Name: Migliorare i risultati degli studenti con unesperienza di ricerca universitaria basata su corsi di clonazione molecolare adattabile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Scopri come l'assemblaggio Gibson migliora l'apprendimento della clonazione molecolare in un corso di ricerca universitaria pratico. Gli studenti sviluppano competenze pratiche essenziali per la biotecnologia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Implementazione dell'assemblaggio Gibson per migliorare l'istruzione e le competenze in biologia molecolare

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

La formazione degli studenti universitari nei concetti fondamentali della biologia molecolare e nelle tecniche di laboratorio è fondamentale per il loro sviluppo scientifico e professionale poiché queste metodologie sono comuni in vari contesti di ricerca, tra cui il mondo accademico e l'industria. Pertanto, gli studenti di biologia (concentrazione di biologia molecolare e cellulare) e biochimica presso la California Polytechnic State University, San Luis Obispo (Cal Poly) sono tenuti a seguire un corso di laboratorio di biologia molecolare di divisione superiore per apprendere e applicare questi argomenti (CHEM / BIO 475). Un curriculum di base per questo corso è stato precedentemente sviluppato in cui gli studenti eseguono il clonaggio a base di topoisomerasi (TOPO) per assemblare un plasmide contenente actina preparato da un modello di DNA complementare di lievito (cDNA)1. Gli studenti progettano esperimenti basati su domande che imitano ipotesi di ricerca autentiche, aumentando la loro familiarità con le pratiche di laboratorio e l'apprendimento basato sull'indagine. Il continuo progresso nel campo della biologia molecolare richiede che i curricula corrispondenti si adattino per preparare gli studenti con competenze moderne per la forza lavoro. In particolare, l'uso dell'Assemblea di Gibson è diventato più predominante nella comunità scientifica; mentre il metodo è stato originariamente stabilito per sintetizzare cromosomi artificiali2, oltre 5.000 pubblicazioni al momento di questo rapporto hanno fatto riferimento al lavoro originale di Gibson et al. Gibson Assembly è unico rispetto alle metodologie di clonazione tradizionali: è altamente personalizzabile e può facilmente legare più frammenti di DNA lineare senza la necessità di siti di restrizione per produrre le giunzioni. Pertanto, abbiamo visto l'opportunità di rinnovare il curriculum CHEM/BIO 475 per incorporare le moderne tecniche di clonazione molecolare e migliorare il modello di corso basato sull'indagine.
È stato stabilito che le esperienze di ricerca degli studenti contribuiscono ad aumentare la comprensione concettuale, lo sviluppo delle competenze e la persistenza nella scienza3, ma non tutti gli studenti universitari hanno l'opportunità di partecipare direttamente a un laboratorio di ricerca. Per affrontare la sfida della limitata capacità degli studenti nei laboratori di ricerca, sono state sviluppate e impiegate esperienze di ricerca universitaria basate su corsi (CURE) per aumentare l'accessibilità della scienza attraverso una ricerca autentica in classe. Sebbene le CURE varino nella loro attuazione, sono state stabilite pratiche comuni che affrontano i cinque principi della ricerca scientifica. In un CURE ben progettato, gli studenti 1) utilizzeranno pratiche scientifiche, 2) collaboreranno a un progetto di ricerca, 3) tenteranno di fare nuove scoperte, 4) contribuiranno a un lavoro rilevante al di fuori della classe e 5) rivaluteranno e rivedranno ipotesi e metodi in caso di fallimento sperimentale4. Analogamente alle tradizionali esperienze di ricerca degli studenti in laboratorio, è stato dimostrato che le CURE rafforzano la fiducia degli studenti nella scienza, nelle competenze scientifiche, nella proprietà del progetto e nella persistenza in scienza, tecnologia, ingegneria e matematica (STEM)5. Mentre le CURE che coinvolgono il clonaggio molecolare sono state riportate in precedenza 6,7,8,9,10,11,12,13, non siamo a conoscenza di alcuna che enfatizzi l'adattabilità di Gibson Assembly per creare una libreria di autentica ricerca plasmidi.
Qui, riportiamo un'espansione dell'attuale curriculum CHEM/BIO 475 basato sull'indagine presso la California Polytechnic State University, San Luis Obispo con due importanti miglioramenti: l'esperienza pratica con Gibson Assembly e la partecipazione degli studenti a un CURE, che ha fornito costrutti plasmidi originali per progetti di ricerca finanziati dalla National Science Foundation (NSF-1708919 e NSF-2300890). Nel corso di tre implementazioni di questo curriculum, gli studenti hanno contribuito a due distinti progetti di ricerca incentrati sulla biosintesi di prodotti naturali di molecole bioattive prodotte da Actinomycetota. I prodotti naturali contengono spesso farmacofori con attività antibiotiche, antimicotiche e/o antitumorali, conferendo a queste piccole molecole importanza negli sforzi di scoperta di farmaci e potenziale di rilevanza clinica14. Questa ricerca richiede la creazione di librerie di plasmidi per consentire lo studio della funzione e del potenziale ingegneristico degli enzimi biosintetici batterici. In questo CURE, gli studenti hanno progettato ed eseguito esperimenti di Gibson Assembly per clonare le librerie di plasmidi uniche pertinenti a questi progetti di ricerca (Figura 1). Inoltre, il formato e il design del modulo si distinguono perché è facilmente adattabile per generare qualsiasi plasmide di interesse per altri progetti di ricerca.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Panoramica del ruolo di Gibson Assembly nel nostro laboratorio di ricerca. Gli actinomycetota producono prodotti naturali a piccole molecole con bioattività clinicamente rilevanti utilizzando cluster genici che codificano enzimi biosintetici. Nella nostra ricerca, i plasmidi contenenti un gene biosintetico vengono assemblati tramite Gibson Assembly per indagini a valle sulla funzione dell'enzima codificato. Icone scientifiche da Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Panoramica del laboratorio
Il laboratorio di biologia molecolare è un corso di divisione superiore richiesto per le major di biochimica e biologia con una concentrazione di biologia molecolare e cellulare. Altri studenti che soddisfano i prerequisiti sono invitati a seguire il corso come elettivo di divisione superiore. Il corso è co-elencato tra il Dipartimento di Chimica e Biochimica e il Dipartimento di Biologia di Cal Poly. I docenti di entrambi i dipartimenti si alternano nell'insegnamento del corso ogni trimestre (due trimestri di Biologia, un quarto di Chimica e Biochimica).
La classe si riunisce in laboratorio due volte alla settimana per periodi di 170 minuti e una volta alla settimana per una lezione di 50 minuti. Le sezioni di laboratorio contengono un massimo di 16 studenti e ogni trimestre vengono offerte 2-3 sezioni di laboratorio. Il corso dura 10 settimane e l'esame finale viene somministrato durante l'ultimo incontro della settimana 10. Il tempo della lezione è dedicato alla discussione della teoria alla base di molte delle tecniche sperimentali condotte in laboratorio, nonché di argomenti attuali in biologia molecolare che non sono trattati in laboratorio. Il curriculum di base del laboratorio comprende il processo di clonazione del gene dell'actina dal lievito1, che richiede circa 7 settimane (13-14 incontri di laboratorio). Le tecniche includono il micropipettaggio, l'isolamento dell'RNA del lievito, l'amplificazione di un gene del lievito mediante la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR), il clonaggio topografico, lo screening blu-bianco, l'isolamento del plasmide e la verifica dell'inserto mediante restriction digest e PCR, l'analisi in silico dei cloni e l'analisi della sequenza del DNA. Il curriculum per le ultime 3 settimane del corso è a discrezione dell'istruttore ma prevede che gli studenti completino un "progetto indipendente" con risultati indefiniti.
Panoramica dell'esperimento
Uno degli obiettivi del nostro gruppo di ricerca sono le vie biosintetiche in Actinomycetota. Durante la progettazione del progetto indipendente, abbiamo immaginato che gli studenti creassero plasmidi attraverso Gibson Assembly da utilizzare nei nostri progetti di ricerca che studiano la biosintesi di prodotti naturali. Mentre le iterazioni del modulo del corso qui valutate erano specifiche per i plasmidi che consentono la manipolazione di percorsi biosintetici, il flusso di lavoro di Gibson Assembly è enormemente adattabile per altri progetti di clonaggio molecolare (Figura 2). Il flusso di lavoro è stato suddiviso in tre diversi esperimenti (A, B e C) che sono stati completati in due periodi di lezione e sei periodi di laboratorio (3 settimane in totale) (vedi File supplementare 1 e File supplementare 2). Gli esperimenti sono stati preceduti da fogli di lavoro per supportare la preparazione degli studenti e valutare la comprensione degli studenti (File supplementare 3, File supplementare 4 e File supplementare 5). Il flusso di lavoro viene presentato in un formato flessibile in base alle esigenze e agli interessi dell'insegnante.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Flusso di lavoro del modulo Gibson Assembly. Il Giorno 1 e il Giorno 4 sono periodi di lezione in cui gli studenti completano l'analisi di sequenze in silico e la progettazione sperimentale. I giorni 2-3 e 5-8 sono riunioni di laboratorio in cui vengono condotte le fasi per clonare nuovi plasmidi tramite Gibson Assembly, seguite dall'isolamento e dallo screening. Il diagramma di flusso pittorico è raggruppato in base ai tre esperimenti eseguiti dagli studenti (A, B e C). Istruzioni e protocolli più dettagliati sono disponibili nei manuali dell'istruttore e dello studente forniti rispettivamente come File supplementare 1 e File supplementare 2 . Icone scientifiche da Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il modulo di progetto indipendente Gibson Assembly è stato testato per la prima volta nel trimestre primaverile del 2019 in CHEM/BIO 475. Nel 2020 e nel 2021, il corso è stato tenuto online a causa della pandemia di SARS-CoV-2. Quando l'istruzione in presenza è ripresa nella primavera del 2022 e del 2023, gli studenti del corso sono stati invitati a partecipare a uno studio che valutava i risultati dell'apprendimento di un progetto indipendente Gibson Assembly in cui sarebbero stati clonati plasmidi originali e rilevanti per la ricerca. Nel 2019, gli studenti hanno creato una libreria di plasmidi costituita da cassette geniche del genoma di Micromonospora echinospora ATCC 15837 che sono state clonate in pKC1132 (Figura 3). Questa libreria di plasmidi viene utilizzata nel nostro laboratorio di ricerca per inattivare geni di interesse in un presunto cluster di geni biosintetici per il prodotto naturale TLN-0522015. Per completare i nostri studi sull'inattivazione genica, nel 2022 gli studenti hanno clonato una piccola libreria di geni dal presunto cluster genico TLN-05220 in pUC19 (figura3); Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato questi plasmidi per il subclonaggio di geni in vettori di espressione, tra cui pET28b, per la sovraespressione e la purificazione delle proteine. Gli studenti della coorte 2023 hanno contribuito al lavoro in corso su un progetto di ingegneria biosintetica sull'epoxomicina sintetasi16. In team di 3-4 persone, gli studenti hanno clonato domini ingegnerizzati di moduli di peptide sintetasi17 non ribosomiale in vari vettori di espressione proteica per ottimizzare la sovraespressione e la purificazione di questi enzimi nel nostro laboratorio di ricerca (Figura 3). La ridondanza è stata integrata nel piano di clonazione per ciascuna coorte. Ad esempio, la coorte del 2019 conteneva 44 studenti e 15 plasmidi sono stati assegnati alla classe per la clonazione. Così, la clonazione di ciascun plasmide è stata tentata due o tre volte.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Riepilogo dei plasmidi clonati e degli studenti partecipanti durante le iterazioni di progetti indipendenti del 2019, 2022 e 2023. Il progetto Gibson Assembly è stato implementato tre volte. In ogni offerta, gli studenti partecipanti hanno clonato una diversa libreria di plasmidi da utilizzare in progetti di ricerca che esplorano percorsi biosintetici. I progetti del 2019 e del 2022 hanno sostenuto il nostro lavoro in corso sul prodotto naturale TLN-0522015 con due reazioni di assemblaggio Gibson in frammenti (una cassetta genica o un gene e un vettore). Il progetto del 2023 prevedeva lo scambio di domini all'interno dei moduli 1 e 2 di un enzima peptide sintetasi non ribosomiale (NRPS) coinvolto nella biosintesi dell'epoxomicina16. I frammenti tratteggiati rappresentano due diversi mutanti del dominio scambiato, mentre i colori solidi rappresentano i domini che non sono stati scambiati. In totale, sono stati generati otto diversi frammenti genici (quattro per il modulo 1 e quattro per il modulo 2) con sporgenze compatibili per il Gibson Assembly. Per ogni modulo, sono state assemblate due diverse combinazioni di tre frammenti genici con uno dei due diversi vettori (pBAD33 e pET28, quattro frammenti totali per assemblaggio), per generare otto plasmidi NRPS ingegnerizzati. Icone scientifiche da Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Panoramica della valutazione
Almeno 1 settimana prima dell'inizio del progetto indipendente Gibson Assembly, gli studenti delle coorti 2022 e 2023 sono stati invitati a partecipare a un'indagine sui risultati dell'apprendimento, progettata in modo simile a uno studio condotto in un corso di laboratorio di biochimica presso Cal Poly18. Gli studenti partecipanti hanno completato un pre-questionario a scelta multipla durante la riunione di laboratorio prima dell'inizio del progetto indipendente e un post-questionario a scelta multipla durante la riunione finale di laboratorio (cioè dopo aver completato il modulo Gibson Assembly). I questionari pre e post consistevano in 28 domande identiche con due domande aggiuntive nel post-questionario (30 in totale). Sono state scritte dieci domande di contenuto per valutare la conoscenza degli studenti degli enzimi e dei meccanismi coinvolti nel clonaggio molecolare (ad esempio, reazione a catena della polimerasi [PCR], assemblaggio di Gibson, trasformazione, screening blu-bianco). Le sette domande seguenti hanno chiesto agli studenti di autovalutare la loro familiarità con i termini di clonazione molecolare (ad esempio, DNA polimerasi, esonucleasi, ligasi). Le successive 10 domande hanno permesso agli studenti di autovalutare la loro capacità di eseguire tecniche di clonaggio molecolare (ad esempio, analisi della sequenza del DNA, reazioni di digestione di restrizione, elettroforesi su gel di agarosio). Gli studenti hanno anche riferito se si sentirebbero a proprio agio nel perseguire una carriera in biologia molecolare basata sulla loro conoscenza delle tecniche di clonazione molecolare. Due domande aggiuntive sono state incluse nel post-questionario per consentire agli studenti di autovalutare il loro impegno nell'apprendimento durante il corso e se il corso è stato un'esperienza di apprendimento preziosa (Supplemental File 6 e Supplemental File 7). Tutti i dati delle risposte al questionario pre e post questionario degli studenti del 2022 e del 2023 sono stati combinati per l'analisi e sono disponibili nella Tabella supplementare S1.

<table><tbody><tr><td>Desossiribonucleotide trifosfato (dNTP, 10&nbsp; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>Homemade' MasterMix componente</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Fisher Scientific FERR0861</td><td></td><td>Homemade' MasterMix componente</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 unità</td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Incubatore microbiologico</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Isotemp Bagno d'acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>NC9594719</td><td>10.000X</td></tr><tr><td>GeneJET Gel Estrazione e pulizia del DNA Micro Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Scala del DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM0314</td><td>100 applicazioni</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Componente MasterMix fatto in casa</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus X2 Termociclatore a gradiente</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 16 Centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Micromonospora echinospora batteri</td> Tipo <td>americano Collezione di colture</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>General Electric</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>Bioreagenti</td> Fisher di<td>agarosio per biologia molecolare</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Spettrofotometro per microvolumi Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0,05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 reazioni</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 40 Agitatore orbitale da banco</td><td>New Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP248450</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Componente MasterMix fatto in casa</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Componente MasterMix fatto in casa</td></tr><tr><td>Bilancia portatile</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 vettore</td><td>New England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ad alta fedeltà 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 reazioni</td></tr><tr><td>T5 Esonucleasi</td><td>Epicentro</td><td>T5E4111K</td><td>Fatto in casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Fatto in casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Fatto in casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Caricamento colorante (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Homemade' MasterMix componente</td></tr></tbody></table>

migliorare i risultati degli studenti con un'esperienza di ricerca universitaria basata su corsi di clonazione molecolare adattabile

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Migliorare i risultati degli studenti con un'esperienza di ricerca universitaria basata su corsi di clonazione molecolare adattabile

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

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