Name: Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dellesposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Impara a caratterizzare le piastrine procoagulanti mediante citometria a flusso per misurare l'esposizione alla fosfatidilserina e il rilascio di microvescicole nel sangue umano. Questo protocollo aiuta a studiare l'emostasi.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisi della fosfatidilserina piastrinica e del rilascio di microvescicole

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A Provette per prelievo di sangue</td><td>BD Vacutainer</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-V FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>Apirasi di grado VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Collagene&nbsp;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Ionoforo Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Calbiochem/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Trombina&nbsp;</td><td>Trattino Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2O</td></tr><tr><td>&alpha; Integrina IIb (CD41, GPIIb) PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

La quantificazione delle piastrine e delle microvescicole procoagulanti si ottiene utilizzando la colorazione con annessina-V, con almeno 50.000 eventi registrati per campione. Come indicato nella fase 2.2, le misurazioni piastriniche al basale sono state effettuate da campioni incubati con tampone di reazione, come illustrato nella Figura 1A. Le dimensioni delle piastrine sono state misurate utilizzando il valore mediano di diffusione diretta (FSC). Sebbene l'FSC sia influenzato da vari fattori, rimane un proxy comune per la stima delle dimensioni delle cellule, inclusa quella delle piastrine. I grafici di densità dell'area (Figura 1A) sono stati utilizzati per identificare e bloccare le piastrine a riposo e le microvescicole rilasciate.
Nel caso delle piastrine non attivate, meno del 2,9% presentava fosfatidilserina (PS) come determinato dalla colorazione con Annexina-V. Dopo l'attivazione delle piastrine lavate con collagene da solo o in combinazione con trombina o ionoforo di calcio, c'è stato un aumento osservabile dell'esposizione al PS. Il collagene da solo ha provocato un aumento del 26,7% delle piastrine PS-positive. La trombina ha avuto effetti minimi sull'esposizione al PS (9,1%), ma quando associata al collagene, ha aumentato la percentuale di piastrine che espongono il PS al 36,2%. A titolo di riferimento, il trattamento con ionoforo da 2 μM ha portato il 49,6% delle piastrine a diventare procoagulanti.
La Figura 1 illustra che la proporzione basale di microvescicole da piastrine lavate in un individuo sano era minima (0,3%). Mentre la trombina e il collagene hanno aumentato minimamente la formazione di microvescicole, è stato solo con la combinazione di collagene e trombina che la formazione di microvescicole è aumentata significativamente (Figura 1D; 11,4%). L'aggiunta di 2 μM di ionoforo ha portato al 44,0% delle microvescicole formate dalle piastrine di controllo esposte al PS.
La Figura 2 fornisce informazioni relative alla variazione, alla ripetibilità e alla riproducibilità che ci si può aspettare da questo processo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
Figura 1: Esposizione al PS e formazione di microvescicole nelle piastrine di controllo a riposo e attivate. Le piastrine erano attivate o inattivate (a riposo) (A), con 30 μg/mL di collagene (B), con 0,5 U/mL di trombina (C), con combinazioni di collagene e trombina (D) con ionoforo da 2 μM. I dot plot rappresentativi mostrano la dimensione delle piastrine (diffusione diretta (log FSC)) rispetto al legame dell'annessina-V. Le linee orizzontali e verticali (E) delineano la popolazione piastrinica-negativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
Figura 2: Ripetibilità e riproducibilità dell'esposizione al PS e della formazione di microvescicole dopo l'incubazione con ionoforo. Analisi dell'esposizione al PS e della formazione di microvescicole dopo incubazione con ionoforo da 2 μM o 5 μM in piastrine lavate, trattate o non trattate con citrato (un chelante del calcio): (A) da 4 diversi controlli sani; (B) da un controllo sano ripetuto 5 volte; e (C) da due controlli sani preparati da due tecnici diversi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Conta piastrinica nel sangue intero (10,9 per ml)</td>
			<td>Forze centrifughe relative (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;30</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Forze centrifughe relative per la preparazione di plasma ricco di piastrine in relazione alla conta piastrinica nel sangue intero.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Importo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido citrico monoidrato (C6H8O7. H2Ø, 38 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrato trisodico diidrato (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)</td>
			<td>180 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosio (C6H12O6, 136 mM)</td>
			<td>24,6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Il pH della soluzione non deve essere regolato. Mantenere la soluzione a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Preparazione di una soluzione acquosa da 1 L di acido-citrato-destrosio (ACD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Importo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido citrico monoidrato (C6H8O7. H2O, 36 mM)</td>
			<td>7,56 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2,6 H2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Regolare il pH a 6,5. Mantenere la soluzione a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Preparazione della soluzione madre del tampone di lavaggio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Importo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% di albumina sierica bovina (BSA)</td>
			<td>583 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosio</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apirasi</td>
			<td>31,5 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 4: Preparazione di una soluzione estemporanea da 50 mL di tampone di lavaggio dalla soluzione madre.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Importo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2,7 mM)</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2,6 H2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (5 mM)</td>
			<td>1,19 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM</td>
			<td>0,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Regolare il pH a 7,4. Mantenere la soluzione a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 5: Preparazione di una soluzione madre di tampone di reazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagente</td>
			<td>Importo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% di albumina sierica bovina (BSA)</td>
			<td>167 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosio</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 6: Preparazione di una soluzione estemporanea da 50 mL di tampone di reazione dalla soluzione madre.

Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

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Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dellesposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane (Video) | JoVE Journal

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