Assemblaggio di organoidi retinici con microglia
July 26th, 2024
Le microglia sono cellule immunitarie uniche residenti nella retina, che svolgono un ruolo cruciale in varie malattie degenerative della retina. La generazione di un modello di co-coltura di organoidi retinici con microglia può facilitare una migliore comprensione della patogenesi e del progresso dello sviluppo delle malattie retiniche.
Per iniziare, ottenere le cellule staminali embrionali umane nel terreno delle cellule staminali con una densità cellulare compresa tra l'80 e il 90%Dopo aver rimosso il terreno esaurito, sciacquare le cellule in ciascun pozzetto con un millilitro di 1X DPBS. Incubare le colonie di cellule staminali in ciascun pozzetto con un millilitro di EDTA 0,5 millimolare per circa cinque minuti a 37 gradi Celsius. Controlla la morfologia della colonia per confermare che i bordi siano leggermente arricciati con spazi vuoti allentati.
Aspirare l'EDTA e, se necessario, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altri uno o due minuti, ma non più di otto minuti. Sciacquare delicatamente le cellule in ciascun pozzetto con sei millilitri di terreno A contenente sei microlitri di soluzione di inibitore ROCK da 10 millimolari di Y-27632. Picchiettare delicatamente il fondo del piatto per aiutare a sciacquare le cellule.
Dopo 24 ore, osservare le cellule al microscopio per confermare la formazione del corpo embrionale. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogli i corpi degli embrioni in una provetta centrifuga da 15 millilitri e attendi che i corpi degli embrioni si depositino sul fondo per cinque minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante e risospendere i corpi embrionali in sei millilitri di terreno fresco A.Trasferirli in un nuovo pozzetto a bassa adesione di una piastra a sei pozzetti e coltura in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.
Il quarto giorno, rivestire un piatto di 10 centimetri con tre millilitri di soluzione di gelatina di pesce allo 0,1% e incubare per almeno un'ora in un'incubatrice al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Quindi rimuovere la soluzione di gelatina e sciacquare il piatto una volta con cinque o sei millilitri di 1X DPBS. Raccogli con cura i corpi degli embrioni in una provetta centrifuga da 15 millilitri e attendi che i corpi degli embrioni si depositino sul fondo in cinque minuti.
Risospendere delicatamente i corpi embrionali con 15 millilitri di terreno B e trasferirli nel piatto rivestito da 10 centimetri. Coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per una settimana dopo 49 giorni. Centrifugare le celle a 200 x g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare con cura il surnatante e risospendere le cellule con due millilitri di terreno fresco C.Trasferire in un nuovo pozzetto a bassa adesione di una piastra a sei pozzetti. Incubare la piastra in un incubatore al 5% di anidride carbonica, 37 gradi Celsius. Il giorno 56, sostituire il terreno esaurito con due millilitri di terreno C per pozzetto.
Esaminare la piastra al microscopio per identificare le microglia ramificate che aderiscono al fondo del pozzetto a bassa adesione. Per raccogliere le microglia per la co-coltura, sostituire delicatamente il terreno C in ciascun pozzetto con un millilitro di Accutase e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, raccogliere le cellule della microglia in una provetta da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 200 x g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, sospendere la microglia con un millilitro di terreno E.
Panoramica
Questo studio indaga il ruolo della microglia nelle malattie degenerative della retina generando un modello di co-coltura di organuli retinici e microglia. Questo modello mira a migliorare la comprensione della patogenesi e dello sviluppo delle malattie retiniche.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia retinica
- Immunologia
Contesto
- La microglia sono cellule immunitarie residenti nella retina.
- Giocano ruoli cruciali nella patologia delle malattie degenerative della retina.
- Comprendere le funzioni microgliali può aiutare a sviluppare terapie.
- I modelli di co-coltura consentono un'analisi più completa delle interazioni cellulari.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un modello di co-coltura affidabile di organuli retinici e microglia.
- Indagare i meccanismi patogeni alla base delle malattie retiniche.
- Migliorare la comprensione del comportamento microgliale nell'ambiente retinico.
Metodi utilizzati
- Lo studio ha utilizzato un modello di co-coltura che coinvolge organuli retinici e microglia umana derivata da cellule staminali embrionali.
- Le cellule staminali embrionali umane sono state coltivate fino a raggiungere una densità specifica, seguita dall'isolamento della microglia.
- Il modello ha osservato le fasi di sviluppo per un periodo di 30 giorni.
- Le condizioni di coltura includevano incubazioni a 37 gradi Celsius con gas controllati.
- Sono state utilizzate tecniche di immunofluorescenza per confermare la presenza di microglia e marcatori retinici.
Risultati principali
- Gli organuli retinici co-coltivati hanno mostrato una significativa autofluorescenza GFP indicante microglia attiva.
- L'immunofluorescenza ha confermato l'espressione di marcatori dei fotorecettori retinici (CRX) e dei marcatori microgliali (IBA1).
- Lo studio evidenzia l'interazione tra microglia e cellule retiniche durante la modellazione della malattia.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un modello di co-coltura funzionale che riflette la complessità delle malattie retiniche.
- Consente di ottenere informazioni sui ruoli microgliali nella patologia retinica, potenzialmente guidando le strategie terapeutiche.
- Le implicazioni del modello si estendono a una migliore comprensione dei meccanismi delle interazioni neuroimmunitarie nelle malattie oculari.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Integrating microglia into human retinal organoids addresses a critical gap in disease-relevant modeling for retinal and CNS drug discovery. This co-culture system enhances predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for neuroimmune interactions. The platform supports translational continuity from discovery through preclinical research, enabling more informed portfolio decisions in ophthalmic and neurodegenerative pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglia-mediated mechanisms in retinal disease models.
- Supports functional target validation by recapitulating immune cell interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroimmune targets in ophthalmology.
- Improves predictive confidence for early-stage asset triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated co-culture system for compound screening in a human-relevant context.
- Enables quantitative assessment of microglial and photoreceptor marker expression.
- Supports reproducible assay development for immune-modulating therapeutics.
- Prepares a scalable platform for screening neuroinflammatory modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for translational biomarker exploration.
- Bridges discovery and preclinical validation for retinal and CNS indications.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on human cell-derived data.
- Supports mechanistic studies of neuroimmune interactions in disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture model fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational research for retinal and CNS drug programs.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of microglia-retina interactions and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible organoid systems with quantifiable immune and neuronal markers.
- Analytics: Provides immunofluorescence and autofluorescence readouts for comparative analysis of disease and intervention effects.
- Translational Research: Supports alignment with human disease mechanisms and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neuroimmune and ophthalmic research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes co-culture protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by modeling human disease complexity early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets targeting retinal and CNS diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation and co-culture techniques.
- Needs access to advanced imaging and immunofluorescence analytics.
- Demands cross-team standardization for reproducible outputs.
- May require adaptation for different disease models or cell sources.
- Potential variability in cellular responses should be considered in experimental design.
