Name: Circuiti immunometabolici nellinfezione per lavanzamento delle terapie dirette allospite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Scopri i circuiti sintetici controllati dalla tetraciclina per eliminare Leishmania major e modulare le citochine. Questo protocollo offre una strategia innovativa per terapie immunometaboliche mirate.

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Gli autori desiderano ringraziare il Direttore del Biotechnology Research and Innovation Council- National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS), Pune per aver sostenuto la nostra ricerca e la BRIC-NCCS Bioinformatics Facility.

Progettazione di circuiti sintetici controllati da tetraciclina per la terapia della leishmaniosi

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I risultati ottenuti sottolineano l'efficienza della tubazione, che è stata canalizzata per la progettazione e l'implementazione di un circuito sintetico. La costruzione di questo circuito sintetico è stato un passo verso lo sviluppo della medicina di precisione per malattie infettive come la leishmaniosi. Attraverso l'assemblaggio in silico di parti genetiche e la simulazione deterministica, è stato monitorato l'effetto modulatorio distinto del sistema TetON. L'effetto del circuito, in particolare, potrebbe aver portato all'espressione bistabile reciproca di TetR e SDHA/GFP. L'espressione di SDHA era periodica, il che potrebbe indicare che solo in presenza di doxiciclina la sua espressione era aumentata. Per osservare potenziali cambiamenti nei modelli di espressione in un periodo, è stata selezionata un'unità di tempo di 100. I risultati identificano che il circuito sintetico ha mostrato un comportamento periodico per TetR e SDHA/GFP, probabilmente attribuibile alla sua natura ortogonale21. L'assemblaggio di parti genetiche dal registro delle parti iGEM ha svolto un ruolo fondamentale, in quanto ha fornito i componenti genetici necessari per la costruzione di circuiti sintetici22. La disposizione modulare delle parti genetiche è essenziale in quanto la traduzione e il funzionamento del circuito potrebbero essere influenzati, il che potrebbe portare a un'espressione inefficiente e a un effetto modulatorio nelle cellule23.
La dimensione dell'inserto del circuito sintetico era di circa 1,3 kb per garantire che la dimensione del vettore non fosse troppo grande, il che potrebbe potenzialmente ridurre l'efficienza di trasformazione24. La selezione di un vettore appropriato è un passaggio critico in quanto deve possedere parti genetiche, che sono essenziali per aumentare il numero di copie nel sistema batterico e produrre un'elevata copia plasmidica, e il suo meccanismo di espressione deve adattarsi bene nel sistema dei mammiferi25. Il vettore pEGFP-N1 è ben caratterizzato nella linea cellulare RAW264.7 e possiede una struttura plasmidica compatta con un sito di clonazione multiplo26. Per l'isolamento dei plasmidi sono state impiegate soluzioni tampone standardizzate in laboratorio per garantire la produzione di plasmidi altamente concentrati e puri, che è stata convalidata attraverso la stima spettrofotometrica e l'AGE. L'inserimento del circuito sintetico nel vettore pEGFP-N1 è stato convalidato attraverso la digestione di restrizione e i campioni sono stati analizzati su AGE e sequenziamento. I risultati di AGE rappresentavano una banda di 1,3 kb di inserto, una banda di 4,7 kb di vettore pEGFP-N1 e una banda di 6 kb dell'intero circuito sintetico. 
È stata eseguita la trasfezione utilizzando il rapporto 1:1, 1:2 e 2:1 del DNA: rapporti PEI, dove il rapporto osservato di 1:1 ha funzionato meglio senza interrompere la morfologia cellulare (dati non mostrati). Si consiglia di utilizzare una concentrazione di 400 μg/mL - 1000 μg/mL di G418 per la selezione di cellule trasfettate27. Per la selezione delle cellule trasfettate è stato utilizzato un 500 μg/mL di G418 in quanto ha soppresso efficacemente la crescita delle cellule non trasfettate senza compromettere la crescita cellulare o la morfologia delle cellule trasfettate (dati non mostrati). Data l'importanza del fenotipo cellulare nell'efficienza della trasfezione, in particolare nelle linee cellulari di macrofagi, che possono subire differenziazione e diventare difficili da trasfettare, per la trasformazione28 è stato utilizzato un basso numero di passaggi della linea cellulare RAW264.7. Il numero di passaggi cellulari potrebbe anche essere un fattore critico nell'efficienza della trasfezione. Un numero di passaggi elevato può portare a una trasfezione inefficiente29. Dox è l'induttore preferito per il sistema di induzione Tet-ON grazie alla sua elevata efficienza di legame con TetR, alla distribuzione tissutale favorevole, alla bassa tossicità e a un'emivita di 24 oree 30. Dopo la trasfezione, le cellule sono state indotte con dox per 24 ore e sono state osservate per l'espressione di GFP. Per le cellule RAW264.7, la concentrazione di dox utilizzata per l'induzione del circuito sintetico era di 1 μg/mL, che rientra nell'intervallo raccomandato di 1-2 μg/mL31 (dati non mostrati). Tuttavia, la regolazione della concentrazione di SDHA dopo l'induzione è stata indeterminata. Nel complesso, la determinazione e la standardizzazione del numero di passaggi cellulari, la concentrazione di DNA: PEI, la concentrazione del marcatore di selezione della trasfezione nei mammiferi e la concentrazione di induzione della doxiciclina sono fattori cruciali nel processo di trasfezione.
A seguito dell'induzione del circuito sintetico post-infezione in diversi punti temporali, è stata osservata una significativa riduzione del carico di parassiti intracellulari. Un confronto delle cariche di parassiti tra campioni infetti e IMTI ha rivelato un carico inferiore nelle cellule indotte dal circuito sintetico, probabilmente attribuibile all'espressione di SDHA. Poiché l'espressione di SDHA è associata alla produzione di NO, è stato osservato che le cellule IMTI hanno una forma morfologica irregolare e ruvida, che si verifica nella linea cellulare RAW264.7 quando viene prodotto NO32. I livelli di IL-10 e IL-12 dopo l'infezione di 6 ore erano più alti poiché entrambe le citochine sono state segnalate per essere sovraregolate in questo momento, che subisce ulteriori modifiche fenotipiche per produrre IL-10 più di IL-1219. Poiché i livelli di IL-10 e IL-12 non hanno alterato significativamente la post-trasfezione e nei campioni IMTI, è stata eseguita la profilazione delle citochine per rilevare le risposte pro-infiammatorie e anti-infiammatorie delle citochine. 
I livelli di espressione di TNF-α, IFN-γ e TGF-β sono stati identificati in campioni di infezione a 6 ore, IMT e IMTI a 24 ore. Per eliminare i parassiti intracellulari, il TNF-α e l'IFN-γ sono principalmente essenziali in quanto inducono esplosioni ossidative attraverso la produzione di NO. I macrofagi polarizzati M2 esprimono TGF-β, che sottoregola le citochine pro-infiammatorie33. Il campione IMTI delle 24 ore ha mostrato un aumento dell'espressione di TNF-α e IFN-γ rispetto al TGF-β, il che suggerisce che i macrofagi, dopo la trasfezione e l'infezione con L. major, potrebbero essersi polarizzati in un fenotipo che esprime citochine pro-infiammatorie. Lo studio, quindi, fornisce informazioni sulle alterazioni fenotipiche indotte in seguito alla trasfezione con un circuito sintetico e mette in evidenza le dinamiche dell'infezione. L'effetto dei circuiti sintetici come terapia può essere studiato in quanto la loro induzione ha aumentato significativamente l'espressione di citochine pro-infiammatorie rispetto alle citochine anti-infiammatorie. Pertanto, lo studio non solo ha stabilito la pipeline di costruzione e somministrazione del circuito sintetico, ma ha anche dimostrato il suo potenziale terapeutico in un modello di leishmaniosi attraverso l'upregulation delle citochine pro-infiammatorie nelle cellule ospiti sfidate dalla Leishmania.

Il progresso della medicina olistica e integrativa è un legame significativo che è stato identificato tra le alterazioni metaboliche nelle cellule immunitarie e la loro capacità di modulare il fenotipo delle cellule immunitarie nelle malattie infettive. L'immunometabolismo offre nuove prospettive per chiarire la patogenesi delle malattie infettive prevalenti nell'uomo. Inoltre, fornisce tecniche promettenti per lo sviluppo di vaccini e farmaci identificando nuovi bersagli per l'intervento1. La riprogrammazione metabolica delle cellule immunitarie è identificata in varie malattie infettive, tra cui la leishmaniosi. Leishmania spp. è responsabile della leishmaniosi, di cui la Leishmania major (L. major) causa la leishmaniosi cutanea (CL). I parassiti L. major provocano un impatto significativo sul metabolismo delle cellule ospiti, in particolare nei macrofagi, per la proliferazione e la sopravvivenza come parassiti intracellulari2. I macrofagi possono tipicamente polarizzarsi in sottogruppi classicamente attivati (M1) o attivati in modo alternativo (M2) in cui le cellule M1 possiedono un'elevata secrezione di citochine pro-infiammatorie e la produzione di ossido nitrico (NO) attraverso il metabolismo delle specie azotate. Le cellule M2 mostrano livelli elevati di citochine antinfiammatorie e mostrano un'elevata attività dell'arginasi attraverso il metabolismo dell'azoto3. Pertanto, entrambi i fenotipi differiscono non solo per la loro risposta immunitaria, ma anche per le loro vie metaboliche.
La biologia dei sistemi della leishmaniosi mira a identificare bersagli molecolari per la progettazione di nuove terapie attraverso la progettazione e lo sviluppo di farmaci. La ricostruzione delle reti di segnalazione e delle vie metaboliche aiuta a comprendere la leishmaniosi come modello olistico e trae informazioni per l'identificazione della componente principale che guida lo stato patologico. La modellazione matematica è uno degli approcci analitici applicati più favoriti per comprendere le complessità della leishmaniosi4. Le reti immunometaboliche e i modelli matematici hanno permesso l'identificazione della succinato deidrogenasi (SDHA) come componente chiave del fenotipo M1, che è espresso per eliminare il parassita5. La biologia sintetica ha applicazioni nella diagnostica, nello sviluppo di vaccini e nella terapia nella leishmaniosi. Il metabolismo mirato alla modulazione della risposta immunitaria può essere ottenuto attraverso strumenti di biologia sintetica. Per la modulazione dell'inositolo fosforil ceramide sintasi che regola il metabolismo degli sfingolipidi e altera la segnalazione immunitaria dell'ospite, è stato utilizzato un circuito genetico che possedeva un comportamento bistabile per regolare sinteticamente la robustezza intrinseca del modello di infezione da L. major 6,7. Pertanto, i sistemi e la biologia sintetica possono fornire una piattaforma di ingegneria genetica basata su modelli per lo sviluppo della medicina di precisione nel sistema modello Leishmania.
Il fenotipo M1 è caratterizzato dall'espressione di reti di segnalazione immuno-metabolica in cui la produzione di citochine infiammatorie e vie metaboliche migliora sinergicamente l'eliminazione del parassita. La polarizzazione M1 indica la produzione di citochine pro-infiammatorie come l'interleuchina-12 (IL-12), l'interferone-gamma (IFN-γ) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Le vie metaboliche che sono altamente arricchite nel fenotipo M1 includono la glicolisi, la via del pentoso fosfato e il ciclo troncato dell'acido tricarbossilico (ciclo TCA)5. Il ciclo troncato del TCA dirige il meccanismo di eliminazione dei parassiti attraverso l'aumento dei livelli di succinato e citrato, che guidano la produzione di NO3. L'accumulo di succinato da parte di SDHA porta all'attivazione del fattore di trascrizione ipossia-inducibile fattore 1-alfa (HIF-1α), che induce la produzione di IL-1β8. Nel fenotipo M2, si osserva l'ossidazione degli acidi grassi, l'aumento dell'utilizzo della glutammina e l'aumento della fosforilazione ossidativa del glucosio insieme alla produzione di citochine antinfiammatorie come l'interleuchina-10 (IL-10), il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β), l'interleuchina-4 (IL-4) e l'interleuchina-13 (IL-13)3. M2 presenta mitocondri allungati come caratteristica distintiva, che porta a una maggiore efficienza nella generazione di energia. Utilizzano acidi grassi, glucosio e glutammina come substrati per alimentare il ciclo del TCA, generando così ATP attraverso la fosforilazione ossidativa a un tasso più elevato per promuovere la crescita e la proliferazione dei parassiti9. L'enzima SDHA, responsabile dell'accumulo di succinato attraverso il TCA troncato, non solo può promuovere la produzione di NO, ma anche avviare un consumo di ossigeno succinato-dipendente attraverso il trasporto di elettroni10. Nei macrofagi infetti da Leishmania, l'SDHA viene sottoregolata di 2,17 volte, indicando che anche la respirazione aerobica potrebbe essere sottoregolata11. Al fine di aumentare il consumo di succinato per indurre la produzione di NO mediata da citochine pro-infiammatorie e promuovere l'eliminazione del parassita, l'espressione di SDHA è essenziale.
Il circuito sintetico offre terapie mirate di precisione che possono alterare il sistema malato per ottenere un'oscillazione bistabile che può ripristinare un fenotipo sano a livello spaziotemporale. L'erogazione e l'espressione del circuito sintetico rendono il sistema dinamico e robusto. Un fattore fondamentale che contribuisce al progresso della biologia sintetica risiede nella capacità di assemblare parti ed elementi genetici in modo modulare per consentire la generazione di architetture complesse e funzionalità su misura12. I vincoli associati alle tecniche di espressione tradizionali hanno stimolato l'emergere di circuiti sintetici plasmidici inducibili basati su operoni tetraciclina, consentendo così una rapida valutazione del plasmide e una facile somministrazione in vari tipi di cellule13. La proteina repressore tetraciclina-responsiva (TetR), quando esiste come dimero, mostra una forte affinità di legame con l'operone tet (TetO), sopprimendo efficacemente la trascrizione. Tuttavia, in seguito all'interazione del suo ligando, la doxiciclina (dox), il TetR subisce un'alterazione strutturale, con conseguente dissociazione dal TetO, consentendo di conseguenza alla trascrizione di procedere senza ostacoli. Questo circuito può esibire il controllo della traduzione proteica14. Pertanto, attraverso la metodologia definita, il circuito sintetico plasmidico inducibile basato sull'operone tetraciclina progettato è stato in grado di esprimere SDHA nel vettore pEGFP-N1. La valutazione dell'efficienza di trasformazione del circuito e della sua resa ha fornito informazioni sulla competenza di erogazione. Attraverso la digestione di restrizione del vettore, è stata confermata la determinazione dell'efficienza di clonazione. Inoltre, è stata osservata una linea cellulare di macrofagi di topo RAW264.7 trasfettata derivata da macrofagi peritoneali di topi Balb/c per l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) dose-dipendente della doxiciclina nelle cellule trasfettate. Inoltre, l'effetto di eliminazione del parassita nelle cellule trasfettate è stato corroborato con un'espressione del circuito sintetico. Inoltre, è stata osservata l'induzione e l'espressione di citochine pro-infiammatorie, che è stata diretta attraverso un aumento del punto temporale dell'infezione nelle cellule trasfettate e indotte del circuito sintetico, che era direttamente associato al funzionamento del circuito sintetico.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; Punte a L</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di restrizione 10X</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Digestione di restrizione</td></tr><tr><td>Punte da 1 ml</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>provetta da 1 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Punte a L</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>Pallone da 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>colorazione nucleare</td></tr><tr><td>tubo da 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>piastre da 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt ciano/arancione Tampone</td> <td>di caricamentoThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Caricamento di campioni per</td></tr><tr><td>piastra inferiore per vetrino coprioggetto AGE 96 pozzetti</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Per imaging confocale e trasfezione</td></tr><tr><td>Micro piastra di test a 96 pozzetti a fondo piatto</td><td>Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Sigma</td><td></td><td>A9539</td><td>Per AGE</td></tr><tr><td>Assemblaggio di elettroforesi su gel di agarosio</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>Per AGE</td></tr><tr><td>Flusso laminare batterico</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>Per la trasformazione</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Preparazione tampone/reagente</td></tr><tr><td>Flusso d'aria laminare per colture cellulari</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Divaricatore</td><td>cellulare Fischer Centrifuga</td><td>12822775</td><td></td>Scientifica</tr><tr><td>per provette da 1,5mL</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga per 50mL falcon</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofrom</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td>Per l'isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Incubatore a CO2</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>Per cuvetta</td></tr> <tr><td></td><td>per colture cellulariEppendorf</td><td>6138000018</td><td>Stima della concentrazione di plasmidi</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 gel imager</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>Per ETÀ</td></tr><tr><td>DEPC TRATTATO H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td> 750023 <td>Per l'isolamento dell'RNA</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Per l'induzione di cellule trasfettate</td></tr><tr><td>Blocco riscaldante a secco</td><td>Labnet</td><td></td><td>Per la trasformazione e l'inattivazione degli enzimi di restrizione</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium Centro</td><td>nazionale per la scienza</td><td></td> cellulare <td>Per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Tampone / Preparazione dei reagenti</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>Per AGE</td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Tampone / Preparazione dei reagenti</td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro Evos</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>per la costruzione di circuiti sintetici</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Software FV31S-SW</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Acquisizione immagini</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>per trasfezione</td></tr><tr><td>Metodo di assemblaggio Gibson per la clonazione</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Costruzione di un circuito sintetico</td></tr><tr><td>Prisma</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Analisi statistica</td></tr> Kit <tr><td>di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>per la sintesi di cDNA</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Preparazione tampone/reagente</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Per la trasformazione e la selezione delle colonie</td></tr><tr><td>Luria Bertini brodo</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>Per la coltura E.coli</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Preparazione tampone/reagente</td></tr><tr><td>Micro filt Flusso d'aria laminare verticale</td><td>Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Striscia MicroAmp Fast a 8 provette, 0,1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>per qRT-PCR</td></tr><tr><td>Strisce ottiche MicroAmp a 8 tappi</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>per qRT-PCR</td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>per AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman sonde</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman sonde</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman sonde</td></tr> per <tr><td>topo ELISA Kit IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>per ELISA</td></tr><tr><td>per topo ELISA Kit IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>per ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky con touch screen + &mu; Piastra a goccia</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td> per miscelatori di micropiastre <td>ELISA</td></tr><tr><td>MX-M Miscelatore per piastre per colture cellulari a 96 pozzetti Agitatore da laboratorio regolabile 0-1500 giri/min Agitatore da laboratorio</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centro nazionale per le biotecnologie https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td></td> informativo <td>per la costruzione del circuito sintetico</td></tr><tr><td>Camera di Neubauer Marienfeld superior</td><td>640010</td><td></td><td>Per il conteggio delle celle</td></tr><tr><td>Pallone non ventilato da 25 cm2 </td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Per la coltura del parassita</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>Preparazione del reagente</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Per imaging confocale</td></tr><tr><td>Terreni OPTI-MEM</td><td>Terreni di 31985070 Gibco</td><td></td><td>per Trasfezione</td></tr><tr><td>vettore pEGFP-N1 clonato con circuito sintetico</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15070063</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Polietilenimmina</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>per trasfezione</td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Fischer Scientific</td><td>YBP364500</td><td>Preparazione di tamponi/reagenti</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>Preparazione di tampone/reagente</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio Monobasico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Preparazione di tampone/reagente</td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>Per AGE</td></tr><tr><td>Registro delle parti biologiche standard</td><td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>per la costruzione di circuiti sintetici</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>Per l'isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12091021</td><td>Preparazione di tamponi/reagenti</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Centro nazionale per la scienza</td><td></td> cellulare <td>Per la coltura di parassiti</td></tr><tr><td>Incubatore agitatore</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>Per la coltura di E.coli</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>Preparazione di tampone/reagente</td></tr><tr><td>Sodio Dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Preparazione di tampone/reagente</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>Preparazione di tampone/reagente</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Tampone /Reagente </td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Stima della concentrazione di plasmidi</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Tecnologie</td><td>di vita 272006777</td><td>Per qRT-PCR</td></tr><tr><td>StepOne versione software 2.3</td><td>Tecnologie</td><td></td> di vita <td>Per qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker cell</td><td></td><td></td><td>Costruzione e simulazione di circuiti sintetici</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus Scala DNA</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Per AGE</td></tr><tr><td>Tris (idrossimetil) amminometano cloridrato</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>Preparazione tampone / reagente</td></tr><tr><td>Tris-acetato-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>Preparazione tampone/reagente</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Per la conta cellulare</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Enzima di restrizione</td></tr></tbody></table>

circuiti immunometabolici nell'infezione per l'avanzamento delle terapie dirette all'ospite

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

L'immunometabolismo è un fattore determinante nella progressione della leishmaniosi. L'approccio basato sulla biologia sintetica ha raccolto un'attenzione significativa come passo verso un intervento terapeutico mirato ai fattori associati all'ospite che guidano la leishmaniosi. La biologia sintetica comporta l'ingegnerizzazione di componenti genetici in modo ortogonale e modulare per modulare con precisione i sistemi biologici, conferendo nuove funzioni alle cellule. Nello studio presentato, la delucidazione di una pipeline sistematica per lo sviluppo di un circuito sintetico inducibile controllato da tetraciclina (TetON) mirava a fornire succinato deidrogenasi come agente terapeutico per facilitare l'eliminazione dei parassiti intracellulari della Leishmania . Il protocollo delineato descrive la progettazione di un circuito sintetico e la sua successiva validazione. La strategia proposta si concentra anche sull'incorporazione di circuiti sintetici nella spina dorsale del plasmide come veicolo di consegna. Inoltre, nelle linee cellulari di macrofagi murini sono stati utilizzati macchinari di somministrazione che impiegano nanoparticelle basate su poliplessi per la somministrazione di circuiti sintetici senza compromettere la morfologia cellulare. La standardizzazione del metodo è stata condotta per selezionare le cellule trasfettate e determinare la concentrazione di induzione ottimale per l'espressione del circuito sintetico. Le osservazioni rivelano una netta riduzione del carico di parassiti intracellulari nelle cellule trasfettate rispetto alle cellule infette. Le citochine pro-infiammatorie sono state espresse dopo l'infezione in cellule trasfettate e indotte da circuiti sintetici come meccanismo per promuovere l'eliminazione del parassita. Ciò sottolinea che il metodo basato sulla biologia sintetica è un approccio potente nella leishmaniosi, mirando ai fattori dell'ospite associati alla progressione della malattia.

La disposizione delle parti genetiche che formano il circuito sintetico per esprimere il circuito sintetico è mostrata in (Figura 1A). Le parti corrispondenti sono state clonate nel vettore pEGFP-N1 in modo ortogonale e modulare, come rappresentato nella Figura 1B. La simulazione del circuito sintetico ha rivelato dinamiche oscillatorie sia nell'SDHA che nel repressore della tetraciclina. Questa osservazione suggerisce un pattern di espressione reciproca caratterizzato da funzioni d'onda periodiche. L'aumento della concentrazione di SDHA può essere attribuito all'induzione della doxiciclina, mentre l'espressione di TetR può derivare dalla diminuzione dei livelli di doxiciclina (Figura 1C). Data l'espressione oscillatoria inducibile di SDHA e TetR osservata in silico, è stata progettata e implementata una strategia per la somministrazione di circuiti sintetici attraverso il vettore plasmidico pEGFP-N1.
Le parti iGEM identificate per lo studio includono BBa_K1493803 per TetO, BBa_K4344028 per la sequenza di Kozak, BBa_C0040 per TetR e BBa_K1537016 per P2A, rispettivamente. L'ID di accesso NCBI per SDHA è NM_025848. Questi componenti sono stati assemblati per costruire un circuito sintetico TetON inducibile dalla doxiciclina, che copre un totale di 1317 coppie di basi (Supplementary File 1). Poiché il TetO funziona come un elemento regolatore del DNA, la sua sequenza non è stata tradotta. La sequenza a valle della sequenza di Kozak, che si estende da 5' TetR all'estremità 3' di P2A, posizionata a valle di SDHA, è stata scelta per la validazione in silico della traduzione. L'osservazione ha rivelato l'assenza di codoni di stop interni, garantendo una traduzione ininterrotta su tutta la lunghezza della sequenza (File supplementare 2). Le parti regolatorie di un circuito sintetico comprendente 1317 bp sono state inserite tra i siti di restrizione NotI e XhoI, che si trovano 5' a monte dell'EGFP (Figura 1B). I risultati del sequenziamento evidenziano che la sequenza di inserimento è stata clonata nel plasmide (File supplementare 3).
L'introduzione di un circuito immuno-metabolico nel ceppo DH5α di E. coli ha portato alla crescita di colonie trasformate che mostrano resistenza alla kanamicina, l'antibiotico impiegato come marcatore selettivo durante la trasformazione batterica. L'abbondante presenza di colonie trasformate sulla piastra di selezione era più elevata, il che suggerisce che le cellule competenti mostravano un alto potenziale di trasformazione, indicativo dell'efficienza del protocollo di trasformazione utilizzato (Figura 1D).
Una singola colonia è stata isolata e seminata in 10 mL di LB integrata con kanamicina per l'isolamento del plasmide. La resa plasmidica derivata da una coltura di 10 mL è dettagliata nella Tabella 1. Per questa procedura è stato impiegato un metodo standard per l'isolamento dei plasmidi. Le soluzioni tampone sono state preparate il giorno prima dell'isolamento del plasmide e le condizioni di incubazione sono state ottimizzate per massimizzare la resa del plasmide. La concentrazione di plasmidi ottenuta ha superato 1 μg/μL, con rapporti 260/280 e 260/230 superiori rispettivamente a 1,8 e 2,0. Questi risultati indicano che i plasmidi isolati erano di elevata purezza e privi di contaminanti come proteine, EDTA, carboidrati e fenolo.
È stato valutato lo spostamento della mobilità elettroforetica per il circuito sintetico isolato. La digestione di restrizione è stata eseguita utilizzando gli enzimi di restrizione NotI e XhoI, poiché questi erano i siti di restrizione in cui è stato inserito il circuito sintetico. Due bande sono state osservate su gel di agarosio all'1%, una banda vicino a 1500 bp e una tra 4 kb e 5 kb. Dato che la dimensione dell'inserto è di 1317 bp, la banda a 1500 bp corrisponde probabilmente all'inserto. Il vettore pEGFP-N1 ha una dimensione di 4,7 kb. Quindi, si presume che la banda vicino a 5 kb sia il vettore pEGFP-N1. Di conseguenza, si è dedotto che all'interno del vettore di consegna era presente un circuito sintetico completo e intatto. Inoltre, è stata rilevata una banda di circa 6 kb per il circuito sintetico intatto non digerito, indicando che il vettore pEGFP-N1 ospita un inserto di quasi 1,3 kb all'interno del vettore plasmidico (Figura 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> Figura 1: Progettazione e validazione di circuiti sintetici. (A) Rappresentazione di circuiti sintetici mediante l'assemblaggio di parti genetiche e componenti regolatori. (B) Grafico di simulazione deterministica che mostra l'espressione periodica di SDHA e TetR a 100 unità di tempo. (C) Colonie trasformate a circuito sintetico di E. coli DH5α resistenti alla kanamicina. L'unità è un'unità di 100 volte in quanto è una simulazione deterministica. (D) Elettroforesi su gel di agarosio di circuiti sintetici intatti e digeriti mediante enzimi di restrizione NotI e XhoI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentrazione di plasmidi (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Resa del costrutto di circuito sintetico ottenuto dopo l'isolamento del plasmide. La tabella mostra la concentrazione di plasmidi in μg/mL, il loro rapporto 260/280 e 260/230.
Nelle cellule di controllo e in quelle infette, l'intensità di fluorescenza osservata era bassa per la GFP. Tuttavia, è stato osservato che la trasfezione del circuito sintetico con un rapporto 1:1 tra plasmide e PEI con 500 μg/mL G418 e l'induzione con 1 μg/μL dox inducono un'elevata espressione di GFP nelle cellule IMT. Nelle cellule IMTI di 6 ore, anche l'espressione di GFP era significativamente più alta, sebbene l'espressione di GFP fosse inferiore rispetto al campione IMT (Figura 2A, B). Inoltre, è stato osservato un aumento dell'espressione di GFP nei campioni IMTI a 12 ore, IMTI a 18 ore e IMTI a 24 ore. Questo aumento può essere dovuto a un aumento del tempo di infezione, che potrebbe aver indotto maggiori alternanze metaboliche nei macrofagi da parte del parassita residenziale17. I livelli intracellulari di SDHA potrebbero essere influenzati a causa di un aumento del tempo di infezione18. Poiché il dox è stato integrato in questi campioni IMTI, i livelli di SDHA attraverso i circuiti sintetici potrebbero essere aumentati, portando così ad un aumento dell'espressione di SDHA.
La colorazione DAPI è stata eseguita per identificare il numero di parassiti residenziali nei macrofagi. Nei macrofagi infetti principali di 6 ore L., il numero osservato di parassiti intracellulari era di 6 cellule per macrofago, che è più alto rispetto al campione IMTI di 6 ore, che aveva 1-2 parassiti intracellulari per macrofago. Dopo la trasfezione e l'induzione dox, è stata osservata una significativa riduzione del carico parassitario intracellulare in diversi momenti dell'infezione (Figura 2C). Le osservazioni hanno suggerito che i circuiti sintetici potrebbero aver indotto effetti di eliminazione dei parassiti stimolando l'espressione di SDHA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> Figura 2: Microscopia confocale a scansione laser. Immagini di campioni di controllo, infetti, IMT e IMTI. (A) Analisi dell'espressione della GFP in tutti i campioni sperimentali con una barra di scala di 50 μm per il controllo, 6 h infetti e IMT, 20 μm per 6 h IMTI, 10 μm per 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI rispettivamente. I canali utilizzati erano DIC, DAPI, GFP e immagini unite di tutti i canali. (B) ANOVA unidirezionale con test di correzione di Tukey di tutti i campioni sperimentali (n=3) per l'espressione GFP (p &lt; 0,05 è considerato significativo) Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. (C) ANOVA unidirezionale con test di correzione di Tukey è stata eseguita l'analisi della carica parassita in 100 cellule macrofagiche per campioni da (A) (n=3) (p &lt; 0,05 è considerato significativo). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il rilevamento dei livelli di IL-10 e IL-12 nei terreni di tutti i campioni ha rivelato che le concentrazioni di IL-10 e IL-12 erano più alte a 6 ore dopo l'infezione, con una sottoregolazione dei livelli di citochine dopo l'infezione di 24 ore. Non c'è stata alcuna differenza significativa nei livelli di IL-10 e IL-12 dopo la trasfezione e l'induzione di circuiti sintetici. Inoltre, c'era una differenza non significativa nei livelli di IL-10 e IL-12 nei campioni di punti temporali IMTI (Figura 3). Il campione infetto di 6 ore è già stato riportato per mostrare l'espressione di IL-10 e IL-1219,20, osservando una differenza non significativa in IL-10 e IL-12 ci ha fatto studiare l'effetto del circuito sintetico su altre citochine.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> Figura 3: ELISA di IL-10 e IL-12 per identificare i loro livelli secretori in terreni di diversi campioni. I campioni (n=2) includono controllo, 6 ore infette, 24 ore infette, IMT, 6 ore IMTI, 12 ore IMTI, 18 ore IMTI, 24 ore IMTI. È stata eseguita l'ANOVA a due vie con l'analisi del test di correzione di Tukey (p &lt;.05 è considerato significativo). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il rilevamento dei livelli di trascrizione di TNF-α, IFN-γ e TGF-β in campioni infetti a 6 ore, IMT e IMTI a 24 ore ha rivelato che è stato osservato un aumento significativo del TNF-α a 2,5 volte nel campione IMTI a 24 ore rispetto ai campioni di infezione e IMT (Figura 4). Nel campione IMTI delle 24 ore, è stato osservato un aumento di 35 volte dei livelli di IFN-γ rispetto ai campioni di infezione e IMT. I livelli di TGF-β, sebbene abbiano mostrato una significativa sovraregolazione fino a 1,5 volte nel campione IMTI delle 24 ore, la variazione relativa del ripiegamento era inferiore rispetto al TNF-α e all'IFN-γ, suggerendo che le citochine pro-infiammatorie sono significativamente sovraregolate nel campione IMTI delle 24 ore.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> Figura 4: analisi qRT-PCR delle citochine. (A) TNF-α, (B) IFN-γ e (C) TGF-β per campioni infetti da 6 ore, IMT e IMTI per 24 ore (n=2). È stata eseguita l'ANOVA unidirezionale con il test di correzione di Tukey (p &lt; 0,05 è considerato significativo). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Sequenza nucleotidica di parti genetiche assemblate per formare il circuito sintetico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Sequenza tradotta di circuiti sintetici che esprimono TetR, P2A e SDHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Risultato del sequenziamento del circuito sintetico clonato nel plasmide pEGFP-N1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui viene presentato un protocollo per la progettazione, la costruzione e la somministrazione di circuiti sintetici inducibili basati su tetraciclina. L'effetto dei circuiti sintetici sull'eliminazione del parassita e sull'espressione delle citochine può essere studiato canalizzando la pipeline presentata. Questo protocollo è rilevante per i ricercatori che studiano le terapie basate su circuiti sintetici nelle malattie infettive.

Circuiti immunometabolici nell'infezione per l'avanzamento delle terapie dirette all'ospite

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

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I monociti sono componenti integranti del sistema immunitario innato umano che si basano sul metabolismo glicolitico quando attivati. Descriviamo un protocollo di citometria a flusso per misurare l'espressione del trasportatore del glucosio e l'assorbimento del glucosio da parte di monociti totali e sottopopolazioni di monociti nel sangue intero fresco.

Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello murino xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale. Questo protocollo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli simili per la valutazione della terapia I-O.

Un ormone e mezzo umano (PBMC) Un modello di Xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale (I-O)

Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

I test immunologici basati su sangue intero forniscono uno strumento semplice ed efficiente in termini di risorse per analizzare l'immunità antigene-specifica a fini diagnostici e di ricerca. Questo articolo fornisce un protocollo ottimizzato basato su sangue intero con doppia co-stimolazione per un'analisi completa dell'immunità dell'ospite ai patogeni fungini e virali, inclusa una versione a basso volume per pazienti pediatrici e piccoli animali.

Saggio su sangue intero con doppia co-stimolazione per l'analisi antigene-specifica dell'immunità dell'ospite a patogeni fungini e virali

Questo rapporto descrive un protocollo automatizzato per saggi di immunofluorescenza multiplex (mIF) su un coloratore automatico per vetrini. Dimostra l'elevata riproducibilità della proteomica spaziale su autocoloratori tissutali standard ad alto rendimento e imager a fluorescenza su vetrini interi, ideale per saggi mIF personalizzati su un gran numero di vetrini tissutali nella ricerca traslazionale.

Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

Il presente protocollo descrive un flusso di lavoro sperimentale che consente l'analisi ex vivo della stimolazione di cellule T umane in un sistema di co-coltura allogenica con cellule tumorali pretrattate.

Analisi dell'attività delle cellule T umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate

Questo articolo descrive un metodo versatile per creare cellule derivate da anelli di tessuto cellulare self-assembly. Cellule muscolari lisce seminate in forma di anello aggregato agarosio pozzi e contratto a formare solide tridimensionali (3D) nei tessuti entro 7 giorni. Millimetrica scala anelli di tessuto sono favorevoli ai test meccanici e servono come mattoni per l'assemblaggio dei tessuti.

Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi utilizzati per stabilire gli ambienti 2D e 3D in custom-designed camere electrotactic, che permette di monitorare le...

Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D

Scopri i circuiti sintetici controllati dalla tetraciclina per eliminare Leishmania major e modulare le citochine. Questo protocollo offre una strategia innovativa per terapie immunometaboliche mirate.

Circuiti immunometabolici nell'infezione per l'avanzamento delle terapie dirette all'ospite

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