Name: Monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri il monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate. Questo metodo avanzato consente di studiare la funzione mitocondriale in vitro.

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Ringraziamo i dottori Daniel Hass e Jim Hurley per l'idea di testare la solubilità dell'O2 in mezzi nuovi rispetto a quelli condizionati come controllo. Ringraziamo la Dott.ssa Magali Saint-Geniez per il contributo editoriale al manoscritto. Ringraziamo Scott Szalay dell'Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, per aver adattato la camera di ipossia con il cavo USB Resipher. Nessun fondo federale è stato utilizzato per la ricerca sull'HFT. L'Electronic Services Core è supportato da P30 EY007003 del National Eye Institute. Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione dipartimentale illimitata di Research to Prevent Blindness (RPB). J.M.L.M. è sostenuto dalla James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, dalla E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, da una sovvenzione Eversight eye-bank, da una sovvenzione K08EY033420 dal National Eye Institute e dal sostegno di Dee e Dickson Brown, nonché della David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. è supportato dal Programma Scientia dell'UNSW. L.A.K. è sostenuto dall'Iraty Award, da Monte J. Wallace, da Michel Plantevin, da una sovvenzione R01EY027739 del National Eye Institute e dal Department of Defense Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Nuovo sistema di monitoraggio OCR per colture differenziate di RPE

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

Richard A. Bryan e Kin Lo sono dipendenti della Lucid Scientific, che produce il sistema Resipher.

Il metabolismo mitocondriale dell'RPE svolge un ruolo critico nella patogenesi delle comuni malattie retiniche cieche, tra cui AMD e PVR. La modellazione del metabolismo mitocondriale dell'RPE in vitro consente di isolare il suo stato metabolico da quelli dei tessuti circostanti, oltre a sottoporre il tessuto a diversi insulti che simulano la malattia in modo controllato. Tale modellazione in vitro del metabolismo mitocondriale dell'RPE è stata facilitata dall'avvento di colture primarie umane ad alta fedeltà e iPSC-RPE che raggiungono lo stato di differenziazione e la polarità appropriati necessari per avvicinarsi strettamente all'RPE in vivo. Sebbene il monitoraggio del tasso di consumo di ossigeno (OCR) in tali colture sia un metodo ideale per monitorare il metabolismo mitocondriale, la configurazione per il monitoraggio OCR spesso preclude la coltivazione di colture nelle condizioni necessarie per un'RPE altamente polarizzata e completamente differenziata. Qui, descriviamo Resipher come un nuovo sistema per il monitoraggio del metabolismo mitocondriale dell'RPE attraverso la valutazione in tempo reale e a lungo termine dell'OCR in colture di RPE altamente differenziate e polarizzate.
Altri metodi sono stati utilizzati per monitorare l'OCR nell'RPE. L'analizzatore Seahorse XF è progettato per monitorare l'OCR in brevi periodi di tempo con manipolazioni acute della funzione mitocondriale. Tuttavia, i saggi di cavalluccio marino richiedono che le cellule vengano coltivate su piastre personalizzate, che non sono in grado di supportare un'elevata polarità e differenziazione dell'RPE21. Calton, Vollrath e colleghi hanno adattato il cavalluccio marino per la valutazione di colture di RPE altamente differenziate coltivate su supporti microporosi tagliando la membrana microporosa in pezzi e inserendoli nella piastra del cavalluccio marino, ma questo metodo funziona ancora solo per il monitoraggio a breve termine delle colture poiché le cellule non hanno accesso alla CO2 Durante il test, il test può essere eseguito solo in condizioni non sterili e il taglio del supporto microporoso indurrà la morte e la disfunzione della porzione del bordo del supporto microporoso nel tempo22. Il Barofuse è un sistema di perfusione senza pompa in cui strisce di RPE coltivate su supporti microporosi possono essere caricate nel sistema di perfusione, consentendo il monitoraggio dell'OCR in tempo reale23. Analogamente alla configurazione modificata per il cavalluccio marino da Calton, Vollrath e colleghi, i principali limiti della valutazione dell'RPE con Barofuse sono la necessità di tagliare i supporti microporosi e la natura a breve termine del punto finale del saggio. L'ossigrafo è progettato anche per rapidi cambiamenti cinetici nell'OCR in risposta a manipolazioni metaboliche24. Non è stato utilizzato per le colture RPE e soffrirebbe delle stesse limitazioni per la valutazione delle colture RPE altamente polarizzate e differenziate del cavalluccio marino e del barofuse.
A differenza di questi altri metodi, il sistema OCR qui descritto consente il monitoraggio dell'OCR mentre l'RPE viene coltivato in piastre/substrati di coltura cellulare standard in condizioni standard con terreni RPE standard in un incubatore di CO2 per colture cellulari standard, fornendo un sondaggio facile e conveniente di colture di RPE altamente differenziate e polarizzate. Oltre a generare dati sulle modifiche OCR in tempo reale da parte del sistema, quelle stesse cellule possono essere utilizzate per ulteriori saggi alla fine del periodo di monitoraggio OCR. Ciò consente di realizzare esperimenti altamente flessibili in cui l'effetto di un intervento sull'OCR viene ripetutamente testato per un periodo di settimane (ad es. - induzione dell'RPE EMT nella Figura 5) o in cui è possibile testare il recupero a lungo termine di un intervento (ad es. - recupero dal disaccoppiamento mitocondriale nella Figura 3) o in cui è possibile monitorare i cambiamenti metabolici a cascata in risposta a un intervento iniziale (ad es. - effetti del siero sull'OCR una volta esauriti i nutrienti dei terreni nella Figura 2). Il sistema OCR in questo documento è particolarmente utile per misurare l'OCR in colture di RPE altamente polarizzate e differenziate. Tali colture sono funzionalmente postmitotiche, con impacchettamento stretto e pigmentazione pesante. Ciò significa che ogni pozzetto contiene numeri di cella quasi identici9, ovviando così alla necessità di normalizzare l'OCR al numero di cellule per la maggior parte degli esperimenti. Anche quando è richiesta la normalizzazione del numero di cellule, la forte pigmentazione dell'RPE e i bordi cellulari ben delimitati consentono la normalizzazione con una conta cellulare semplice non invasiva basata sull'imaging in campo chiaro. Per gli esperimenti che coinvolgono RPE indifferenziato e proliferazione di RPE, come gli esperimenti EMT nella Figura 5, la normalizzazione dell'OCR per pozzetto al numero di cellule diventa necessaria per sapere cos'è l'OCR "per cellula".
Al di fuori del campo retinico, il sistema è stato impiegato per studiare la respirazione cellulare e l'attività metabolica in vari tipi di cellule, tra cui le cellule delle isole pancreatiche25, il muscolo scheletrico26, il cancro ovarico27, i cardiomiociti28 e persino interi organismi, come C. elegans29. Il monitoraggio in tempo reale e a lungo termine dell'OCR utilizzando il sistema OCR qui descritto ha rivelato informazioni chiave sui cambiamenti bioenergetici e sulla disfunzione mitocondriale in questi diversi modelli di malattia.
Il sistema Resipher comporta delle limitazioni. Il metodo per determinare l'OCR è fondamentalmente diverso da quello dell'analizzatore di cavallucci marini, del barofuse o dell'ossigrafo. Richiede la definizione di un gradiente O2 per calcolare l'OCR e il gradiente può richiedere ore per essere stabilito. Pertanto, esperimenti cinetici veloci, possibili negli altri sistemi, non sono possibili con questo sistema. Inoltre, a differenza degli altri sistemi, Resipher non dispone di porte di iniezione per la somministrazione rapida di piccole molecole o la raccolta di metaboliti. Invece, il coperchio di rilevamento deve essere rimosso in una cappa di coltura cellulare, con l'aggiunta di farmaci o la sostituzione dei terreni, insieme alla raccolta manuale dei metaboliti da analizzare.
Per stabilire e risolvere i problemi di un esperimento utilizzando il sistema OCR descritto in questo documento, si consiglia quanto segue. Innanzitutto, riduci al minimo l'evaporazione. Tenere presente che il gradiente O2 nella colonna multimediale sopra il monostrato RPE dipende fortemente dall'altezza della colonna9 e il sistema calcola l'OCR in base al gradiente O2 . Pertanto, se durante l'esperimento si verifica un marcato abbassamento della colonna del terreno a causa dell'evaporazione, il gradiente di O2 cambierà, influenzando le letture OCR. Mantenere piena la vaschetta dell'acqua per l'incubatrice è fondamentale, ma si suggerisce anche di mettere l'acqua in tutti i pozzetti inutilizzati della piastra a 96 pozzetti. Inoltre, i pozzetti sul bordo della piastra hanno tassi di evaporazione più elevati, quindi questi pozzetti vengono lasciati vuoti di celle negli esperimenti tipici presentati sopra. Il sensore di umidità sul sistema OCR può aiutare a monitorare l'umidità dell'incubatrice. Nella Figura 8A, il calo di umidità durante l'esperimento suggerisce che la vaschetta dell'acqua dell'incubatrice è vuota. Man mano che l'evaporazione accelera nel pozzo, le letture della concentrazione di O2 per il pozzo saliranno più in alto e alla fine si "appiattiranno" alla concentrazione atmosferica di O2 (~200 μM) (Figura 8A).
In secondo luogo, verificare che il "sandwich" del sistema OCR sia assemblato in modo appropriato. I punti di contatto metallici sulla parte inferiore del dispositivo e sulla parte superiore del coperchio di rilevamento devono essere puliti, senza detriti che impediscano il pieno contatto. Il dispositivo e il coperchio di rilevamento devono essere fissati completamente a filo e allineati uniformemente sulla piastra a 96 pozzetti senza alcuna inclinazione. Il cavo USB che collega il dispositivo all'hub non deve essere in tensione, il che può causare una torsione del "sandwich" e la limitazione del corretto movimento del dispositivo.
In terzo luogo, assicurarsi che il dispositivo e i sensori del coperchio di rilevamento siano calibrati. La Figura 2B descrive in dettaglio come verificare rapidamente il corretto funzionamento del sensore all'inizio di ogni esperimento. In quarto luogo, assicurarsi che un particolare pozzetto non dimostri un OCR anomalo prima della manipolazione sperimentale. Dopo aver verificato il funzionamento dei sensori, la determinazione dei valori OCR di base per tutti i pozzetti con celle può aiutare a determinare se alcuni pozzetti contengono cellule malsane. La Figura 8B mostra diversi pozzetti sottoposti a valutazione OCR di base, in cui il pozzetto di colore blu dimostra chiaramente un OCR inferiore (e quindi un'alta concentrazione di O2 ). Questo pozzo è un valore anomalo e dovrebbe essere escluso dalla manipolazione sperimentale.
In quinto luogo, ridurre al minimo le manipolazioni ambientali durante le letture OCR attive. Il gradiente di O2 è altamente sensibile alle variazioni di temperatura, umidità, livelli di CO2 dell'incubatrice e pressione atmosferica. L'apertura della porta dell'incubatore influisce in modo significativo su questi fattori, causando interruzioni temporanee nelle letture OCR fino a quando il gradiente di O2 della colonna del supporto non torna all'equilibrio (Figura 8C). I parametri che influenzano l'OCR possono essere monitorati nell'interfaccia online del sistema nella scheda "Ambiente" (Figura 8A).
Sesto, determinare il volume ottimale dei supporti per l'esperimento. Mentre un volume insufficiente del terreno può creare artefatti da un'eccessiva evaporazione (vedere la prima misura di risoluzione dei problemi sopra) o dall'esaurimento prematuro dei nutrienti nel terreno, un volume eccessivo del terreno limita la disponibilità di O2 al monostrato RPE, innescando l'ipossia9. La Figura 7 è uno screenshot del calcolatore online disponibile per determinare l'effetto del volume del mezzo sulla concentrazione di O2 al monostrato RPE. L'OCR massimo possibile per un determinato volume multimediale è visualizzato nella Figura 9A. Se la velocità di OCR per un dato esperimento che utilizza un dato volume si avvicina alla velocità mostrata nella Figura 9A, allora la concentrazione di O2 nel monostrato di RPE si avvicina all'anossia (0%) ed è necessario un volume del terreno inferiore. In generale, gli esperimenti che coinvolgono processi ad alta intensità mitocondriale in coltura di RPE dovrebbero avere volumi di terreno non superiori a 75 μL per 96 pozzetti.
Settimo, eseguire un'appropriata normalizzazione per isolare gli effetti di un intervento sperimentale sull'OCR. Poiché pozzi diversi possono avere un OCR di base diverso, è fondamentale ottenere le letture OCR di base per ciascun pozzetto prima di un intervento sperimentale. Sottrarre l'OCR basale dall'OCR dopo l'intervento sperimentale per ottenere il "Delta OCR", che dimostra l'effetto dell'intervento sperimentale sull'OCR. Il metodo per ottenere il "Delta OCR" è illustrato nella Figura 3 e nella Figura 9B. Se si è interessati agli effetti di un intervento sperimentale sulla capacità di un altro intervento sperimentale di indurre l'OCR, è necessaria un'ulteriore fase di normalizzazione, la "Delta-Delta OCR". Tale esempio è illustrato nella Figura 9B, dove la capacità del palmitato (un intervento sperimentale) di indurre un aumento dell'OCR (attraverso l'induzione della β-ossidazione) dipende dal tipo di terreno per la coltura di RPE (un secondo intervento sperimentale).
Infine, ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Il sistema monitora l'OCR introducendo un sensore di ossigeno nel mezzo sopra le celle. Ciò aumenta il rischio di infezione. Cali imprevisti dell'OCR durante l'esperimento o un OCR inaspettatamente basso all'inizio dell'esperimento potrebbero essere segni di un'infezione. Le piastre devono essere monitorate attivamente per l'infezione al microscopio per colture cellulari. La contaminazione incrociata tra piastre da 96 pozzetti potrebbe verificarsi se viene riutilizzato un coperchio di rilevamento. Per ridurre al minimo tale contaminazione incrociata, si dovrebbe immergere l'intero coperchio in etanolo al 70% per 20 minuti per la decontaminazione dopo l'esecuzione di un esperimento, prima di riutilizzare il coperchio di rilevamento in un nuovo esperimento (vedere la sezione 1.2.15 del protocollo).
In conclusione, viene presentato un protocollo per il monitoraggio in tempo reale e a lungo termine del metabolismo mitocondriale in colture di RPE ad alta fedeltà tramite la valutazione dell'OCR utilizzando un nuovo sistema chiamato Resipher. Può essere utilizzato per numerose applicazioni su colture di RPE altamente polarizzate e differenziate, in particolare, per sondare le proprietà metaboliche fisiologiche dell'RPE isolata e il metabolismo alterato dell'RPE in modelli in vitro di malattia retinica, tra cui AMD e PVR.

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule epiteliali funzionalmente postmitotiche e altamente polarizzate che formano una barriera tra i fotorecettori sensibili alla luce nella retina e la loro circolazione sanguigna, un letto capillare chiamato coriocapillare. Come il ruolo dei neuroni che supportano la glia, l'RPE svolge una miriade di funzioni per supportare i fotorecettori, tra cui la fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, il trasporto di nutrienti e il supporto metabolico per i fotorecettori e la secrezione di fattori di crescita essenziali, tutti fondamentali per il mantenimento della funzione visiva.
La degenerazione dell'EPR è alla base di diversi disturbi degenerativi comuni della vista. Nella degenerazione maculare legata all'età (AMD), una delle cause più comuni di perdita incurabile della vista nel mondo, l'EPR muore e i fotorecettori sovrastanti subiscono quindi una degenerazione secondaria. Nella vitreoretinopatia proliferativa (PVR), l'EPR esce invece dal suo stato postmitotico normalmente quiescente, proliferando e dedifferenziandosi in uno stato mesenchimale (una cosiddetta transizione da epitelio a mesenchima [EMT]) con alterazioni del suo metabolismo. La dedifferenziazione dell'RPE provoca una perdita del supporto dell'RPE ai fotorecettori, innescando anche uno stato più fibrotico. Ciò provoca sia la degenerazione dei fotorecettori che le cicatrici indotte da RPE, che innescano entrambe la perdita della vista 1,2.
Una parte importante del supporto dell'RPE ai fotorecettori è metabolica e la disregolazione metabolica è un fattore critico in numerose malattie della retina, tra cui AMD e PVR. L'RPE funge da barriera regolatoria tra i fotorecettori e la loro fonte di ossigeno e nutrienti, la coriocapillare. Pertanto, ciò che l'RPE sceglie di metabolizzare rispetto a ciò che l'RPE sceglie di passare dalla coriocapillare ai fotorecettori governa fortemente il metabolismo e la sopravvivenza dei fotorecettori. Numerosi studi hanno dimostrato che l'EPR è fortemente dipendente dal metabolismo mitocondriale per la sua normale salute e che i fotorecettori dipendono invece fortemente dalla glicolisi3. Questo ha introdotto il concetto di stati metabolici complementari e intrecciati tra i fotorecettori e l'EPR. In particolare, l'RPE riduce il suo metabolismo dei substrati metabolici preferiti dai fotorecettori e utilizza invece i sottoprodotti del metabolismo dei fotorecettori combinati con i metaboliti che i fotorecettori non consumano. In malattie come la PVR e l'AMD, l'evidenza suggerisce fortemente che l'RPE diventa più glicolitico e meno dipendente dal metabolismo mitocondriale; questo passaggio alla glicolisi dell'RPE può affamare i fotorecettori dei metaboliti di cui ha bisogno, innescando la degenerazione 4,5,6. Data l'interdipendenza tra l'RPE e il metabolismo dei fotorecettori e l'alterazione del metabolismo alla base della malattia retinica, c'è un forte interesse nel modellare e manipolare il metabolismo dell'RPE per scopi terapeutici.
Mentre lo studio del metabolismo mitocondriale dell'RPE in vivo è l'ideale, molti aspetti del metabolismo mitocondriale dell'RPE possono essere sondati praticamente solo in un sistema di coltura in vitro. Negli ultimi decenni sono stati compiuti progressi significativi verso colture di RPE ad alta fedeltà, al punto che le colture di RPE più accuratamente curate vengono ora utilizzate per la terapia di sostituzione cellulare negli studi clinici sull'uomo7. Per mantenere tali colture ad alta fedeltà, l'RPE deve essere coltivato su particolari substrati in particolari terreni per mesi prima della sperimentazione. Con queste condizioni, le colture di RPE sono massimamente differenziate e polarizzate, approssimando l'RPE in vivo. Sfortunatamente, non sono attualmente disponibili apparecchiature in grado di misurare il metabolismo mitocondriale in modo specifico dall'RPE in vivo. Mentre il monitoraggio dell'ossigeno della rete capillare retinica è stato ottenuto in vivo utilizzando l'ossimetria a risonanza paramagnetica elettronica (EPR)8, ciò non è possibile per l'analisi dell'RPE. Le differenze tra il metabolismo dell'RPE in vivo e in vitro non sono ben descritte, ma è stato dimostrato che le colture di RPE hanno un'elevata attività mitocondriale, simile all'RPE in vivo 3,9, suggerendo che è possibile ottenere informazioni significative sul metabolismo mitocondriale dell'RPE utilizzando colture di RPE ad alta fedeltà.
Poiché tutto il metabolismo mitocondriale porta al consumo di ossigeno, la misurazione dei tassi di consumo di ossigeno (OCR) di RPE è un proxy fedele per il metabolismo mitocondriale. La misurazione dell'OCR nelle colture di RPE è stata difficile, poiché le condizioni che promuovono la massima polarizzazione e differenziazione dell'RPE spesso precludono misurazioni OCR accurate a lungo termine con le tecniche attualmente disponibili, come l'analizzatore di cavallucci marini. In questo articolo sui metodi, viene introdotto un nuovo dispositivo, denominato Resipher (di seguito denominato "il sistema"), che consente la misurazione continua dell'OCR per settimane in RPE cresciuti in condizioni che promuovono al massimo la polarizzazione e la differenziazione. La facilità con cui l'OCR può essere misurato da questo sistema in condizioni di coltura RPE che promuovono al massimo la differenziazione e la polarizzazione dell'RPE è unica tra i dispositivi di misurazione OCR esistenti.
Questo documento fornisce suggerimenti e trucchi per l'utilizzo del sistema con colture RPE, seguito da una dimostrazione di due applicazioni particolari. In primo luogo, l'EMT RPE, che imita la PVR, è innescata dall'esposizione al fattore di crescita trasformante-beta (TGFβ)1,10,11,12. Il sistema viene utilizzato per monitorare l'evoluzione del metabolismo dell'RPE durante il processo EMT. In secondo luogo, il ruolo dell'ipossia nel metabolismo dell'RPE viene esplorato utilizzando questo sistema. L'ipossia è un importante contributo alla patogenesi dell'AMD, poiché la coriocapillare si assottiglia con l'età di13,14 anni. La combinazione di questo sistema con le camere di ipossia consente di modellare il metabolismo mitocondriale dell'RPE alterato con l'ipossia sottile che accompagna l'invecchiamento. Infine, viene introdotto un calcolatore online che utilizza i dati Resipher per consentire di determinare se le colture di RPE sono in condizioni ipossiche, normossiche o iperossiche. Tali informazioni sono fondamentali per trarre conclusioni sul metabolismo degli RPE da studi in vitro su colture di RPE.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-triiodo-L-tironina sale sodico</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32 canali Resipher lid</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A per Falco</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A da streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>Inibitore del complesso III della catena di trasporto degli elettroni</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>Agente di disaccoppiamento per aumentare la respirazione mitocondriale</td></tr><tr><td>DMSO, grado di coltura cellulare</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>Veicolo per la ricostituzione di farmaci mitocondriali</td></tr><tr><td>Substrati di rivestimento della matrice extracellulare: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>Matrice extracellulare per hfRPE</td></tr><tr><td>Substrati di rivestimento della matrice extracellulare: Vitronectina</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>Matrice extracellulare per iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP Sigma</td><td></td><td>C2920-10MG</td><td>Agente disaccoppiante per aumentare la respirazione mitocondriale</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (Bio-Techne S11550H)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone-Ciclodestrina</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Camera per ipossia</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 Media Supplement</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr> Soluzione di <tr><td>aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Sensore O2</td><td>Tecnologia Sensit o rilevatori forensi</td><td>P100 o FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TGF umano ricombinante&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>Fattore di crescita trasformante beta-2 per indurre la transizione epitelio-mesenchimale</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>Inibitore del complesso I della catena di trasporto degli elettroni</td></tr><tr><td>Piastra compatibile</td> con il sistema <td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM (modifica alfa dei supporti di Eagle)</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

Il metabolismo mitocondriale è fondamentale per la normale funzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un monostrato di cellule della retina importante per la sopravvivenza dei fotorecettori. La disfunzione mitocondriale RPE è un segno distintivo della degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità irreversibile nei paesi sviluppati, e della vitreoretinopatia proliferativa (PVR), una complicanza accecante dei distacchi di retina. Le condizioni degenerative dell'RPE sono state ben modellate da sistemi di coltura dell'RPE che sono altamente differenziati e polarizzati per imitare l'RPE in vivo . Tuttavia, il monitoraggio dei tassi di consumo di ossigeno (OCR), un proxy per la funzione mitocondriale, è stato difficile in tali sistemi di coltura perché le condizioni che promuovono la polarizzazione e la differenziazione ideali dell'RPE non consentono facili misurazioni OCR. 
Qui, introduciamo un nuovo sistema, Resipher, per monitorare l'OCR per settimane alla volta in colture di RPE ben differenziate, mantenendo l'RPE su substrati di crescita ottimali e terreni di coltura fisiologici in un incubatore di coltura cellulare standard. Questo sistema calcola l'OCR misurando il gradiente di concentrazione di ossigeno presente nel mezzo sopra le cellule. Discutiamo i vantaggi di questo sistema rispetto ad altri metodi per rilevare l'OCR e come impostare il sistema per misurare l'OCR nelle colture di RPE. Vengono illustrati i suggerimenti e i trucchi chiave per l'utilizzo del sistema, le avvertenze sull'interpretazione dei dati e le linee guida per la risoluzione dei problemi relativi ai risultati imprevisti. 
Forniamo anche un calcolatore online per estrapolare il livello di ipossia, normossia o iperossia sperimentata nelle colture di RPE in base al gradiente di ossigeno nei terreni sopra le cellule rilevate dal sistema. Infine, esaminiamo due applicazioni del sistema, misurando lo stato metabolico delle cellule RPE in un modello PVR e comprendendo come l'RPE si adatta metabolicamente all'ipossia. Prevediamo che l'uso di questo sistema su colture di RPE altamente polarizzate e differenziate migliorerà la nostra comprensione del metabolismo mitocondriale dell'RPE sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Presentiamo un nuovo dispositivo per misurare i tassi di consumo di ossigeno (OCR) nelle colture di epiteliale pigmentato retinico (RPE). Il dispositivo è in grado di misurare l'OCR per settimane su RPE coltivate su piastre di coltura cellulare standard con terreni standard mentre le piastre si trovano in un incubatore per colture cellulari standard.

Monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

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Monitoraggio a lungo termine dei tassi di consumo di ossigeno in colture epiteliali pigmentate retiniche altamente differenziate e polarizzate

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