Name: Protocollo ottimizzato per Swiss Rolls intestinali e colorazione in immunofluorescenza di tessuto incluso in paraffina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Scopri la tecnica Swiss roll per la fissazione e l'immunofluorescenza di tessuto intestinale incluso in paraffina usando un modello murino. Questo metodo consente la visualizzazione dettagliata di tutte le regioni intestinali in un unico blocco.

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Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni K01 DK121869 del National Institutes of Health (NIH) ad ACE e questa pubblicazione è stata supportata in parte da T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) e dalle sovvenzioni HCS a SAD & RS. Questo lavoro è stato supportato da fondi di avvio della Medical University of South Carolina (MUSC) ad ACE ed è stato supportato dal MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) e dal COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). L'imaging è stato eseguito utilizzando il nucleo di imaging cellulare e molecolare presso MUSC.

Efficiente metodo Swiss Roll per l'immunocolorazione di alta qualità del tessuto intestinale

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<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui presentiamo un metodo ottimizzato per la fissazione dei tessuti utilizzando la tecnica del rullo svizzero per preservare l'architettura intestinale e promuovere un'accurata immunocolorazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per indagare un'ampia varietà di domande di ricerca che coinvolgono la fisiologia intestinale e la biologia cellulare19. Sono stati pubblicati diversi metodi di laminazione svizzeri ottimizzati che sono molto utili20,21. Un vantaggio di questa tecnica è la facilità di aprire con precisione l'intestino su carta da filtro. Ciò consente di fissare il tessuto in piano, impedendo al tessuto di arricciarsi verso l'interno durante il rotolamento, il che è particolarmente utile quando si analizza il tessuto infiammato con muscolo ispessito. Inoltre, è essenziale evidenziare il ruolo critico del sezionamento tissutale nel raggiungimento di risultati affidabili. Un corretto sezionamento garantisce la conservazione dell'architettura tissutale e facilita l'immunocolorazione accurata, contribuendo in ultima analisi al successo delle analisi a valle11. L'approccio ottimizzato è meno difficile rispetto ad altri protocolli, producendo risultati coerenti tra individui diversi. La tecnica proposta in questo articolo fornisce anche un'architettura tissutale ben conservata, versatilità e immunocolorazione altamente riproducibile utilizzando diversi anticorpi.
Un aspetto critico di questo protocollo è il tempo di fissazione e di elaborazione. La fissazione e l'elaborazione impropria dei tessuti possono compromettere le analisi istochimiche. Il tessuto troppo fissato diventa fragile, mentre il tessuto troppo poco fissato rimane troppo morbido. Sia i tessuti sovra che quelli sottofissati sono difficili da sezionare e compromettono l'immunocolorazione. Una volta sezionato su carta da filtro, il tessuto deve essere immediatamente posto in formalina per ridurre le alterazioni post-mortem22. In questo protocollo, il tessuto murino viene fissato in formalina durante la notte. Diversi studi hanno utilizzato questo tempo di fissazione 20,23,24. Tuttavia, Boenisch et al. hanno dimostrato che l'immunocolorazione è coerente nei tessuti fissati in formalina per un massimo di 4 giorni25. L'ottimizzazione del tempo di fissaggio e del fissativo è necessaria a seconda delle analisi desiderate. Ad esempio, il fissativo di Carnoy è spesso preferito per la colorazione del muco26. La scelta dei fissativi e la durata del tempo di fissazione dovrebbero essere ottimizzate da ciascun ricercatore a seconda del proprio approccio sperimentale. Si consiglia l'uso di un processatore di tessuti automatizzato per garantire tempi di lavorazione accurati e coerenti. Il nostro laboratorio utilizza piccoli perni per tenere in posizione il tessuto intestinale come rotoli. Senza perni, il tessuto può srotolarsi durante la lavorazione. Poiché questi perni sono piuttosto piccoli e affilati, è necessario prendere precauzioni. Si consiglia di utilizzare tronchesi per rimuovere l'estremità affilata del perno prima della lavorazione dei tessuti. Alcuni nuclei istologici non accettano tessuti con perni; Pertanto, è meglio controllare prima dell'uso. Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare l'agar per ancorare il tessuto prima della lavorazione27 o le spugne a cassetta potrebbero essere utilizzate nelle cassette per aiutare a mantenere i rotoli.
L'immunocolorazione è un protocollo che richiede l'ottimizzazione per ogni anticorpo. L'uso di anticorpi convalidati knockout è raccomandato quando possibile. Questo metodo per la fissazione e l'elaborazione dei tessuti consente una colorazione chiara, consentendo una facile identificazione del legame con gli anticorpi rispetto al segnale di fondo quando vengono utilizzati anticorpi non convalidati. La scelta del fissativo, il recupero dell'antigene e la diluizione degli anticorpi possono influire sulla specificità dell'anticorpo. Raccomandiamo ai ricercatori di valutare attentamente e ottimizzare il protocollo regolando la fissazione, il recupero dell'antigene e il tempo di incubazione per ciascun anticorpo. Per ottenere i migliori risultati, gli anticorpi devono essere testati a varie diluizioni per determinare la concentrazione ottimale e in diversi tamponi di recupero dell'antigene. Il recupero dell'epitopo migliora l'immunocolorazione rompendo i ponti di metilene che si formano durante la fissazione. In questo protocollo, viene utilizzato il recupero degli epitopi indotto dal calore piuttosto che il recupero degli epitopi indotto dal proteolitico perché è più probabile che la digestione enzimatica interrompa la morfologia dei tessuti28. I tamponi per il recupero degli epitopi indotti dal calore più comuni sono il tampone citrato, il tris-HCl e il tris-EDTA, con il tampone citrato che è il più delicato sulla morfologia dei tessuti29. La scelta del tampone varia e deve essere determinata per ciascun anticorpo. Molti tamponi per il recupero dell'antigene, soluzioni bloccanti e diluenti anticorpali sono disponibili in commercio. Tuttavia, queste soluzioni possono essere estremamente costose e proibitive. Abbiamo fornito ricette di soluzioni comuni per il recupero dell'antigene e soluzioni di diluenti bloccanti e anticorpali per garantire l'efficacia dei costi. 
Una limitazione di questo metodo è che la fissazione e l'elaborazione possono alterare i tessuti e mascherare gli epitopi. Un approccio alternativo consiste nell'immunocolorare i tessuti freschi congelati. Il tessuto fresco congelato viene congelato a scatto, consentendo di evitare l'esposizione a fissativi tossici, preservando la struttura proteica e migliorando l'accessibilità di alcuni epitopi. Tuttavia, l'architettura e la morfologia dei tessuti sono più povere di quelle dei tessuti fissati e inclusi in paraffina. Ulteriori sfide del tissue fresco congelato includono i materiali e la logistica necessari per sezionare e stoccare blocchi e vetrini congelati. L'analisi dei rotoli svizzeri rispetto a strisce di tessuto intestinale mostra differenze nell'altezza e nella larghezza dei villi e differenze nelle cellule immunitarie nella lamina propria, come descritto in un precedente rapporto30. Questi risultati suggeriscono che gli involtini intestinali alterano alcune caratteristiche intestinali, che dovrebbero essere prese in considerazione quando si pianificano gli esperimenti. Inoltre, è necessaria la riconvalida degli anticorpi poiché molti anticorpi che si legano specificamente al tessuto incluso nella paraffina fissato in formalina non si colorano bene nel tessuto fresco congelato31.
L'immunocolorazione del tessuto intestinale può essere utilizzata per rispondere a un'ampia varietà di domande riguardanti la biologia e la fisiologia delle cellule gastrointestinali. Questa tecnica è ampiamente utilizzata per identificare le alterazioni epiteliali nel contesto dell'infiammazione intestinale, a seguito di infezione batterica e durante la progressione del cancro. Il metodo qui presentato è ideale per la conservazione del tessuto intestinale perché è economico, non tecnicamente impegnativo e altamente riproducibile. Per garantire i migliori risultati, incoraggiamo l'ottimizzazione delle fasi delineate in questo protocollo in base al disegno sperimentale e all'ipotesi in fase di test.

L'architettura cellulare dell'intestino rappresenta una sfida unica nel mantenere la sua integrità strutturale quando il tessuto intestinale viene preservato per l'immunocolorazione. L'intestino tenue è costituito da strutture allungate simili a dita note come villi1. Questi villi spesso diventano malformati durante i processi di inclusione. Garantire che i ricercatori dispongano di tecniche per incorporare correttamente gli intestini per ottenere sezioni trasversali, consentendo la visualizzazione di tutte le regioni dell'intestino, nonché degli strati che compongono l'intestino (ad esempio, la muscularis propria, la mucosa e la sierosa), è fondamentale per una solida analisi sperimentale2. Una fissazione inadeguata, una fissazione eccessiva e una manipolazione impropria dei tessuti compromettono l'integrità dei tessuti, con conseguente danno involontario all'epitelio intestinale 3,4. Danneggiare l'epitelio intestinale durante queste fasi può ridurre significativamente la qualità delle analisi successive, come l'immunofluorescenza, indipendentemente dall'efficacia dei protocolli di immunoistochimica e degli anticorpi impiegati.
L'immunocolorazione, come una corretta fissazione dei tessuti, è una parte importante della ricerca biomedica. Se fatta bene, l'immunocolorazione può illuminare aspetti precedentemente sconosciuti della struttura e della funzione cellulare. La colorazione in immunofluorescenza delle sezioni di paraffina può essere difficile a causa delle modifiche fisico-chimiche derivanti dal processo di fissazione e inclusione della paraffina5. La fissazione e l'inclusione della paraffina provocano il mascheramento dell'antigene che può interferire con la rilevazione in immunofluorescenza degli epitopi di interesse6. La fissazione ritardata può indurre la degradazione proteolitica, che si traduce in una colorazione indebolita o assente degli epitopi critici7. Inoltre, gli anticorpi sono spesso imprecisi con alti livelli di background. I protocolli di immunocolorazione che promuovono un legame anticorpale coerente e specifico e un elevato rapporto segnale/rumore possono fornire informazioni preziose per i ricercatori. 
In questo caso, forniamo un protocollo completo progettato per ottenere immagini di immunofluorescenza di alta qualità attraverso la fissazione del tessuto intestinale, la preparazione di rotoli svizzeri8 e l'immunocolorazione. Sottolineando le linee guida per preservare l'integrità dell'intestino, il protocollo mira a fornire ai ricercatori una solida metodologia per migliorare la qualità e l'affidabilità degli studi di imaging in immunofluorescenza. Abbiamo anche cercato di utilizzare risorse convenienti, tra cui carta da filtro e recupero dell'antigene fatto in casa, soluzioni bloccanti e diluenti anticorpali per rendere il protocollo più accessibile ai laboratori che potrebbero avere fondi limitati. Come per tutti i protocolli sperimentali, i ricercatori dovrebbero ottimizzare il protocollo attuale in base al loro approccio sperimentale e alle aree di interesse.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENINA</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro in cellulosa</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Carta Whatman spessa</td></tr><tr><td>Vetrini in vetro caricato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Perni da dissezione misura 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R& D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Guanti da congelatore</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Scaldavetrini</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Scienze di microscopia elettronica</td><td>64111-04</td><td>Reagente di pulizia</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Penna idrofobica</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>Cassette grandi</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Strumenti di scienza</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Mouse-on-mouse blocking reagent</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>Blocco topo su topo</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Pentola a pressione</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong oro antisbiadimento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Mezzo di montaggio</td></tr><tr><td>Pinza ad azione inversa</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Rack per vetrini</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Set per la colorazione dei vetrini</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Piastre resistenti ai solventi e struttura in metallo</td></tr><tr><td>Piccole cassette Fisherbrand</td><td></td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina di teleosteina</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Tampone di blocco</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Salviette</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xileni</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTINA</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo ottimizzato per swiss rolls intestinali e colorazione in immunofluorescenza di tessuto incluso in paraffina

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

L'intestino è un organo complesso composto dall'intestino tenue e dall'intestino crasso. L'intestino tenue può essere ulteriormente suddiviso in duodeno, digiuno e ileo. Ogni regione anatomica dell'intestino ha una funzione unica che si riflette nelle differenze nella struttura cellulare. Indagare sui cambiamenti nell'intestino richiede un'analisi approfondita delle diverse regioni dei tessuti e delle alterazioni cellulari. Per studiare l'intestino e visualizzare grandi pezzi di tessuto, i ricercatori usano comunemente una tecnica nota come involtini svizzeri intestinali. In questa tecnica, l'intestino è diviso in ciascuna regione anatomica e fissato in un orientamento piatto. Quindi, il tessuto viene accuratamente arrotolato e lavorato per l'inclusione della paraffina. La corretta fissazione e orientamento dei tessuti è una tecnica di laboratorio spesso trascurata, ma è di fondamentale importanza per l'analisi a valle. Inoltre, un rotolamento svizzero improprio del tessuto intestinale può danneggiare il fragile epitelio intestinale, portando a una scarsa qualità dei tessuti per l'immunocolorazione. Garantire un tessuto ben fissato e correttamente orientato con strutture cellulari intatte è un passo cruciale che garantisce una visualizzazione ottimale delle cellule intestinali. Presentiamo un metodo semplice ed economico per la produzione di involtini svizzeri che include tutte le sezioni dell'intestino in un unico blocco incorporato in paraffina. Descriviamo anche la colorazione ottimizzata in immunofluorescenza del tessuto intestinale per studiare vari aspetti dell'epitelio intestinale. Il seguente protocollo fornisce ai ricercatori una guida completa per ottenere immagini di immunofluorescenza di alta qualità attraverso la fissazione del tessuto intestinale, la tecnica Swiss-roll e l'immunocolorazione. L'impiego di questi approcci raffinati preserva l'intricata morfologia dell'epitelio intestinale e favorisce una comprensione più profonda della fisiologia intestinale e della patobiologia.

È stata eseguita la colorazione con ematossilina ed eosina (H&amp;E), come precedentemente descritto12. Utilizzando il metodo ottimizzato, gli involtini intestinali svizzeri includevano tutti e tre i segmenti dell'intestino tenue e dell'intestino crasso in un unico vetrino. Avere l'intero intestino alloggiato su un vetrino consente ai ricercatori di analizzare i cambiamenti in tutte le parti dell'intestino e consente di risparmiare sui costi di sezionamento e colorazione dei reagenti (Figura 1). Inoltre, l'esposizione simultanea di tutti i segmenti intestinali alle stesse soluzioni durante l'immunocolorazione aiuta a garantire risultati accurati. La micrografia H&amp;E dimostra l'architettura intestinale preservata di tutte le porzioni dell'intestino tenue e dell'intestino crasso (Figura 2). La misurazione dei villi duodenali non ha mostrato differenze significative nell'altezza dei villi nel tessuto intestinale non aperto rispetto a questo metodo Swiss roll, suggerendo che l'apertura dell'intestino non interrompe l'architettura tissutale (Figura 2D). L'immunocolorazione dei rotoli intestinali mostra i vari strati dell'intestino e l'intero asse della cripta villosa. Le immagini fluorescenti mostrano bassi livelli di fondo dovuti alla colorazione degli anticorpi primari e secondari e raffigurano chiaramente le singole cellule presenti nell'epitelio. La Figura 3 mostra la morfologia dei diversi segmenti intestinali e la colorazione delle cellule caliciformi (cellule MUC2 positive)13, della membrana apicale (γ-ACTIN)14, della membrana laterale delle cellule epiteliali (E-CADHERIN)15 e dei nuclei. Questo protocollo è adatto per identificare molti compartimenti cellulari diversi, tra cui le cellule proliferative (PCNA)16, l'interstizio (LAMININA; Figura 4A) 17, il dominio lisosomiale (LAMP1)14 e l'epitelio (β-catenina; Figura 4B) 18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro per la preparazione e la lavorazione dei rotoli intestinali svizzeri. (A) I segmenti intestinali vengono lavati con una siringa contenente PBS e poi lavati in PBS. (B) Il tessuto intestinale umido viene quindi posto su carta da filtro asciutta. (C) L'intestino viene tagliato longitudinalmente su carta da filtro e (D) leggermente allargato. (E) Un pezzo di carta da filtro viene posato sopra l'intestino aperto e l'intestino viene delicatamente inserito tra la carta da filtro e pinzato. I segmenti intestinali vengono fissati durante la notte e (F) viene arrotolato con una pinza. (G) L'intestino viene delicatamente rimosso dalla pinza ad azione inversa e (H) ha un aspetto a rosetta. (I, J) Il tessuto intestinale viene bloccato e posto in una grande cassetta. (K) Tutti e quattro i segmenti intestinali sono collocati nella stessa cassetta per il trattamento e l'inclusione dei tessuti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> Figura 2: Colorazione con ematossilina ed eosina di tutti e quattro i segmenti dell'intestino. (A) La scansione delle piastrelle dimostra la capacità di visualizzare l'intero intestino in un unico vetrino con singoli rotoli svizzeri del duodeno, del digiuno, dell'ileo e del colon. (B) Micrografia di un rotolo svizzero intestinale e (C) inserto con ingrandimento maggiore per mostrare l'architettura dei villi e della cripta. (D) La quantificazione della lunghezza dei villi dell'intestino tenue non mostra differenze significative tra tessuto arrotolato svizzero e tessuto non aperto. Barre di scala = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> Figura 3: Colorazione in immunofluorescenza di tutti e quattro i segmenti dell'intestino. I topi adulti di controllo C57BL/6J sono stati immunocolorati per nuclei (ciano), il marcatore della membrana laterale, E-CADHERIN (verde), cellule caliciformi identificate da MUC2 (giallo) e il marcatore apicale del bordo del pennello, γ-ACTIN, (magenta). Barre di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> Figura 4. Colorazione in immunofluorescenza dell'intestino. (A) Una micrografia rappresentativa della colorazione in immunofluorescenza dell'intestino di topo evidenzia nuclei (ciano), cellule proliferative, PCNA (verde) e lamina propria, LAMININA (magenta). (B) Immagine di immunofluorescenza che identifica i nuclei (ciano), il marcatore della membrana cellulare β-catenina (verde) e il marcatore lisosomiale LAMP1 (magenta) nell'intestino. Barre di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'intestino è vitale per la digestione e l'assorbimento. Ogni regione - duodeno, digiuno, ileo, colon - svolge funzioni distinte a causa di strutture cellulari uniche. Lo studio della fisiologia intestinale richiede un'analisi meticolosa dei tessuti. Questo protocollo delinea la fissazione e la lavorazione dei tessuti utilizzando la tecnica del rullo svizzero, garantendo un'immunocolorazione accurata attraverso un'adeguata conservazione e orientamento dei tessuti.

Protocollo ottimizzato per Swiss Rolls intestinali e colorazione in immunofluorescenza di tessuto incluso in paraffina

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

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Questo video illustra un metodo basato sull'immunofluorescenza per visualizzare le cellule del ciuffo intestinale in criosezioni di digiuno di topo fluttuanti. All'interno dei villi intestinali, la co-localizzazione della fluorescenza verde all'apice luminale con una massa estesa di radichette rosse indica la presenza di cellule del ciuffo.

Un metodo basato sull'immunofluorescenza per la visualizzazione delle cellule del ciuffo nelle criosezioni di digiuno

Il protocollo qui descritto è per la valutazione strutturale di una preparazione retinica a montaggio intero. Ciò include le descrizioni della dissezione tissutale, il montaggio su un inserto di membrana in politetrafluoroetilene idrofilizzato (PTFE), il caricamento del bolo con marcatori fluorescenti e un confronto della fissazione con carbodiimmide e paraformaldeide per l'analisi immunoistochimica dei componenti cellulari e sinaptici.

Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Cellule intestinali staminali epiteliali (ISC) sono mescolati con le cellule Paneth. Queste cellule sono differenziate progenie della ISC, che supportano la ISC e fornire protezione antibatterica. Qui mostriamo come abbiamo utilizzato modelli transgenici condizionali mouse per stabilire che le cellule Paneth svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento degli epiteli intestinali.

Protocolli per l&#39;analisi del ruolo delle cellule Paneth in Rigenerazione della murino Intestino con condizionale<em&gt; Cre-lox</em&gt; Modelli mouse

accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l'imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l'identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse.

Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza

Vi presentiamo i protocolli per l'isolamento di strutture 3D intestinale dal tessuto in vivo e in vitro matrice seminterrato embedded organoids e dettaglio diversi fissazione e che macchia i protocolli ottimizzati per immuno-etichettatura dei microtubuli, proteine centrosomali e giunzionale pure delle cellule indicatori compreso le proteine delle cellule staminali Lgr5.

Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

Kuga et al. scoperto che stato di fosforilazione anticorpi specifici contro l'actina associazione proteina girdin fosforilata in tirosina 1798 (pY1798) possa essere usato per marcare le cellule ciuffo (TCs). Questo protocollo permette la visualizzazione robusto di TCs usando la macchiatura immunofluorescente del digiuno digalleggiante cryosections con gli anticorpi pY1798.

Uso di anticorpi Anti-fosfo-girdin per visualizzare cellule intestinali ciuffo in Mouse digalleggiante digiuno Cryosections

Il punteggio sistematico dell'infiammazione intestinale utilizzando un sistema assistito da computer gratuito è un potente strumento per confrontare quantitativamente i cambiamenti istopatologici nei modelli di colite caratterizzati dalla presenza di ulcere e cambiamenti infiammatori. La valutazione del punteggio della colite istologica rafforza le osservazioni cliniche e facilita l'interpretazione dei dati.

Analisi sistematica del punteggio per l'infiammazione intestinale in un modello di colite indotta da solfato di sodio di Murine

Questo protocollo semplificato descrive in dettaglio un flusso di lavoro per rilevare e visualizzare batteri in campioni di tessuto complessi, dal fissaggio del tessuto alla colorazione dei microbi con ibridazione fluorescente in situ .

Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione della lectina e imaging

Il nostro protocollo dettagliato delinea la creazione e l'uso del modello avanzato di intestino su chip, che simula la mucosa intestinale umana con strutture 3D e vari tipi di cellule, consentendo un'analisi approfondita delle risposte immunitarie e delle funzioni cellulari in risposta alla colonizzazione microbica.

Modello immunocompetente Intestino-on-Chip per l'analisi delle risposte immunitarie della mucosa intestinale

Questo protocollo delinea un metodo di immunocolorazione dell'intero stomaco modificato dalla tecnica "Swiss roll" originariamente sviluppata per l'intestino murino.

Mappatura spaziale migliorata degli strati muscolari gastrici del topo utilizzando una tecnica modificata dello Swiss Roll

Scopri la tecnica Swiss roll per la fissazione e l'immunofluorescenza di tessuto intestinale incluso in paraffina usando un modello murino. Questo metodo consente la visualizzazione dettagliata di tutte le regioni intestinali in un unico blocco.

Protocollo ottimizzato per Swiss Rolls intestinali e colorazione in immunofluorescenza di tessuto incluso in paraffina

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