Combinazione di imaging ed elettrofisiologia per visualizzare e registrare le depolarizzazioni di diffusione nei topi
4 ottobre 2024
Questo protocollo dimostra la combinazione di imaging ed elettrofisiologia per rilevare in modo affidabile la diffusione delle depolarizzazioni nei topi adulti a seguito di una lieve lesione cerebrale traumatica.
Lo scopo della nostra ricerca è comprendere la relazione tra la diffusione di depolarizzazioni e lesioni cerebrali traumatiche lievi utilizzando modelli cerebrali. Il nostro gruppo e altri hanno recentemente dimostrato che la diffusione delle depolarizzazioni si verifica in lievi lesioni del cranio chiuso nei topi. Gli amplificatori di elettrofisiologia in vivo comunemente usati filtrano i lenti spostamenti extracellulari associati alla diffusione delle depolarizzazioni, rendendo quasi impossibile rilevare la diffusione della depolarizzazione.
Il vantaggio di questo protocollo è quello di sfruttare sia l'imaging che l'elettrofisiologia in vivo per confermare l'assenza o la presenza di depolarizzazioni diffuse a seguito di una lieve lesione cerebrale traumatica. Abbiamo iniziato a comprendere il ruolo della diffusione delle depolarizzazioni nel comportamento acuto, nella patologia e nei deficit cognitivi a lungo termine associati agli MTBI. Per iniziare, posizionare l'animale anestetizzato in un telaio stereotassico e mantenere la temperatura corporea dell'animale utilizzando un termoforo.
Utilizzando una lama di bisturi numero 10, praticare un'incisione lungo la linea mediana da rostrale a caudale. E applicare immediatamente la colla cianoacrilica sull'incisione. Quindi, allargare la pelle lateralmente per esporre il cranio.
Aggiungi una o due gocce di colla cianoacrilica sul cranio per fornire una protezione extra. Mentre la colla si asciuga, utilizzare forbici chirurgiche sterili per aumentare le dimensioni dell'incisione sul cervelletto. Successivamente, utilizzando una punta da trapano da 0,8 millimetri, praticare dei fori pilota attraverso il cranio e girare le viti nel cranio.
Avvolgere il filo in eccesso attorno alla vite, lasciando un po' di gioco per il posizionamento del palco di testa in un secondo momento. Una volta che tutte le viti del teschio sono in posizione, collegare tutti i pin dorati al connettore dello stadio della testa desiderato. Tenendo il connettore in posizione con il braccio stereotassico, posizionare i pin del connettore vicino alle teste delle viti senza contatto con il filo.
Sigillare l'intera area con colla cianoacrilica, assicurandosi che l'area di imaging davanti alle viti del cranio sia indisturbata. Costruisci del cemento dentale attorno alla base dei perni d'oro, assicurandoti che i perni d'oro delle viti del cranio non siano collegati a quelli nella fase della testa. Lasciare indurire il cemento dentale prima di rimuovere il connettore dello stadio principale.
Per iniziare, accendi il computer IOS e la scheda del pannello LED. Montare l'animale anestetizzato impiantato con elettrodo in un letto d'impatto sotto la telecamera. E regolare l'anello di messa a fuoco per coprire la superficie corticale.
Dopo aver caricato il segnale ottico intrinseco, o le impostazioni IOS, premere il pulsante Live per visualizzare il mouse e centrare il cranio dell'animale sotto la telecamera. Quindi, premere Acquisizione Multi-D per accedere alle impostazioni di acquisizione e selezionare i punti temporali desiderati. Salva le immagini nel percorso del file designato con il prefisso del nome appropriato.
Collegare i pin dorati dall'animale al connettore del palcoscenico della testa e poi al tavolino della testa. Accendere il computer di elettrofisiologia e collegare il computer all'apparecchiatura di elettrofisiologia. Dopo aver caricato le impostazioni per il software Intan, fare clic sull'icona Scegli formato file e, nella finestra pop-up, selezionare Un file per tipo di segnale Formato.
Quindi, nella scheda BW in Larghezza di banda hardware, selezionare la larghezza di banda dell'amplificatore da 0,13 a 500 hertz. Selezionare Wide in Selettore visualizzazione filtro. Dopo aver impostato i filtri passa-basso e passa-alto, fare clic sull'icona Seleziona nome file per selezionare il percorso del file desiderato per il salvataggio.
Per l'impatto, accendere l'impattatore elettromagnetico e premere la leva per verificare se la punta si ritrae e si estende correttamente. Posiziona rapidamente l'animale su un letto di schiuma e fai scorrere il letto sotto la punta dell'impattatore. Allineare la punta dell'impattatore con la linea mediana e posizionarla a un millimetro di rostrale di bregma.
Quindi, abbassare la punta dell'impattatore fino a toccare saldamente la parte superiore della testa dell'animale. Spingere la leva per ritrarre la punta dell'impattatore, quindi abbassarla manualmente di cinque millimetri prima di attivare la leva di impatto. Rimuovere immediatamente l'animale dal letto di schiuma e posizionarlo sotto la fotocamera per l'imaging entro cinque secondi.
Fare clic su Acquisisci per avviare l'imaging IOS nella finestra Acquisizione multidimensionale. Cattura immagini per quattro minuti per registrare l'intero evento di depolarizzazione che si diffonde. Per avviare la registrazione elettrofisiologica, fare clic sull'icona Registra nel software Intan.
Al termine della registrazione, scollegare l'animale dal tavolino e dal connettore e rimetterlo nella sua gabbia. Per aprire la pila di immagini, fai clic su File, seguito da Importa e Sequenza immagini. Disegna un quadrato usando il cursore, definendo la regione di interesse, per generare il grafico della depolarizzazione di diffusione.
Passare a Immagine, quindi a Pile e Traccia profilo asse Z per tracciare il grafico e fare clic sul pulsante Live. Nel grafico generato, fare clic su Elenco per generare un elenco di valori. Per la visualizzazione, convertire l'immagine in scala di grigi con una tabella di ricerca incendiaria.
Sono state osservate depolarizzazioni diffuse che si propagano attraverso la corteccia e i grandi vasi sanguigni attraverso la finestra. L'attività ad alta frequenza nelle registrazioni elettrofisiologiche ha mostrato un rapido ritorno negli animali fittizi dopo la rimozione dell'isoflurano. Ma negli animali depolarizzati, l'attività ad alta frequenza è rimasta soppressa per diversi minuti prima del recupero.
I grafici di potenza hanno dimostrato un chiaro aumento di potenza dopo il recupero dalla soppressione in entrambe le condizioni.
Panoramica
Questo studio analizza il collegamento tra depolarizzazioni progressive e traumi cerebrali lievi utilizzando topi adulti come modello. Integrando tecniche di imaging con elettrofisiologia in vivo, il protocollo mira a rilevare in modo affidabile le depolarizzazioni progressive, chiarificandone il significato nei comportamenti acuti e nei deficit cognitivi a lungo termine associati ai traumi cerebrali lievi.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Le depolarizzazioni progressive possono verificarsi in lesioni craniche chiuse di lieve entità nei topi.
- Metodi comuni di elettrofisiologia in vivo potrebbero non riuscire a rilevare gli spostamenti lenti extracellulari associati a queste depolarizzazioni.
- Questo studio mira a combinare imaging ed elettrofisiologia per un rilevamento migliorato delle depolarizzazioni progressive.
- La ricerca contribuisce alla comprensione del comportamento acuto, della patologia e degli esiti cognitivi dopo una lesione cerebrale traumatica di lieve entità.
Scopo dello studio
- Dimostrare un protocollo in grado di rilevare in modo affidabile le depolarizzazioni progressive in un modello murino di trauma cranico lieve.
- Indagare gli effetti potenziali delle depolarizzazioni progressive sul comportamento e sui deficit cognitivi.
- Migliorare i metodi di rilevamento attualmente limitati dalle comuni pratiche elettrofisiologiche.
Metodi Utilizzati
- Lo studio impiega un protocollo che combina imaging ed elettrofisiologia in topi adulti.
- I topi subiscono un trauma cerebrale lieve, dopo il quale vengono effettuati sia imaging che registrazioni elettrofisiologiche per identificare le depolarizzazioni progressive.
- I passaggi principali includono l'anestesia animale, la preparazione chirurgica e l'integrazione meticolosa delle apparecchiature per imaging ed elettrofisiologia.
- I dati elettrofisiologici vengono registrati dopo il trauma e correlati ai risultati dell'imaging per analizzare gli eventi di depolarizzazione.
Risultati principali
- Le depolarizzazioni progressive sono state osservate propagarsi attraverso la corteccia in risposta a un lieve trauma cranico.
- Le registrazioni di elettrofisiologia hanno indicato un'attività ad alta frequenza soppressa negli animali depolarizzati, evidenziando ritardi significativi nel recupero.
- I grafici della potenza hanno mostrato differenze distinte nei modelli di recupero tra animali controllo e animali feriti.
- L'approccio combinato ha permesso una rilevazione e un'analisi più efficaci delle depolarizzazioni progressive.
Conclusioni
- Questo studio dimostra con successo un nuovo protocollo per il rilevamento delle depolarizzazioni progressive dopo un trauma.
- I risultati migliorano la comprensione dei meccanismi neuronali associati a deficit cognitivi e cambiamenti comportamentali dopo lesioni cerebrali traumatiche lievi.
- L'utilizzo combinato di tecniche di imaging ed elettrofisiologia fornisce informazioni fondamentali sulle implicazioni delle depolarizzazioni progressive nel contesto delle lesioni cerebrali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento affidabile delle depolarizzazioni progressive (SDs) è fondamentale per comprendere le conseguenze neurologiche acute e a lungo termine successive a un danno cerebrale. L'integrazione dell'imaging con l'elettrofisiologia in vivo aumenta la sicurezza predittiva nell'identificazione delle SDs, sostenendo la riduzione dei rischi meccanicistici e la validazione degli obiettivi nella ricerca sul neurotrauma. Questo approccio bimodale rafforza la scoperta precoce e la continuità traslazionale per il progresso del portafoglio CNS.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette un'analisi solida delle SD come fattori meccanicistici che contribuiscono alla patologia post-traumatica.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi confermando la presenza o l'assenza di SD in modelli rilevanti per la malattia.
- Migliora la fiducia predittiva nei test ipotetici terapeutici successivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Facilita la preparazione di modelli in vivo validati per lo screening di composti mirati alla modulazione della depolarizzazione diffusa (SD).
- Fornisce output quantitativi di imaging e di elettrofisiologia per la standardizzazione dei saggi.
- Consente un rilevamento riproducibile delle depolarizzazioni diffuse (SD), supportando una valutazione affidabile di interventi sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici a meccanismi di lesione rilevanti per l'uomo mediante la visualizzazione della propagazione delle depolarizzazioni di diffusione (SD).
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica collegando le depolarizzazioni di diffusione (SD) a esiti funzionali.
- Riduce i rischi nella progressione traslazionale confermando endpoint meccanicistici in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo combinato di imaging ed elettrofisiologia colloca il rilevamento delle onde di diffusione (SD) all'intersezione tra la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la ricerca preclinica nei modelli di lesione del sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Conferma ipotesi meccanicistiche riguardo al coinvolgimento delle onde di depolarizzazione (SD) nei traumi cerebrali acuti e cronici.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per valutare composti modulatori delle onde di depolarizzazione.
- Analisi: Offre dati sincronizzati di imaging ed elettrofisiologici per un confronto statistico solido tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte di base a endpoint preclinici rilevanti per lo sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo ampiamente adottabile, adattabile a diversi modelli di neurotrauma e neurovascolari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle lesioni del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Standardizza il rilevamento delle depolarizzazioni diffuse con flussi di lavoro scalabili e riproducibili, adatti a studi multicentrici.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione indicando il coinvolgimento delle depolarizzazioni diffuse nella patologia bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione degli asset del sistema nervoso centrale in base a endpoint meccanicistici validati, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze sia nelle tecniche di imaging in vivo che in quelle di elettrofisiologia.
- Richiede l'accesso a infrastrutture sincronizzate per l'imaging e la registrazione elettrofisiologica.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nei protocolli di acquisizione e analisi dei dati.
- Adattabile a diversi modelli di roditori, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo per diversi tipi di lesione.
- Dipende dalla disponibilità di amplificatori e sistemi di imaging compatibili per una rilevazione affidabile delle onde di depolarizzazione (SD).
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Preparing the Skull for Imaging and Electrophysiology to Monitor Spreading Depolarizations in Injured Mouse Brain
2:52
Detecting the Spreading Depolarizations in Mouse Brain Injury Model with Intrinsic Optical Signal Imaging and AC-Electrophysiology
