Name: In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Scopri l'imaging bioluminescente in vivo per monitorare l'infezione da Leishmania infantum nei criceti d'oro mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici. Questo metodo consente il tracciamento in tempo reale del carico parassitario.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Ruiz-Postigo, J. A., et al. Global leishmaniasis surveillance, 2022: assessing trends over the past 10 years. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuiz-Postigo%2C+JA+%22WHO%2C+Weekly+epidemiological+record+n%C2%B0+40%22">WHO, Weekly epidemiological record n° 40</a>. , (2023).</li>
<li>Faraut-Gambarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+resistance+of+Leishmania+infantum+to+meglumine+antimoniate%3A+a+study+of+37+strains+collected+from+patients+with+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo resistance of Leishmania infantum to meglumine antimoniate: a study of 37 strains collected from patients with visceral leishmaniasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (4), 827-830 (1997).</li>
<li>Ribeiro-Romão, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+lesion+development%2C+tissue+damage%2C+and+cytokine+expression+in+golden+hamsters+%28Mesocricetus+auratus%29+infected+by+inocula+with+different+Leishmania+%28Viannia%29+braziliensis+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of lesion development, tissue damage, and cytokine expression in golden hamsters (Mesocricetus auratus) infected by inocula with different Leishmania (Viannia) braziliensis concentrations.</a> Infect Immun. 82 (12), 5203-5213 (2014).</li>
<li>Gomes-Silva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamster+%28Mesocricetus+auratus%29+as+an+experimental+model+for+Leishmania+%28Viannia%29+braziliensis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">hamster (Mesocricetus auratus) as an experimental model for Leishmania (Viannia) braziliensis infection.</a> Parasitology. 140 (6), 771-779 (2013).</li>
<li>Moreira, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hematological+and+biochemical+alterations+in+hamster+%28Mesocricetus+auratus%29+experimentally+infected+with+Leishmania+infantum+through+different+routes+of+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">hematological and biochemical alterations in hamster (Mesocricetus auratus) experimentally infected with Leishmania infantum through different routes of inoculation.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 181-194 (2016).</li>
<li>Carnielli, J. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Leishmania+infantum+genetic+marker+associated+with+miltefosine+treatment+failure+for+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">A Leishmania infantum genetic marker associated with miltefosine treatment failure for visceral leishmaniasis.</a> EBioMedicine. 36, 83-91 (2018).</li>
<li>Carnielli, J. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+resistance+of+Leishmania+infantum+to+miltefosine+contributes+to+the+low+efficacy+in+the+treatment+of+visceral+leishmaniasis+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Natural resistance of Leishmania infantum to miltefosine contributes to the low efficacy in the treatment of visceral leishmaniasis in Brazil.</a> Am J Trop Med Hyg. 101 (4), 789-794 (2019).</li>
<li>Moreira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+continuous+axenic+cultivation+in+Leishmania+infantum+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469(2012).</li>
<li>Fortin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+oleylphosphocholine+%28OlPC%29+in+a+laboratory+model+of+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of oleylphosphocholine (OlPC) in a laboratory model of visceral leishmaniasis.</a> J Antimicrob Chemother. 67 (11), 2707-2712 (2012).</li>
<li>Rodrigues, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gingival+vein+is+a+minimally+traumatic+site+for+multiple+blood+sampling+in+guinea+pigs+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The gingival vein is a minimally traumatic site for multiple blood sampling in guinea pigs and hamsters.</a> PLoS ONE. 12 (5), e0177967(2017).</li>
<li>Oliveira, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+report%3A+Gingival+vein+punction%3A+A+new+simple+technique+for+drug+administration+or+blood+sampling+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Technical report: Gingival vein punction: A new simple technique for drug administration or blood sampling in rats and mice.</a> Scand J Lab Anim Sci. 36 (2), 109-113 (2009).</li>
<li>Saeij, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+Toxoplasma+gondii+infection+in+living+mice+reveals+dramatic+differences+between+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of Toxoplasma gondii infection in living mice reveals dramatic differences between strains.</a> Infect Immun. 73 (2), 695-702 (2005).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 41, e1980(2010).</li>
<li>Andriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+in+vivo+of+anti-Trypanosoma+cruzi+compounds+selected+from+a+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Activity in vivo of anti-Trypanosoma cruzi compounds selected from a high throughput screening.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (8), e1298(2011).</li>
<li>Henriques, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mice+infected+with+bioluminescent+Trypanosoma+cruzi+unveils+novel+sites+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mice infected with bioluminescent Trypanosoma cruzi unveils novel sites of infection.</a> Parasit Vectors. 7, 89(2014).</li>
<li>Henriques, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+of+Trypanosoma+cruzi+infection+in+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging of Trypanosoma cruzi infection in Rhodnius prolixus.</a> Parasit Vectors. 26 (5), 214(2012).</li>
<li>Sereno, D., Lemesre, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenically+cultured+amastigote+forms+as+an+in+vitro+model+for+investigation+of+antileishmanial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Axenically cultured amastigote forms as an in vitro model for investigation of antileishmanial agents.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 972-976 (1997).</li>
<li>Lachaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+two+PCR+methods+for+the+diagnosis+of+canine+visceral+leishmaniasis+and+the+detection+of+asymptomatic+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Value of two PCR methods for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis and the detection of asymptomatic carriers.</a> Parasitology. , 197-207 (2002).</li>
<li>Blood sampling Microsite. , National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of animals in research (NC3RS). 
 <a target="_blank" href=" https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-hamster"> https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-hamster</a> (2021).</li>
<li>Bolhassani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Leishmania+species%3A+development+of+stable+GFP+expression+and+its+application+for+in+vitro+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies.</a> Exp Parasitol. 127 (3), 637-645 (2011).</li>
<li>Mendes Costa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+infection+with+bioluminescent+Leishmania+infantum+axenic+amastigotes+applied+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Murine infection with bioluminescent Leishmania infantum axenic amastigotes applied to drug discovery.</a> Sci Rep. 9 (1), 18989(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Scala da 1 kb</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>1-butanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td></td></tr><tr><td>Acetil coenzima A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, LE, grado analitico</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>aprt primer inverso A1715 aprt primer inverso A1715</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-111</td><td></td></tr><tr><td>BamHI 10 U/ mL</td><td>Promega</td><td>R6021</td><td></td></tr><tr><td>BglII 10 U/mL</td><td>Promega</td><td>R6071</td><td></td></tr><tr><td>infusione cerebrale e cardiaca (BHI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (ketamina cloridrato 10%)</td><td>Syntec-Uso</td><td></td> <td>veterinario. Anestetico. Soluzione iniettabile contenente un flaconcino da 10 mL di ketamina cloridrato al 10%.</td></tr><tr><td>Destrosio Glucosio, BD Diagnostics</td><td>Difco</td><td>215530</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina sale di potassio</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basso glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>eletroporador Gene Pulser Xcell&nbsp;</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>vitrocell/embriolife</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-plaqueTM PLUS&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione Gene Pulser/MicroPulser, 0,2 cm di distanza 1652082</td><td>Bio-Rad</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione Gene Pulser/MicroPulser, 0,4 cm di distanza 1652081&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Platino polimerasi</td><td>Fischer Scientific</td><td>10-966-034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Hemin polvere</td><td>inlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>hyg forward primer A3804</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-109</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>ISOFORINA</td><td>Cristalia</td><td></td><td>Soluzione per inalazione in confezioni contenenti 1 flacone da 100 e 240 mL di isoflurano</td></tr><tr><td>IVIS Lumina</td><td>Perkin Elmer</td><td>ISO838N4625</td><td></td></tr><tr><td>JM109 Competent Cells</td><td>Promega</td><td>&nbsp; L2005</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA/HindIII Marker</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>SM0101</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Living Image software</td><td>Perkin Elmer-NotI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 U/mL</td><td>Promega</td><td>R6431</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico, 25:24:1 (v/v), grado di biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>Plasmide Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>pLEXSY-hyg2&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>EGE-232</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Promega</td><td>V3021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit midi plasmidico QIAGEN</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR & Kit di pulizia in gel</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763 Lettore di micropiastre Sigma-Al</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax2</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssu primer forward F3001 primer F3001</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-105</td><td></td></tr><tr><td>ssu reverse primer F3002 ssu reverse primer F3002</td><td>Jena Bioscience</td><td>PM-104</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>SwaI 10 U/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER1241</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi 1 U/mL</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>T4 sistema di legatura rapida</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veritiy Piastra</td><td></td>a 96 pozzetti</tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787 Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di soia triptico (mezzo digestato di soia-caseina)</td><td>Difco-BD</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Rack ventilati&nbsp;</td><td>Alesco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con Earle&prime; sali e L-glutammina, senza bicarbonato di sodio, in polvere,&nbsp;</td><td>Merck</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e PCR Clean-Up</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Xilazina cloridrato 2%)</td><td></td><td></td><td>Syntec-Uso veterinario. Sedativo, analgesico e miorilassante. Soluzione iniettabile contenente un flaconcino da 10 mL di xilazina cloridrato al 2%.</td></tr><tr><td>Kit di clonazione Zero Blunt TOPO PCR&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td>451245</tr></tbody></table>

in vivo imaging di criceti infetti da leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi

In Vivo Imaging of Leishmania infantum-infected Hamsters by Gingival Inoculation of Axenic Amastigotes Expressing Luciferase

Espressione stabile della luciferasi in L. infantum L. infantum geneticamente modificato è stato prodotto utilizzando il plasmide della linea pLEXSY, che si integra nel genoma di Leishmania nel locus ribosomiale 18S rRNA (ssu), la cui trascrizione è guidata dalla RNA polimerasi I. Pertanto, i cloni di L. infantum-Luc sono stati valutati per l'integrazione plasmidica nel genoma di Leishmania e per l'espressione stabile mediante emissione di bioluminescenza in vitro. Il clone altamente esprimente che mostra bioluminescenza &gt;120 volte sopra lo sfondo è stato scelto per la valutazione dell'integrazione genomica mediante PCR. Vedere la Figura 1 per l'elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti PCR per valutare l'integrazione plasmidica nel genoma e l'emissione di bioluminescenza (RLU) dei promastigoti del clone di L. infantum-Luc. Da ciascuna PCR sono stati ottenuti frammenti delle dimensioni previste; un prodotto di circa 1,1 kb (5'ssu - utr1) e un altro di 1,8 kb (hyg-3'ssu) sono stati amplificati dal genoma di L. infantum-Luc (Figura 1A), confermando l'integrazione della cassetta plasmidica e del gene della luciferasi nel locus ssu del genoma di L. infantum.
L'espressione della luciferasi della lucciola è stata valutata anche nei promastigoti di L. infantum-Luc mediante emissione di bioluminescenza (RLU) nel lettore di micropiastre, come descritto nei protocolli, sezione 2. Anche dopo diversi passaggi in coltura e in topi BALB/c per 5 giorni, ha mantenuto il livello di bioluminescenza; 569,3 ± 19,5 per il fondo wild type, e 59361,9 ± 2673,3 (n = 2) per il clonato L. infantum-Luc (Figura 1B). Così, il clone di L. infantum-Luc, che esprime stabilmente la luciferasi della lucciola, è stato utilizzato per infettare i criceti attraverso le vie intragengivali o intraperitoneali.
Inoculo endovenoso nella vena gengivale Per inoculare la Leishmania nel flusso sanguigno dei criceti, è necessario prestare attenzione per ridurre al minimo la perforazione delle vene, il sanguinamento e la fuoriuscita dell'inoculo. Pertanto, il labbro inferiore deve essere tirato delicatamente verso il basso per esporre la vena gengivale (Figura 2A); e un ago da 30 G di calibro più piccolo deve essere utilizzato per evitare un'eccessiva perforazione della vena. L'ago deve essere posizionato con la lunetta rivolta verso l'alto per inserirsi nella vena con un'angolazione corretta (Figura 2B). Infatti, per garantire che l'ago sia stato iniettato nel vaso, la vena labiale mandibolare, lo stantuffo della siringa deve essere tirato verso il basso fino a quando il sangue non viene aspirato nel cilindro dell'ago (Figura 2C). Prima della rimozione dell'ago, è necessario applicare una leggera pressione con un batuffolo di cotone per favorire l'emostasi (Figura 2D).
Valutazione longitudinale mediante imaging a bioluminescenza I criceti infettati per via intraperitoneale (IP) o per via intragengivale (IG) con L. infantum-Luc sono stati seguiti fino al 50° dpi e sono stati valutati mediante imaging a bioluminescenza fino a 22 dpi (Figura 3). Le immagini sono state acquisite 2 ore dopo l'infezione intraperitoneale con 108 parassiti nella cavità peritoneale; Le immagini sono state acquisite per 30 s o 1 minuto di esposizione binning medium. Il segnale di bioluminescenza era &gt;65 volte più intenso nell'addome negli animali infetti da amastigote (4,6 × 105 ± 3,7 × 105) rispetto a quelli infetti da promastigoti (6,8 × 103 ± 3,8 × 103) (Tabella 1), il che dimostra che gli amastigoti differenziati in vitro sono più bioluminescenti dei promastigoti metaciclici in fase stazionaria e purificati nel cuscinetto di Ficoll.
Un giorno dopo l'infezione (1 dpi), sono state acquisite immagini in bioluminescenza per 3 minuti di esposizione (Figura 3). C'è stata una diminuzione del 45% del segnale di bioluminescenza nella regione addominale nei criceti infetti da promastigoti e del 70% in quelli infetti da amastigoti (Figura 3), il che suggerisce che gli amastigoti si erano degradati in misura maggiore rispetto ai promastigoti metaciclici (Tabella 1 e Figura 4). Una settimana dopo l'infezione (8 dpi), gli animali infetti da promastigoti hanno sostenuto il segnale di bioluminescenza (3,3 × 103 ± 5 × 103). Tuttavia, l'emissione di bioluminescenza nei criceti infetti da amastigote è diminuita del 95%, da 1,3 × 105 ± 1,1 × 105 a 6,7 × 103 ± 7,5 × 103 (Tabella 1) e ha raggiunto lo stesso livello dei criceti infetti da promastigote. Tre settimane dopo l'infezione (22 dpi), è stato acquisito un segnale di bioluminescenza per 5 minuti di esposizione e binning large (Figura 3); il segnale era molto più basso per i promastigoti e gli animali infetti da amastigoti (Tabella 1 e Figura 4).
Un altro gruppo di criceti è stato infettato per via intragengivale con amastigoti e promastigoti di L. infantum-Luc (10,8); è stata osservata un'emissione di bioluminescenza nella regione mascellare (Figura 3). Il follow-up è iniziato 1 giorno dopo l'infezione e i criceti infetti da amastigote hanno mostrato più segnale di bioluminescenza e radiosità (7,3 × 103 ± 4,1 × 103) rispetto a quelli infetti da promastigoti (1 × 103 ± 5,7 × 102). Una settimana dopo l'infezione (8 dpi), è stato osservato un calo del 36% del segnale di bioluminescenza negli animali infetti da promastigoti e del 90% nei criceti infetti da amastigote; La radianza variava da 7,3 ×10 3 ± 4,1 × 103 a 7,8 × 102 ± 5,6 × 102 (Tabella 1). Tre settimane dopo l'infezione (22 dpi), è stato acquisito anche un segnale di bioluminescenza per 5 minuti di esposizione e binning large (Figura 3). Il segnale di bioluminescenza era simile e basso per gli animali infetti da promastigote e amastigoti (Tabella 1 e Figura 4) nella testa degli animali infettati alla gengiva e non è stata osservata dispersione dell'infezione nella regione addominale da parte del segnale di bioluminescenza.
Valutazione dell'infezione nei tessuti e negli organi mediante PCR Abbiamo eseguito la PCR convenzionale per studiare l'infezione in organi specifici, come fegato, milza e linfonodi, che potrebbero essere al di sotto del limite di rilevamento dell'imaging in vivo . La regione bersaglio del kDNA era più specifica per l'amplificazione del DNA di L. infantum nei tessuti e negli organi infetti, e la PCR per l'enzima GAPDH dal criceto era un controllo dell'integrità del DNA e della reazione PCR. Nell'analisi sono stati presi in considerazione solo i campioni che sono stati amplificati per GAPDH . Così, mediante PCR, due dei tre criceti infettati per via intraperitoneale con amastigoti axenici hanno mostrato un'infezione nei tessuti e negli organi; l'animale due (A2) nella milza e l'animale tre (A3) nel fegato, a 50 dpi (Figura 5A). Un criceto è stato infettato per via intraperitoneale con promastigoti axenici; l'animale tre (A3) (Figura 5B) ha mostrato amplificazione nel linfonodo. I criceti inoculati per via intragengivale con promastigoti o amastigoti axenici a 50 dpi non potevano mostrare una chiara amplificazione: solo una banda nel fegato di un animale (A1) infetto da promastigoti (Figura 5C). In particolare, abbiamo avuto tre animali mantenuti per 8 mesi il cui inoculo somministrato per via intragengivale con amastigoti ha perso leggermente durante l'iniezione. Due dei tre animali hanno mostrato una chiara infezione nel fegato, gli animali uno e due (Figura 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig01.jpg"> 
Figura 1: Valutazione del clone di Leishmania infantum-Luc mediante PCR ed emissione di bioluminescenza. (A) Elettroforesi su gel di agarosio di prodotti PCR per valutare l'integrazione plasmidica nel genoma: corsia 1 - 1 kb scala del DNA; PCR del DNA genomico di L. infantum-Luc, corsia 2 - 5'ssu - utr1 (1.1 kb) e corsia 3- hyg- 3'ssu (1.8 kb); PCR del DNA genomico di L. infantum-wt, corsie 4 e 5. (B) Emissione di bioluminescenza (RLU) di promastigoti di clone di L. infantum-Luc (10,6) nel lettore di micropiastre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig02.jpg"> 
Figura 2: Iniezione endovenosa di Leishmania infantum-Luc nella vena gengivale. (A) Il criceto è stato posto in decubito dorsale e il labbro inferiore è stato abbassato. (B) Un ago più sottile (8 x 0,30 mm) accoppiato a una siringa da 1 ml è stato posizionato sotto gli incisivi inferiori lungo la linea mediana tra la coppia di denti con un angolo di 25º e inserito 2-4 mm nella vena mandibolare labiale. (C) Inoculazione di 50 μl (10,8) di amastigoti o promastigoti in PBS. (D) Emostasi utilizzando un batuffolo di cotone e applicando una leggera pressione sul sito di inoculazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig03.jpg"> 
Figura 3: Follow-up mediante imaging a bioluminescenza in vivo . Immagini rappresentative di un animale per gruppo: Infettato tramite intraperitoneale (pannelli superiori) o intragengivale (pannelli inferiori), con amastigoti o promastigoti di L. infantum-Luc, per 1, 8 e 22 dpi. ROI rosso che rappresenta le regioni sondate all'addome e alla testa, rispettivamente per l'infezione intraperitoneale o intragengivale. I dati mostrano che a 1 dpi, tutti gli animali mostravano un segnale di bioluminescenza nell'addome o nella mandibola. Il segnale diminuiva dopo 8 dpi ed era quasi impercettibile in qualsiasi gruppo a 22 dpi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig04.jpg"> 
Figura 4: Analisi comparativa della radianza da immagini in bioluminescenza. La quantificazione della radianza photons.sec-1.cm-2.sr-1 è stata eseguita nell'addome o nella testa dei criceti con strumenti manuali di misurazione del ROI. Il ROI medio di fondo è stato sottratto dal ROI della misurazione per rimuovere qualsiasi segnale spurio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67050/67050fig05.jpg"> 
Figura 5: Amplificazione PCR del kDNA. (A) IP-AMA, criceti infettati per via intraperitoneale con amastigote, 50 dpi (n = 3); (B) IP-PRO, infettato per via intraperitoneale con promastigoti, 50 dpi (n = 3); (C) IG-AMA, infettato per via intragengivale con amastigote (n = 2), IG-PRO, infettato per via intragengivale con promastigote (n = 2); (D) IG-AMA, infettato per via intragengivale con amastigote, 8 mesi dopo l'infezione (n = 3). NI, criceti non infetti come controllo negativo (n = 2); C- DNA genomico di L. infantum-Luc, controllo positivo della PCR. Tessuti e organi: 1- milza, 2- fegato, 3- linfonodi. MW- Marcatore di peso molecolare, le frecce indicano le bande di peso molecolare più basse. A1- animale uno, A2- animale due e A3- animale tre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67050/67050fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">Dpi</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Amastigotes IP</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Promastigotes IP</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Amastigotes IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td colspan="2" style="min-width: 60px;">Promastigotes IG</td>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;"></td>
			<td style="min-width: 60px;">Significare</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Significare</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Significare</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
			<td style="min-width: 60px;">Significare</td>
			<td style="min-width: 60px;">SD</td>
			<td style="min-width: 60px;">N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">0</td>
			<td style="min-width: 60px;">4,6 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,7 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
			<td style="min-width: 60px;">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">1</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,3 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,1 x 105</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,8 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">4,1 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,7 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">8</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,7 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,5 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">3,3 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,0 x 103</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,8 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">6,4 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,2 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 60px;">22</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,3 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">9,9 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">8,6 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">3</td>
			<td style="min-width: 60px;">4,6 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">7,5 x 101</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
			<td style="min-width: 60px;">5,0 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">1,5 x 102</td>
			<td style="min-width: 60px;">2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Dati grezzi dall'analisi comparativa della radianza delle immagini di bioluminescenza. Quantificazione della radianza fotoni medi.sec-1.cm-2.sr-1 per gruppo e percorso. Abbreviazioni: dpi = giorni dopo l'infezione; SD = deviazione standard; N = dimensione del campione.

In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi

American tegumentary leishmaniasis (ATL) and visceral leishmaniasis (VL) are considered neglected by the World Health Organization. VL can be lethal if ...

in-vivo-imaging-leishmania-infantum-infected-hamsters-gingival

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imaging in vivo del transgenico parassiti Leishmania in un host live

Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Ottimizzazione del modello sperimentale per criceto leishmaniosi cutanea da iniezione intradermica...

Leishmaniosi cutanea nella pelle dorsale di criceti: ​​un modello utile per lo screening delle droghe Antileishmanial

Un saggio parassita-salvataggio e di trasformazione con THP1 cellule...

Un test Parasite salvataggio e di trasformazione per screening Antileishmanial contro intracellulare<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoti in THP1 umana linea cellulare Leucemia acuta Monocytic

Utilizzando luciferasi e sistemi di imaging in vivo (IVIS) come un nuovo mezzo per identificare terminazioni malattia prima sviluppi clinici verificarsi. IVIS ci ha permesso di visualizzare in tempo reale l'invasione di virus encefalitiche più giorni, fornendo un modello di malattia più accurato per lo studio futuro. E ci ha anche permesso di identificare le caratteristiche potenziali di protezione di antivirali e vaccini più veloce rispetto ai modelli animali attualmente utilizzati. La...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo...

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato...

Uso di<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging per monitorare la progressione della Sperimentale mouse infezione da citomegalovirus nei neonati

Questo articolo riporta un metodo dettagliato per la misurazione dinamica e la quantificazione della velocità del flusso sanguigno all'interno dei singoli vasi sanguigni del sistema vascolare epatico di topo utilizzando l'imaging al microscopio intravitale in combinazione con una metodologia specifica per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

Qui, presentiamo un protocollo compilato per valutare l'infezione cutanea dei topi con Leishmania amazonensis. Questo è un metodo affidabile per studiare la virulenza dei parassiti, consentendo una visione sistemica della risposta dell'ospite vertebrato all'infezione.

Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

Il protocollo qui fornito descrive i passaggi dettagliati per eseguire studi di efficacia dei farmaci in un modello bioluminescente di infezione da Trypanosoma cruzi , con particolare attenzione all'acquisizione, all'analisi e all'interpretazione dei dati. Vengono inoltre fornite procedure di risoluzione dei problemi e controllo qualità per ridurre al minimo i problemi tecnici.

Demistificazione dell'imaging in bioluminescenza in vivo di un modello murino della malattia di Chagas per studi sull'efficacia dei farmaci

Scopri l'imaging bioluminescente in vivo per monitorare l'infezione da Leishmania infantum nei criceti d'oro mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici. Questo metodo consente il tracciamento in tempo reale del carico parassitario.

In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi (Video) | JoVE Journal

In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi

Esplora altri video