. Viene tipicamente utilizzato per l'analisi di estratti vegetali bioattivi, rilevando l'attività inibitoria contro batteri, funghi ed enzimi. Detto questo, ha un grande potenziale nella scoperta di NP batteriche, in particolare per la valutazione delle NP batteriche contro i patogeni agricoli pertinenti, che è prezioso per la scoperta e lo sviluppo di nuovi biopesticidi per l'industria agricola. Inoltre, si tratta di un protocollo sintonizzabile che potrebbe essere applicato ad altri patogeni bersaglio o fonti di NP in programmi di ricerca riguardanti la scoperta e l'identificazione di composti bioattivi. In questo articolo, descriviamo un sistema modello per la scoperta e l'identificazione di NP di biopesticidi utilizzando TLC-DB con Bacillus spp. e il patogeno agricolo Sclerotinia sclerotiorum.

Dopo la separazione degli estratti microbici mediante TLC, i metaboliti devono essere dispersi verticalmente lungo la piastra TLC. Sotto la luce visibile, può essere difficile visualizzare i metaboliti che non assorbono nell'intervallo della luce visibile. Pertanto, l'imaging sotto luce UV può aiutare a visualizzare la separazione dei metaboliti, come mostrato nella Figura 2A, B. Dopo il periodo di incubazione, l'agente patogeno dovrebbe sembrare crescere uniformemente su tutta la piastra, tranne che sui controlli positivi e sulle zone di inibizione in cui risiedono i metaboliti attivi, illustrati nella Figura 2C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig02v2.jpg"> Figura 2: Separazione di estratti microbici mediante TLC. (A) Piastra TLC sviluppata contenente nove estratti di Bacillus ripresi alla luce visibile e (B) alla luce UV a 320 nm prima dell'applicazione dell'inoculo fungino. (C) Saggio bioautografico completato con crescita di agenti patogeni osservata su tutta la piastra, ad eccezione dei casi in cui la crescita è inibita intorno ai controlli positivi e ZOI di ciascun estratto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig02largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I metaboliti estratti dalle zone di inibizione vengono analizzati mediante LC-MS e confrontati con l'estratto grezzo per determinare le NP responsabili dell'antagonismo nei confronti del patogeno. I metaboliti corrispondenti dovrebbero avere lo stesso tempo di ritenzione e le stesse specie ioniche molecolari per essere considerati compatibili. Una volta identificati i metaboliti attivi, la coltura batterica può essere coltivata in massa per isolare i metaboliti attivi di interesse per la chimica strutturale o lo studio biologico.

Descriviamo l'uso della cromatografia su strato sottile, del saggio di bioautografia diretta e della cromatografia liquida-spettrometria di massa per identificare prodotti naturali microbici che mostrano antagonismo contro i patogeni fungini, utilizzando il patogeno Sclerotinia sclerotiorum e gli isolati di Bacillus biopesticida come sistema modello.

Identificazione guidata da biotest di prodotti naturali per il biocontrollo mediante cromatografia su strato sottile-Bioautografia diretta

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are ...

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