Name: Identificazione di cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di pesce zebra mediante colorazione della proliferazione cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Scopri come identificare cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di Danio rerio mediante colorazione della proliferazione cellulare. Questo metodo consente di isolare cellule dormienti per screening di farmaci in vivo e analisi trascrittomica.

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In questo protocollo, stiamo utilizzando cellule T-ALL di pesce zebra marcate con GFP che sono state generate in precedenza nel ceppo CG1 e quindi possono essere iniettate direttamente nel pesce zebra CG1 singeneico ricevente15. In breve, la leucemia è stata generata mediante microiniezione di DNA di rag2:Myc e rag2:GFP in embrioni di zebrafish CG1 a cellula singola. Gli animali sono stati monitorati per lo sviluppo della leucemia a partire da 3 settimane dopo l'iniezione, utilizzando la microscopia a fluorescenza. Le cellule leucemiche GFP-positive sono state isolate FACS e trapiantate in serie in zebrafish CG1 ricevente per generare cloni con un'alta frequenza di LSC. I dettagli dell'intero protocollo sono descritti da Blackburn et al.15.
In alternativa, la T-ALL primaria derivata da rag2:Myc può essere generata mediante microiniezione di DNA di embrioni di zebrafish17. La microiniezione di DNA di rag2:Myc con un reporter fluorescente guidato da rag2 come la GFP può portare allo sviluppo di cellule B, cellule T e ALL18 miscelate. I cloni leucemici utilizzati in questo protocollo sono stati precedentemente verificati come T-ALL15. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono il pesce zebra sono state esaminate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Kentucky, protocollo 2019-3399.
1. Propagazione delle cellule T-ALL di zebrafish in vivo
<ol><li>Scongelare un flaconcino contenente 1 mL di cellule T-ALL di pesce zebra congelate marcate con GFP in un bagno d'acqua a 37 °C con agitazione delicata, fino allo scongelamento. Una volta scongelato, trasferire sul ghiaccio.</li>
	<li>Pipettare lentamente il contenuto della provetta in una provetta conica da 15 mL con 4 mL di terreno di coltura per pesci (0,9x PBS + 5% FBS) per diluire il mezzo di congelamento.</li>
	<li>Centrifugare per 5 minuti a 2.500 × g a 4 °C. Rimuovere il materiale dal pellet. Risospendere in 0,5 mL di terreno di coltura per pesci e mantenere le cellule in ghiaccio.</li>
	<li>Contare le cellule e, se necessario, diluirle a 100.000 cellule/5 μL.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce zebra CG1 adulto aggiungendo 200 μL di anestetico da 4 mg/mL (MS-222) a 25 mL di acqua del sistema ittico in una capsula di Petri. Tenere il pesce CG1, con il lato ventrale rivolto verso l'alto e iniettare 5-6 μL nello spazio intraperitoneale (IP) utilizzando una siringa da microlitri di Hamilton. Riporta gli animali nelle loro vasche e monitora il ritorno al nuoto normale prima di rimetterli nel sistema. NOTA: Per gli studi di trapianto descritti in questo protocollo sono stati utilizzati pesci zebra adulti, di 60 giorni o più.</li>
	<li>Monitora la crescita della leucemia una volta alla settimana utilizzando un microscopio a fluorescenza. Si veda la Sezione 2 di seguito per i dettagli sulla procedura di screening.</li>
</ol>2. Raccolta di cellule leucemiche marcate in fluorescenza
<ol><li>Circa 21-28 giorni dopo il trapianto, anestetizzare il pesce zebra CG1 adulto aggiungendo 200 μL (4-5 gocce) di anestetico 4 mg/mL a 25 mL di acqua del sistema dei pesci in una capsula di Petri.</li>
	<li>Esaminare il CG1 zebrafish per il carico di leucemia valutando la percentuale di cellule leucemiche marcate con GFP nell'animale con un microscopio a epifluorescenza, utilizzando il filtro appropriato per rilevare la fluorescenza GFP. La leucemia GFP-positiva è pronta per essere raccolta se si è diffusa nel &gt;70% dell'animale.</li>
	<li>Sopprimere l'animale aggiungendo 1 ml di anestetico da 4 mg/ml in una capsula di Petri contenente 9 ml di acqua del sistema dei pesci. Permettete che tutti i segni di vita cessino; Ad esempio, osservare i pesci per la cessazione del movimento opercolare (~5 min).</li>
	<li>Sposta il pesce zebra in una nuova capsula di Petri e aggiungi 1 ml di terreno di coltura per pesci che funga da tampone per le cellule. Usando una nuova lama di rasoio, prima decapitare il pesce zebra, quindi macerare il tessuto usando la stessa lama di rasoio. Pipet su e giù per rimuovere grandi grumi di cellule.</li>
	<li>Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da 50 mL per dissociarle in una sospensione a cellula singola. Mantieni le celle sul ghiaccio.</li>
</ol>3. Ottimizzazione della concentrazione del colorante di proliferazione cellulare (CellTrace Far Red) per la colorazione e la vitalità cellulare del pesce zebra
NOTA: Per questo protocollo, e poiché le cellule tumorali sono marcate con GFP, abbiamo utilizzato un colorante di proliferazione delle cellule rosse lontane (CellTrace Far Red) per evitare la sovrapposizione spettrale, che verrà indicato come CT-FR.
<ol><li>Preparare una soluzione da 1 mM del colorante fluorescente immediatamente prima dell'uso aggiungendo il volume appropriato di DMSO secondo le raccomandazioni del produttore. Avere soluzioni di lavoro di 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM e 0,01 mM; Diluire secondo necessità in terreni di coltura per pesci per testare la vitalità cellulare dopo la colorazione.</li>
	<li>Contare le cellule e raccogliere 1 × 106 cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 2.500 × g a 4 °C per 5 min. Rimuovere il liquido e risospendere le cellule in 1 mL di PBS 0,9x.</li>
	<li>Dividere la sospensione cellulare in quattro provette da 250 μl ciascuna per il trattamento con CT-FR.</li>
	<li>Aggiungere 250 μl di PBS 0,9x per portare il volume fino a 500 μl ciascuno con circa 250.000 cellule/provetta.</li>
	<li>Aggiungere le quantità necessarie delle soluzioni di lavoro sopra descritte a ciascuna delle quattro provette per ottenere le seguenti concentrazioni finali di 1 μM, 0,5 μM, 0,1 μM e 0,05 μM. Incubare per 20 minuti a 37 °C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Pellettare le celle centrifugando a 2.500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido e lavare le celle con 500 μL di terreno di coltura per pesci per rimuovere il colorante in eccesso.</li>
	<li>Pellettare di nuovo, rimuovere il liquido e risospendere in 25 μL di terreno di coltura per pesci. Utilizzare 1 μl per contare le cellule in una diluizione 1:10 in blu di tripano al 50%.</li>
	<li>Esaminare le cellule al microscopio per verificarne la vitalità cellulare; le cellule vive non manterranno il blu di tripano e appariranno luminose al microscopio, mentre le cellule morte assorbiranno il colorante e appariranno scure. Esaminare prima le cellule sotto il canale di fluorescenza appropriato per identificare le cellule tumorali e quindi utilizzare il canale del campo chiaro per valutare la vitalità cellulare.</li>
	<li>Selezionare la concentrazione che consente di colorare con successo mantenendo la vitalità cellulare (&gt;90% di cellule blu di tripano negative). NOTA: Per le cellule T-ALL di zebrafish testate in questo esperimento, è stata utilizzata una concentrazione di 1 μM per una colorazione di successo e il &gt;90% della vitalità cellulare.</li>
</ol>4. Propagazione in vivo di cellule di pesce zebra T-ALL colorate con CT-FR
<ol><li>Utilizzando la concentrazione ottimizzata di CT-FR della Sezione 3, colorare le cellule del pesce zebra. Lasciare alcune cellule tumorali non colorate per la generazione del tumore T-ALL marcato con GFP, come controllo positivo alla GFP durante lo smistamento FACS. Diluire le cellule colorate e non colorate a 50.000 cellule/5 μL per il trapianto.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce zebra CG1 adulto aggiungendo 200 μL di anestetico da 4 mg/mL a 25 mL di acqua del sistema ittico in una capsula di Petri.</li>
	<li>Iniettare 5 μl della sospensione cellulare nella cavità IP del pesce zebra come descritto nella Sezione 1 sia per le cellule colorate che per quelle non colorate. Iniettare 5-6 zebrafish per gruppo per tenere conto della potenziale mortalità dopo l'iniezione.</li>
	<li>Esaminare gli animali mediante microscopia fluorescente sotto sedazione 2 volte alla settimana per lo sviluppo della leucemia. NOTA: Dopo ~10-14 giorni, la leucemia dovrebbe occupare circa il 30-40% di questo corpo. Pianificare il prelievo della leucemia e il successivo smistamento entro questo lasso di tempo. Aspettare che il tumore si espanda a grandi dimensioni potrebbe comportare una maggiore diluizione del colorante cellulare fluorescente e difficoltà nel rilevare il suo segnale. Considerare l'ottimizzazione dei tempi di prelievo del tumore per il modello tumorale scelto. Inoltre, si raccomanda un monitoraggio più frequente del tumore per garantire la cattura della dimensione del tumore desiderata.</li>
</ol>5. Preparazione per lo smistamento di cellule T-ALL di pesce zebra colorate con CT-FR
<ol><li>Preparare i seguenti controlli per lo smistamento delle cellule: Nessun controllo del colore (non colorato, non transgenico, sospensione di una singola cellula, da un pesce zebra di tipo selvatico), cellule T-ALL marcate con GFP e cellule di pesce zebra CT-FR WT appena colorate (per impostare una soglia massima del segnale Far-Red).</li>
	<li>Preparazione di controlli non colorati e CT-FR<ol><li>Raccogliere cellule di pesce wild-type (WT) mediante eutanasia di un pesce zebra CG1 non trapiantato aggiungendo 1 mL di anestetico da 4 mg/mL in una capsula di Petri contenente 9 mL di acqua del sistema ittico.</li>
		<li>Sposta il pesce zebra in una nuova capsula di Petri e aggiungi 1 ml di terreno di coltura per pesci che funga da tampone per le cellule. Usa una nuova lama di rasoio per decapitare prima e poi macerare il pesce zebra usando la stessa lama di rasoio; Pipettare su e giù per rimuovere i grandi grumi di cellule.</li>
		<li>Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da 50 mL per dissociarle in una sospensione a cellula singola. Mantieni le celle sul ghiaccio.</li>
		<li>Per il controllo CT-FR, trasferire 250.000 cellule WT in una provetta da microcentrifuga e pellettare le celle mediante centrifugazione a 2.500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il terreno di coltura per pesci e aggiungere 500 μl di 0,9x PBS+ 1% FBS.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 μl della soluzione madre di colorante CT-FR da 1 mM per una concentrazione finale di 1 μM. Pipettare delicatamente con 1.000 μl di pipetta per miscelare. Incubare a 37 °C per 20 minuti, al riparo dalla luce.</li>
		<li>Rimuovere il liquido e lavare le celle con 500 μL di terreno di coltura per pesci per rimuovere il colorante in eccesso.</li>
		<li>Pellettare nuovamente le celle mediante centrifugazione, rimuovere il liquido e risospendere le celle in 500 μl di 0,9x PBS+ 1% FBS e passare attraverso un tappo filtrante da 35 μm in una provetta FACS. Mantenere il ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della placca donatrice NOTA: La piastra donatrice è una piastra con fondo a V a 96 pozzetti in cui verranno smistate le cellule T-ALL colorate con CT-FR del pesce zebra trapiantato. Ogni pozzetto della piastra contiene 5.000 cellule WT CG1 non colorate in 50 μL di terreno di coltura per pesci che fungono da vettore per aiutare a pellettare le cellule selezionate nelle fasi successive.<ol><li>Contare 500.000 cellule WT CG1 e trasferirle in una provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Diluire questo stock cellulare a 100 cellule/μL aggiungendo 5 mL di terreno di coltura per pesci.</li>
		<li>Erogare 50 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Miscelare il tubo madre della sospensione cellulare dopo ogni fila per mantenere l'omogeneità della sospensione cellulare. Conservare la piastra a 4 °C fino alla cernita.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei campioni di pesce trapiantati<ol><li>Selezionare i pesci trapiantati con un carico di T-ALL del 30-40%. Raccogliere i pesci trapiantati sia con le cellule colorate con CT-FR che con le cellule tumorali GFP non colorate.</li>
		<li>Raccogliere le celle come descritto nella Sezione 2. NOTA: Poiché si prevede che le cellule che trattengono il colorante siano presenti in bassa abbondanza, prepararsi a selezionare un gran numero di cellule dal campione di GFP CT-FR.</li>
		<li>Diluire in una concentrazione appropriata per la selezione di ~3-5 × 106 cellule/mL in 0,9x PBS + 1% FBS e passare attraverso un tappo filtrante da 35 μm in una provetta FACS. Aggiungere DAPI (1 mg/mL) alla diluizione 1:1.000 come colorante vitale per escludere le cellule morte. Mantenere il ghiaccio.</li>
		<li>Per le cellule tumorali GFP non colorate, trasferire 250.000 cellule in una provetta da microcentrifuga e pellettare a 2.500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il materiale di scorta per pesci, aggiungere 500 μl di PBS e passare attraverso un tappo del filtro da 35 μm in una provetta FACS. Mantenere il ghiaccio.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Smistamento
NOTA: Tenere tutte le provette e la piastra donatrice sul ghiaccio per tutto il tempo, tranne quando vengono utilizzate per lo smistamento.
<ol><li>Per l'ordinamento dei parametri e dei cancelli, iniziare applicando il gating di dispersione anteriore e laterale per identificare le celle di interesse in base alle loro dimensioni ed eliminare i detriti cellulari. Quindi, utilizzare l'altezza di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione in avanti per escludere le celle duplicate e mantenere solo i singoletti. Infine, utilizzare i controlli senza colore e monocolore per disegnare i quadranti per identificare le popolazioni cellulari GFP-positive e CT-FR-positive. NOTA: Il controllo CT-FR dovrebbe essere molto più luminoso dei campioni per lo smistamento poiché la colorazione per il controllo è stata eseguita a fresco senza divisioni cellulari; si prevede che le cellule dei campioni di CT-FR GFP appaiano all'estremità inferiore del gate CT-FR positivo.</li>
	<li>Ordinare il numero di cellule da trapiantare in ogni pesce in un pozzetto della piastra donatrice. NOTA: Per questo esperimento, abbiamo utilizzato un saggio di diluizione limitante per stimare la frequenza delle cellule staminali leucemiche in CT-FR High e CT-FR Low. Questo test ha utilizzato una dose di 25 cellule, trapiantate in 3 animali, e una dose di 10 cellule, trapiantate in 10 animali. Un tipico saggio di diluizione limitante utilizzando il T-ALL derivato da rag2:Myc di zebrafish coinvolgerebbe un gruppo con un numero maggiore di cellule (500 o 1.000) poiché la frequenza di LSC in questo modello è stimata in 1 LSC in centinaia di cellule. Tuttavia, in questo saggio, stiamo utilizzando uno dei cloni di T-ALL precedentemente descritti da Blackburn et al.15. La frequenza LSC nel campione utilizzato qui è ~1 LSC in decine di celle; Prevediamo che la leucemia venga rilevata negli animali trapiantati nel gruppo delle 25 cellule. Quando si ottimizza questo test per il modello di malattia, è necessario prestare attenzione durante la selezione del gruppo con un numero di cellule più elevato per garantire l'attecchimento del tumore.</li>
	<li>Dopo lo smistamento, conservare la piastra sul ghiaccio fino al momento del trapianto. NOTA: Le procedure di selezione possono essere stressanti e influire sulla vitalità cellulare. Prima di eseguire l'esperimento di diluizione limitante vero e proprio, è stato fatto un esperimento pilota di smistamento. Le cellule selezionate sono state trapiantate e lo sviluppo della leucemia è stato monitorato per determinare se lo smistamento fosse dannoso per la vitalità cellulare. In alternativa, la vitalità cellulare può essere valutata colorando le cellule selezionate con il blu di tripano ed esaminandole al microscopio prima del trapianto.</li>
</ol>7. Trapianto di cellule selezionate alla diluizione limitante e monitoraggio dell'insorgenza del tumore
<ol><li>Centrifugare la piastra utilizzando una grande centrifuga da banco a 2.500 × g a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere con cautela 45 μl di surnatante da ciascun pozzetto, lasciando 5 μl di liquido e facendo attenzione a non toccare il pellet di cella sul fondo del pozzetto.</li>
	<li>Risospendere le cellule con una pipetta da 20 μl. Risospendere 2-3 pozzetti con la pipetta e quindi, utilizzando la siringa da microlitro di Hamilton, iniettare le sospensioni cellulari da ciascun pozzetto nel numero desiderato di pesce zebra CG1 tramite trapianto IP. Quindi, risospendere le cellule nel gruppo successivo di pozzetti per evitare il riassestamento delle cellule.</li>
	<li>Esaminare il pesce zebra mediante microscopia a fluorescenza sotto sedazione una volta alla settimana per lo sviluppo di T-ALL per almeno 6 settimane.</li>
</ol>8. Determinazione della frequenza delle cellule staminali leucemiche
<ol><li>Registrare il numero di animali positivi per dose cellulare e gruppo di trattamento a 6 settimane dopo il trapianto, considerando positivi gli animali con qualsiasi quantità di segnale GFP. Si consideri che gli animali hanno un carico significativo di leucemia quando il segnale GFP occupa il &gt;50% del corpo.</li>
	<li>Utilizza il software statistico ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)19 basato sul web per calcolare la frequenza delle LSC all'interno di ciascuna popolazione cellulare. NOTA: Nella Figura 1 viene fornita un'illustrazione schematica del flusso di lavoro.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro per l'uso della colorazione di tracciamento cellulare per isolare le cellule quiescenti nel modello T-ALL del pesce zebra. Illustrazione schematica della colorazione delle cellule T-ALL di zebrafish con la colorazione di proliferazione cellulare, la propagazione in un zebrafish CG1 (pannello superiore) e l'ordinamento delle cellule in base alla ritenzione della colorazione di proliferazione cellulare (pannello centrale). Le cellule raccolte sono state utilizzate per un saggio di diluizione limitante per determinare la frequenza delle LSC (pannello inferiore). Abbreviazioni: T-ALL = leucemia linfoblastica acuta a cellule T; LSCs = cellule staminali leucemiche; CT-FR = CellTrace Lontano Rosso; FITC = isotiocianato di fluoresceina; PE = ficoeritrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Stima della frequenza di LSC nella T-ALL di pesce zebra utilizzando la selezione dei coloranti di proliferazione cellulare

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<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elda%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Elda: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li>
<li>Bhojwani, D., Pui, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed+childhood+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia.</a> Lancet Oncol. 14 (6), e205-e217 (2013).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).</li>
<li>Al-Hamaly, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+drug+screening+identifies+erlotinib+as+an+inhibitor+of+wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+and+self-renewal+in+t-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Zebrafish drug screening identifies erlotinib as an inhibitor of wnt/β-catenin signaling and self-renewal in t-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Biomed Pharmacother. 170, 116013(2024).</li>
<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+engrafted+human+cancer+and+therapy+responses+in+immunodeficient+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Micro-siringa 26 G/2"</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>NA</td></tr><tr><td>35 &; m tappo filtro tubi FACS</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>NA</td></tr><tr><td>40 &; filtro cellulare m</td><td>CELLTREAT</td><td>229482</td><td>NA</td></tr><tr><td>piastra PCR a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0800</td><td>NA</td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare</td><td>Sony Biotechnology</td><td>SY3200</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34564</td><td>NA</td></tr><tr><td>Provette coniche</td><td>VWR</td><td>10026-078</td><td>NA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>NA DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>NA</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)</td><td>Caisson Labs</td><td>22110001</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscopio stereo a epifluorescenza</td><td>Nikon</td><td>SMZ25</td><td>NA</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td>NA</td></tr><tr><td>Acqua del sistema dei pesci</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>0,03-0,05% di salinità, pH 6,5-8, tamponato con bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2171</td><td>NA</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Pentaire</td><td>TRS-1</td><td>tricaina mesilato, un anestetico</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Corning</td><td>07-202-011</td><td>NA</td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>American Line</td><td>66-0089</td><td>NA</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>T10282</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

identificazione di cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule t di pesce zebra mediante colorazione della proliferazione cellulare 

Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining

Abbiamo seguito il protocollo sopra descritto per selezionare le cellule che hanno trattenuto il colorante di proliferazione cellulare, CT-FR, e le abbiamo utilizzate per un saggio di diluizione limitante (LDA) per stimare la frequenza di LSC nelle popolazioni CT-FR High e CT-FR Low. Per impostare il gating per l'esperimento di citometria a flusso, abbiamo utilizzato un controllo senza fluoroforo (senza colore) oltre ai controlli a colore singolo (Figura 2A). Questi quadranti sono stati utilizzati per identificare le popolazioni FITC- e PE-positive e -negative per l'impostazione dei cancelli di smistamento. Il controllo positivo monocolore CT-FR è stato preparato lo stesso giorno dello smistamento colorando le cellule WT di un pesce zebra non trapiantato e, quindi, si prevede che l'intensità del segnale sia molto più alta del segnale proveniente dalle cellule propagate nel campione.
Nella T-ALL GPF colorata con CT-FR (Figura 2B), le cellule che apparivano nel quadrante superiore destro a una bassa frequenza dello 0,13% sono state considerate CT-FR High e in questo quadrante è stato posizionato un cancello di smistamento etichettato come "CT-FR high". Un altro cancello è stato creato nel quadrante in basso a destra per raccogliere le cellule leucemiche che sono CT-FR Low. Poiché le cellule CT-FR High esistevano in bassa abbondanza nel campione tumorale, un gran numero di cellule (~2,5 × 106) sono state selezionate per raccogliere il numero necessario di cellule per l'esperimento di diluizione limitante.
Dopo aver trapiantato il pesce zebra CG1 con le cellule selezionate per l'LDA, il pesce zebra è stato monitorato per 6 settimane. Le cellule del CT-FR High avevano una frequenza LSC quattro volte superiore rispetto alla popolazione cellulare CT-FR Low (p = 0,0134) (Figura 3A). Le immagini rappresentative degli animali a 28 giorni dal trapianto sono mostrate in (Figura 3B). Nel gruppo CT-FR High, a dosaggio di 10 cellule, 8 animali su 9 (89%) hanno sviluppato la leucemia, rispetto a 2 su 10 (20%) nel gruppo CT-FR Low (Figura 3A). Gli animali del gruppo CT-FR High avevano una latenza significativamente più breve alla leucemia (p = 0,0014) (Figura 3C). Infine, gli animali del CT-FR High hanno avuto una sopravvivenza globale significativamente più bassa (p = 0,0408) (Figura 3D); alla settimana 6, il 70% degli animali CT-FR Low era vivo rispetto a solo il 10% degli animali CT-FR High. Questi risultati dimostrano l'arricchimento di LSC auto-rinnovanti all'interno della popolazione cellulare quiescente a lenta divisione nel modello T-ALL di zebrafish guidato da rag2:Myc e l'utilizzo del colorante di proliferazione cellulare per isolare questa popolazione.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig02.jpg"> Figura 2: Smistamento cellulare mediante citometria a flusso. (A) Per creare i cancelli per lo smistamento delle cellule colorate con CT-FR e delle cellule T-ALL marcate con GFP, sono stati utilizzati grafici FACS da cellule WT appena colorate con CT-FR. Cellule GFP+ T-ALL. (B) Esempio rappresentativo delle cellule GFP+ T-ALL propagate colorate con CT-FR. Le cellule del quadrante superiore destro sono state considerate CT-FR High e le cellule del quadrante inferiore destro sono state considerate CT-FR Low. Abbreviazioni: T-ALL = leucemia linfoblastica acuta a cellule T; CT-FR = CellTrace Lontano Rosso; GFP = proteina fluorescente verde; FITC = isotiocianato di fluoresceina; PE = ficoeritrina; FACS = smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza; WT = tipo selvaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig03.jpg"> Figura 3: Frequenza significativamente più elevata di LSC in cellule con elevata ritenzione della colorazione di proliferazione cellulare. (A) Dati del test di diluizione limitante che indicano il numero di animali positivi alla leucemia dopo il trapianto con due dosi crescenti di cellule (10 e 25 cellule). Vengono indicati la frequenza LSC calcolata e l'intervallo di confidenza al 95% (p = 0,0134). (B) immagini rappresentative di animali dopo 28 giorni dal trapianto; barra della scala = 10 mm. (C) La latenza alla leucemia significativa è considerata come il tempo necessario affinché il &gt;50% dell'animale diventi GFP-positivo, rappresentando un carico significativo di leucemia. (D) Curva di sopravvivenza dell'animale trapiantato con 10 cellule. Abbreviazioni: LSCs = cellule staminali leucemiche; CT-FR = CellTrace Lontano Rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Identificazione di cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di pesce zebra mediante colorazione della proliferazione cellulare 

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect ...

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Limitare i test di diluizione trapianto di cellule vengono utilizzati per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di zebrafish singenici che sviluppano leucemia fluorescenza-etichettati e dettagli su come isolare e trapianto di queste cellule di leucemia a limitare la diluizione nella cavità peritoneale di zebrafish adulti.

Quantificare la frequenza di tumori di moltiplicazione celle usando Limitare trapianto di cellule Diluizione in Singenico Zebrafish

Questo protocollo descrive la tecnica di isolamento delle cellule tumorali della leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) marcate con fluorescenza da un pesce zebra adulto e di quantificazione utilizzando il colorante blu di tripano.

Isolamento delle cellule T-ALL marcate in fluorescenza: un metodo per isolare le cellule T-ALL da zebrafish adulti

Il seguente protocollo descrive un metodo per isolare la popolazione laterale di cellule tumorali della leucemia linfoblastica acuta (T-ALL), costituita da cellule staminali, da un pesce zebra adulto. La popolazione laterale manca di marcatori cellulari prominenti e quindi utilizziamo il saggio di efflusso colorante Hoechst 33342 per isolarli.

Saggio della popolazione laterale: un metodo per isolare la popolazione laterale di cellule tumorali dal pesce zebra

Qui, descriviamo una tecnica per isolare le cellule popolazione lato da un modello zebrafish di cellule T myc indotta da leucemia linfoblastica acuta (T-ALL). Questo saggio popolazione lato è altamente sensibile ed è descritta per zebrafish T-ALL, ma può essere applicabile ad altri tipi di cellule zebrafish maligne e non maligne.

Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish

Zebrafish transgenici lck:eGFP esprimono GFP altamente nei linfociti T e sono stati usati per studiare lo sviluppo delle cellule T e la leucemia linfoblastica acuta. Questa linea può essere utilizzato per Studio B cellule, che esprimono lck a livelli inferiori. Questo protocollo descrive la purificazione delle cellule di B maligne e benigne da lck:eGFP zebrafish.

Isolando il maligno e le cellule di B Non-maligna da lck:eGFP Zebrafish

Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione e la risoluzione dei problemi di xenotrapianti di leucemia linfoblastica acuta umana (ALL) da linee cellulari e materiale fresco del paziente in embrioni di zebrafish transitoriamente immunosoppressi, insieme a linee guida per la valutazione della risposta ai farmaci mediante citometria a flusso. La pipeline sperimentale può essere adattata anche per i tumori solidi.

Previsione rapida della risposta ai farmaci in vivo utilizzando innesti di cellule leucemiche in embrioni di zebrafish

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Scopri come identificare cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di Danio rerio mediante colorazione della proliferazione cellulare. Questo metodo consente di isolare cellule dormienti per screening di farmaci in vivo e analisi trascrittomica.

Identificazione di cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di pesce zebra mediante colorazione della proliferazione cellulare (Video) | JoVE Journal

Identificazione di cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di pesce zebra mediante colorazione della proliferazione cellulare

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