Name: Analisi quantitativa dei metaboliti alimentari della vitamina A nei tessuti oculari e non oculari murini mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Scopri l'analisi quantitativa dei metaboliti della vitamina A nei tessuti oculari e sistemici murini mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. Questo metodo HPLC permette di studiare i trasportatori STRA6 e RBPR2.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisi dei metaboliti della vitamina A nel tessuto murino per studi sulla funzione della rodopsina

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-ottanolo, adatto per HPLC, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>203-917-6</td><td></td></tr><tr><td>1,4-diossano, adatto per HPLC, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>204-661-8</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-retinal</td><td>National Eye Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-retinolo</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252105</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-retinal</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R239900</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-retinolo</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252110</td><td></td></tr><tr><td>Prodotti chimici di ricerca di Toronto all-trans-retinal</td><td></td><td>TRC-R240000</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-Retinol</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252002</td><td></td></tr><tr><td>acetato di etile, adatto per HPLC, &ge; 99,7%</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>205-500-4</td><td></td></tr><tr><td>Hesane, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific, Spectrum Chemical</td><td>18-610-808</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (HPLC)</td><td>Fisher Scienctific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Retinil Palmitato</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R275450</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Collettore di frazioni analitiche Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G1364F</td><td></td></tr><tr><td>Pompa binaria 1260 Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7112B</td><td></td></tr><tr><td>1260 Rivelatore array di diodi Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7115A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Termostato multicolonna Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7116A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Fialsampler</td><td>Agilent</td><td>G7129A</td><td></td></tr><tr><td>ST40R Centrifuga refrigerata</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSST40R</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus Concentratore di centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>22820168</td><td></td></tr><tr><td>Consumabili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL Ambra Fiale con tappo a vite</td><td>Agilent</td><td>5188-6535</td><td></td></tr><tr><td>Tappo a crimpare con setti in PTFE/gomma rossa, 11 mm</td><td>Agilent</td><td>5183-4498</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche monouso in vetro</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS9950215</td><td></td></tr><tr><td>Tubo con tappo a vite, 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Inserto per fiale, 150 &; L, vetro con piedini in polimero</td><td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi quantitativa dei metaboliti alimentari della vitamina a nei tessuti oculari e non oculari murini mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

Quantitative Analysis of Dietary Vitamin A Metabolites in Murine Ocular and Non-Ocular Tissues Using High-Performance Liquid Chromatography

Qui, abbiamo utilizzato il metodo sopra descritto per rilevare e quantificare i retinoidi nel tessuto oculare e sistemico murino e abbiamo generato cromatogrammi rappresentativi. Daremo inoltre un riassunto dei tipici retinoidi che possono essere rilevati in questi tessuti.
A 6 mesi di età, i topi sono stati soppressi attraverso l'asfissia da CO2 . Per mantenere il contenuto di retinoidi oculari, i topi sono stati adattati al buio per 2 giorni prima dell'eutanasia e dell'estrazione. Due occhi, 0,2 g di fegato e 75 μL di sangue sono stati prelevati per l'estrazione dei retinoidi e la successiva analisi HPLC. Per il tessuto oculare, un occhio è stato estratto senza l'aggiunta di idrossilammina, mentre l'altro è stato sottoposto a trattamento con idrossilammina. Per il fegato e il sangue, il trattamento con idrossilammina non è stato necessario poiché le retinaldeidi non sono tipicamente rilevate in questi tessuti.
Nel cromatogramma dell'occhio di topo non trattato con idrossilammina è stato identificato il 13-cis-retinal, uno dei due isomeri non canonici della retinaldeide. Inoltre, sono stati identificati sia l'11-cis-retinico che l'all-trans-retinal, i due isomeri canonici della retinaldeide. In entrambi i cromatogrammi sono stati identificati l'intermedio del ciclo visivo 11-cis-retinolo, nonché la principale forma di trasporto della vitamina A all-trans-retinolo (Figura 4A).
Nel cromatogramma dell'occhio di topo trattato con idrossilammina, tutti gli isomeri della retinaldeide precedentemente menzionati erano ancora presenti. Tuttavia, i tempi di ritenzione di questi isomeri sono stati significativamente aumentati. Inoltre, questi isomeri della retinaldeide sono ora presenti sia come isomeri syn che anti. Durante la quantificazione attraverso l'integrazione dei picchi, sia i picchi syn che quelli anti devono essere sommati per ottenere un valore di integrazione accurato. Sia l'11-cis-retinolo che l'all-trans-retinolo erano ancora presenti (Figura 4B).
Nel cromatogramma del tessuto epatico di topo, all'interno di questi tessuti sono stati identificati il palmitato di retinile e il retinolo all-trans. Il palmitato di retinile, un estere di retinile, funge da principale forma di stoccaggio della vitamina A nei mammiferi e può essere trovato in quantità significative all'interno del tessuto epatico dei mammiferi. Il fegato rilascia vitamina A nei tessuti sistemici come olo-RBP4, contenente all-trans-retinolo all'interno del complesso RBP4-transtretinetina. Successivamente, all'interno di questo cromatogramma è possibile identificare un grande picco all-trans-retinolo (Figura 4C).
Nel cromatogramma del sangue dei topi, è stato identificato un grande picco all-trans-retinolo. Dato che l'olo-RBP4 dal fegato viene rilasciato ai tessuti sistemici attraverso il sistema circolatorio, questo è come previsto (Figura 4D). L'assorbanza caratteristica dello spettro UV (~250-400 nm) delle isoforme dei retinoidi sui picchi HPLC risolti dipendenti dal tempo può essere utile per la conferma incrociata iniziale della qualità della presenza dell'isoforma in un particolare picco (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig01.jpg"> Figura 1: Strutture chimiche dei retinoidi. (A) Questi retinoidi si trovano tipicamente nel tessuto murino estratto. Si notino i diversi gruppi terminali polari, così come le diverse posizioni dei doppi legami cis negli isomeri dei retinoidi. (B) La conversione delle retinaldeidi in ossime retiniche aumenta l'efficienza dell'estrazione, previene la co-eluizione dei picchi con il palmitato di retinile, così come la co-eluizione all'interno degli isomeri della retinaldeide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro per la raccolta, l'omogeneizzazione, l'estrazione e l'analisi dei retinoidi. Le retine e i campioni di tessuto di topi adattati al buio sono stati omogeneizzati ed estratti. Passo 1: Dopo l'eutanasia dei topi secondo le linee guida, vengono raccolti sangue e vari tessuti. Fasi 2-4: L'omogeneizzazione dei tessuti viene quindi eseguita con soluzione fisiologica e metanolo, con idrossilammina cloridrato per analisi quantitative. Fasi 5-7: I retinoidi vengono trattati con esano, seguiti dall'evaporazione. Passi 8,9: Risospeso con 100 μL di esano per assicurarsi che tutti i retinoidi siano disciolti. Passo 10: Infine, i campioni vengono analizzati mediante HPLC. Abbreviazione: HPLC = Cromatografia liquida ad alte prestazioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig03.jpg"> Figura 3: Cromatogramma degli standard dei retinoidi e degli standard dei retinoidi trattati con idrossilammina. (A) Questo cromatogramma contiene gli standard di retinile palmitato, 13-cis-retinale, 11-cis-retinale, all-trans-retinal, 11-cis-retinolo, 13-cis-retinolo e all-trans-retinolo. (B) Questo cromatogramma contiene gli standard di retinile palmitato, 13-cis-retinale, 11-cis-retinale, all-trans-retinal, 11-cis-retinolo, 13-cis-retinolo e all-trans-retinolo. Questo cromatogramma contiene gli isomeri della retinaldeide syn e anti ossima, oltre agli isomeri del retinolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig04.jpg"> Figura 4: Cromatogrammi rappresentativi. (A) Cromatogramma rappresentativo del tessuto oculare di topo. Questo cromatogramma contiene retinoidi che si trovano tipicamente nel tessuto oculare murino, compresi gli isomeri della retinaldeide, oltre agli isomeri del retinolo. (B) Cromatogramma rappresentativo del tessuto oculare di topo trattato con idrossilammina. Si noti che al posto delle retinaldeidi non chimicamente modificate presenti nei precedenti cromatogrammi (Figura 4A), questo cromatogramma contiene gli isomeri syn e anti ossima retinaldeide, oltre agli isomeri del retinolo. (C) Cromatogramma rappresentativo del tessuto epatico di topo. Questo cromatogramma contiene retinoidi che si trovano tipicamente nel tessuto epatico murino, tra cui il palmitato di retinile e il retinolo. (D) Cromatogramma rappresentativo del sangue di topo. Questo cromatogramma contiene retinoidi che si trovano tipicamente nel sangue murino, incluso l'all-trans-retinolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig05.jpg"> Figura 5: Spettro di assorbanza UV degli isomeri della retinaldeide dal tessuto oculare murino. Spettri di assorbanza di (A) 13-cis-retinale, (B) 11-cis-retinico, (C) 9-cis-retinale, (D) all-trans-retinal, (E) syn 11-cis-retinal oxime, (F) anti 11-cis-retinal oxime. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig06.jpg"> Figura 6: Panoramica dei moduli HPLC, del flusso di fase mobile e di altra strumentazione. Il flusso in fase mobile inizia dai flaconi di solvente preparati e viene pompato ad alta pressione dalla pompa binaria nell'autocampionatore, dove l'analita viene incorporato nel flusso di solvente. La fase mobile e l'analita raggiungono il vano della colonna a temperatura regolata e, infine, nel rivelatore a serie di diodi per la misura. (A) Schermo del monitor colorato di rosso che riduce al minimo la fotoisomerizzazione dei retinoidi. (B) Pompa binaria. (C) Campionatore di fiale. (D) Termostato multicolonna. (E) Rivelatore a serie di diodi. (F) Collettore di frazioni analitiche. (G) Contenitore per rifiuti in polietilene ad alta densità. (H) Da sinistra a destra, tappo a crimpare in alluminio, inserto da 250 μL con piedini in polimero, flacone superiore a crimpare color ambra, assemblaggio finale del flacone per iniezione. (I) A sinistra, centrifuga refrigerata. A destra, concentratore a centrifuga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Assorbimento molare (ε)</td>
			<td>Solvente</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr><tr><td>Palmitato di retinile</td>
			<td>49260</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>13-cis-retinale</td>
			<td>35500</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>11-cis-retinico</td>
			<td>24935</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>9-cis-retinale</td>
			<td>36100</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Robeson et al.51</td>
		</tr><tr><td>All-trans-Retinal</td>
			<td>42880</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>11-cis-retinolo</td>
			<td>34890</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr><tr><td>13-cis-retinolo</td>
			<td>48305</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Robeson et al.50 e Robeson et al.51</td>
		</tr><tr><td>All-trans-Retinolo</td>
			<td>52770</td>
			<td>Etanolo</td>
			<td>Hubbard et al.49</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Assorbimento molare dei retinoidi nell'etanolo. I valori di assorbività molare dei retinoidi sono stati raccolti da Kane e Napoli44, Hubbard et al.46, Robeson et al.47 e Robeson et al.48. L'assorbività molare dipende dal solvente. I valori qui elencati sono specifici per i retinoidi disciolti in etanolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fazzoletto</td>
			<td>Quantità di raccolta dei tessuti</td>
			<td>Volume per l'omogeneizzazione</td>
		</tr><tr><td>Sangue</td>
			<td>75 μl</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Fegato</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>Rene</td>
			<td>2 reni interi</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>Pelle</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>1 ml – 1,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Milza</td>
			<td>1 milza intera</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>Occhio</td>
			<td>Entrambi Retina, pool 4 Retina</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>Cervello</td>
			<td>1 Cervello intero</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>Cuore</td>
			<td>1 Cuore intero</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>Polmone</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Quantità di tessuto raccomandata per analisi. Quantità di tessuto per analisi e volume di soluzione salina ghiacciata al 50% (0,9%) e metanolo al 50% per l'omogeneizzazione dei tessuti, come raccomandato da Kane e Napoli44.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Tempo di ritenzione (min)</td>
			<td>Assorbanza UV Maxima (nm)</td>
		</tr><tr><td>Palmitato di retinile</td>
			<td>5.177</td>
			<td>326</td>
		</tr><tr><td>13-cis-retinale</td>
			<td>7.268</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>11-cis-retinico</td>
			<td>7.691</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>9-cis-retinale</td>
			<td>7.931</td>
			<td>364</td>
		</tr><tr><td>All-trans-Retinal</td>
			<td>8.993</td>
			<td>370</td>
		</tr><tr><td>11-cis-retinolo</td>
			<td>17.003</td>
			<td>318</td>
		</tr><tr><td>13-cis-retinolo</td>
			<td>17.83</td>
			<td>328</td>
		</tr><tr><td>All-trans-Retinolo</td>
			<td>23.933</td>
			<td>326</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Tempi di ritenzione e lunghezze d'onda massime di assorbanza dei retinoidi. Questi valori sono stati osservati quando utilizzati con il metodo descritto e la fase mobile, come rilevato con il rivelatore a schiera di diodi di riferimento.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Tempo di ritenzione (min)</td>
			<td>Assorbanza UV Maxima (nm)</td>
		</tr><tr><td>Syn 11-cis-Ossima retinica</td>
			<td>9.59</td>
			<td>346</td>
		</tr><tr><td>Syn Ossima all-trans-retinica</td>
			<td>10.6</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Syn 13-cis-ossima retinica</td>
			<td>11.3</td>
			<td>352</td>
		</tr><tr><td>Anti 13-cis-Ossima retinica</td>
			<td>13</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Anti 11-cis-Ossima retinica</td>
			<td>15.1</td>
			<td>350</td>
		</tr><tr><td>Anti Ossima all-trans-retinica</td>
			<td>19.7</td>
			<td>360</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Tempi di ritenzione e lunghezze d'onda massime di assorbanza delle retinaldeidi trattate con idrossilammina, con conseguente isomeri syn e anti ossima di ciascuna retinaldeide. Questi valori sono stati osservati quando utilizzati con il metodo descritto e la fase mobile, come rilevato con il rivelatore a schiera di diodi di riferimento.

Analisi quantitativa dei metaboliti alimentari della vitamina A nei tessuti oculari e non oculari murini mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

G protein-coupled receptors (GPCRs) are a superfamily of transmembrane proteins that initiate signaling cascades through activation of its G protein upon ...

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