Name: CIRCLE-Seq per linterrogazione dellediting genetico off-target (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri il protocollo CIRCLE-seq per identificare siti di taglio off-target in CRISPR-Cas9. Questo metodo bioinformatico analizza il DNA genomico con next-generation sequencing e Python per garantire la sicurezza delle terapie geniche con iPSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Rilevamento di eventi di scissione CRISPR-Cas9 fuori bersaglio con CIRCLE-Seq

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia.</a> N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+treatment+inserted+directly+into+the+body+for+first+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR treatment inserted directly into the body for first time.</a> Nature. 579 (7798), 185(2020).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
<li>Hong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+base+editing+and+prime+editing+of+COL7A1+mutations+in+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+prime+editing+via+xrRNA+motif-joined+pegRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA.</a> Nat Commun. 13 (1), 1856(2022).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+editing+with+genuine+Cas9+nickases+minimizes+unwanted+indels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels.</a> Nat Commun. 14 (1), 1786(2023).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Has, C., Kiritsi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+inherited+skin+fragility+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Therapies for inherited skin fragility disorders.</a> Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).</li>
<li>Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+events+during+integration+of+transfected+DNA+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells.</a> Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).</li>
<li>Hsieh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndrome+unrelated+to+lentiviral+vector+in+a+patient+treated+with+gene+therapy+for+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease.</a> Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Lensing, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSBCapture%3A+In+situ+capture+and+sequencing+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks.</a> Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).</li>
<li>Crosetto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-resolution+DNA+double-strand+break+mapping+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.</a> Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).</li>
<li>Yan, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS+is+a+versatile+and+quantitative+method+for+genome-wide+profiling+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks.</a> Nat Commun. 8, 15058(2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digenome-seq%3A+Genome-wide+profiling+of+CRISPR-Cas9+off-target+effects+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.</a> Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).</li>
<li>Cameron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+genomic+landscape+of+CRISPR-Cas9+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.</a> Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).</li>
<li>Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+detection+with+DISCOVER-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157(2023).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Lazzarotto, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+CRISPR-Cas9+genome-wide+nuclease+activities+with+CIRCLE-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq.</a> Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).</li>
<li>Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+with+the+constitutive+EGFP+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter.</a> Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).</li>
<li>Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+viral+delivery+of+Cas9+into+human+safe+harbor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor.</a> Sci Rep. 10 (1), 21474(2020).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nat Commun. 9 (1), 745(2018).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+The+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
<li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).</li>
<li>Cromer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+CRISPR+off-target+discovery+tools+following+ex+vivo+editing+of+CD34%28%2B%29+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provette a parete sottile da 0,2 mL e tappi piatti ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>AB1114</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta PippinHT da 1,5%</td><td>Sage Science</td><td>HTC1510</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 mL</td><td>FisherScientific</td><td>12567603</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale da 150 x 25 mm.</td><td>FisherScientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio reagente da 25 mL&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>2138127C</td><td></td></tr><tr><td>2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette sierologiche</td><td>FisherScientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>FisherScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>50x tampone per elettroforesi TAE&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Agencourt AMPure XP, 60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5400002</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer QX1</td><td>Qiagen</td><td>20912</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 nucleasi, Streptococcus Pyogenes&nbsp; </td><td>New England BioLabs</td><td>M0386M</td><td></td></tr><tr><td>CIRCLE-seq Preparazione della libreria e NGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice qualificata ESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrice extracellulare (ECM) per la coltura di iPSC</td></tr><tr><td>ddPCR SuperMix per sonde&nbsp;</td>Supporto per cartuccia <td>Bio-Rad</td><td>1863010</td><td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Cartucce Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Guarnizioni Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher Scientific 14190144</td><td></td><td>realizzato con Invitrogen</td></tr><tr><td>Droplet Generation Oil per sonde&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Olio per lettore di gocce&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 m), pH 8,0, senza RNasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>prodotto da Invitrogen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; ThermoMixer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchiature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico, Esonucleasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td>pura</tr><tr><td></td><td>New England BioLabs</td><td>M0293L</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Unità filtrante&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette sterili filtrati a</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrasuoni focalizzati&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>ME220</td><td></td></tr><tr>Isolamento <td></td><td></td><td></td><td>del DNA genomico</td></tr><tr><td>Taglio</td><td></td><td></td><td></td>del DNA</tr><tr><td>Gentra Puregene Kit centrale per cellule</td><td>Qiagen</td><td>158043</td><td></td></tr><tr><td>gRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS Tri-gas Incubatore per colture tissutali umidificate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030411</td><td>Necessità di coltura ed espansione di iPSC (37 &deg; C/5% CO2/5% O2)</td></tr><tr><td>ScreenTape D1000 DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti D1000 ad alta sensibilità</td> Kit di preparazione della libreria HTP <td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8235</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Soluzione antibiotica antimicotica</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>IDTE pH 8.0 (1x soluzione TE)</td><td>Tecnologie del DNA integrate</td><td>11050204</td><td></td></tr><tr><td>microscopio</td><td></td><td></td> invertito <td>Necessità di imaging di colonie iPS in canali a campo chiaro e fluorescenti</td></tr><tr><td>Coltura</td><td></td><td></td><td></td>iPSC</tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Esonucleasi Lambda&nbsp;</td>Punte di caricamento <td>New England BioLabs</td><td>M0262L</td><td></td></tr>, <tr><td>confezione da 10</td><td>Agilent</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Magnum FLX Enhanced Universal Magnet Plate&nbsp;</td><td>Alpaqua</td><td>A00400</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Axygen</td><td>31104051</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta AFA Fibra Pre-fessura Snap-Cap&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 5x Supplemento</td><td>StemCell Technology</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 Terreno basale (400 mL)</td><td>StemCell Technology</td><td>85851</td><td>Terreno per il mantenimento di iPSC in coltura</td></tr><tr><td>Spettrofotometro Nanodrop 8000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>NEBSuoveri Multiplex Oligo per Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td> Dual <td>Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>tappi per strisce ottiche, 8 strisce</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr> strisce <tr><td>ottiche, 8 strisce</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>altri reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigillante per piastre PCR&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>Numero di modello PX1</td></tr><tr><td>PEG/NaCl SPRI Solution&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0536L</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione a caldo in lamina perforabile&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DNasi ATP-dipendente sicura per i plasmidi&nbsp;</td><td>Le</td> sequenze IDT <td></td> di Epicentre E3110K <td></td></tr> sono <tr><td></td><td></td><td>elencate nella Tabella 1</td>Proteinasi K&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAxcel Sistema di analisi su gel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Provette per saggi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kit per saggi Qubit dsDNA BR&nbsp;</td>Kit di analisi <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR</td>Kit di analisi <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Fluorimetro Qubit ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Sistema PCR digitale a gocce</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td>Contiene un generatore di gocce QX200 e un lettore di gocce QX200</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Piastra PCR semi-gonnata&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific 14230244</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SeqPlaque GTG Agarosio</td><td>Lonza</td><td>50110</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Colorazione sicura del gel del DNA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Palloni</td><td>FisherScientific</td><td>7202000</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore con funzionalità di misurazione della temperatura programmabile</td><td>Bio-Rad C1000 Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec PCR Plate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E951020346</td><td>96 pozzetti, semi-bordato, verde</td></tr><tr><td>UltraPure DNasi/RNasi-Free Acqua distillata&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UTENTE Enzima&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M5505L</td><td></td></tr></tbody></table>

circle-seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Qui, CIRCLE-seq viene utilizzato per studiare i siti di scissione indotti dalla nucleasi di Cas9 in un complesso con il gRNA progettato per colpire il sito di integrazione del virus adeno-associato 1 (AAVS1) utilizzando DNA isolato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Questo gRNA è stato precedentemente descritto nella nostra pubblicazione27. Circa 25 μg di gDNA sono stati isolati da iPSC, tranciati mediante ultrasuoni focalizzati e la dimensione selezionata utilizzando la purificazione a microsfere AMPure XP per produrre frammenti di circa 300 bps. Da questi 25 μg di DNA, circa 2-5 ng di DNA sono stati circolarizzati con successo per la scissione in vitro di Cas9:gRNA. L'intera procedura è illustrata nella Figura 1.
A seguito di una procedura CIRCLE-seq e di un'analisi utilizzando il nostro flusso di lavoro di calcolo, nella Figura 2A viene presentata una visualizzazione di tutti i siti di scissione rilevati sul bersaglio e fuori bersaglio. La pipeline CIRCLE-seq ha anche fornito "letture unite", analizzate tramite il software statistico R per produrre un grafico di Manhattan che mostra i siti di scissione indotti dalla nucleasi rilevati mappati lungo ciascun cromosoma (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig01.jpg"> 
Figura 1: Schemi del flusso di lavoro CIRCLE-seq. Sono indicati i passaggi principali del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig02.jpg"> 
Figura 2: Visualizzazione CIRCLE-seq e Manhattan Plot. (A) Allineamento dei siti fuori bersaglio rispetto al bersaglio previsto per il locus AAVS1. La sequenza di destinazione viene visualizzata nella parte superiore, dove gli obiettivi non target vengono classificati in base al numero di letture in ordine decrescente. Le differenze nelle sequenze target originali sono mostrate da nucleotidi colorati. Viene mostrato un esempio dei principali siti di scissione non intenzionali per il locus AAVS1. (B) Grafico di Manhattan che illustra i siti di scissione non intenzionali rilevati per il locus AAVS1. Le altezze delle barre rappresentano il conteggio delle letture per ogni posizione cromosomica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Abbecedario</td>
			<td>Sequenza (5'-3')</td>
			<td>Commenti/Descrizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Singolo RNA guida (sgRNA)</td>
			<td>GGGGCCACUAGGGACAGGAU</td>
			<td>per il knock-in della proteina fluorescente di AAVS1 Locus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Primer in avanti</td>
			<td>GCTCTGGGCGGAGGAATATG</td>
			<td>Per il test di scissione in vitro del gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Primer inverso</td>
			<td>ATTCCCAGGGCCGGTTAATG</td>
			<td>Per il test di scissione in vitro del gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1288</td>
			<td>/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT</td>
			<td>Adattatore per forcina CIRCLE-seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1274</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAG</td>
			<td>TruSeq F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1275</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT</td>
			<td>TruSeqF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1310</td>
			<td>/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/</td>
			<td>Sonda TruSeq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1311</td>
			<td>/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/</td>
			<td>Sonda TruSeq</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Sequenze di gRNA e primer utilizzati per l'analisi CIRCLE-seq del locus AAVS1 .

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

circle-seq-for-interrogation-of-off-target-gene-editing

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Gli strumenti di editing del genoma come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) hanno notevolmente migliorato l'efficienza del targeting genico nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter hiPSC specifici per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas.

Generazione efficiente di reporter knockin specifici per il lignaggio neurale hiPSC utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e Cas9 Double Nickase

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di un gene basate su CRISPR/Cas9 modifica del sistema per la riparazione delle mutazioni puntiformi in cellule di mammifero. Qui, usiamo un approccio combinatorio di gene editing con una dettagliata strategia sperimentale proseguimento per misurare indel formazione nel sito di destinazione — in sostanza, l'analisi in loco mutagenesi.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Genica mirata di editing con CRISPR/Cas9 ha notevolmente facilitato la comprensione delle funzioni biologiche dei geni. Qui, utilizziamo la metodologia CRISPR/Cas9 a modello calreticulina mutazioni in cellule ematopoietiche citochina-dipendente al fine di studiare la loro attività oncogena.

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Questo protocollo illustra i passaggi necessari per generare un sistema di modello in cui la trascrizione di un gene endogeno di interesse può essere controllata in modo condizionale in animali vivi o celle utilizzando avanzata lac repressore e/o sistemi di attivatore di tet .

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

Qui, presentiamo un protocollo che integra la tecnologia CRISPR/Cas9 con il saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per identificare i geni candidati che sono cruciali per l'anomala capacità proliferativa delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici.

Valutazione dei geni correlati alla crescita anormale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche combinando la tecnologia CRISPR/Cas9 con il conteggio delle cellule

L'efficienza del metodo I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) è paragonabile alla microiniezione tradizionale, che richiede la raccolta di zigoti da femmine donatrici e il trasferimento a femmine pseudo-gravide. Questo protocollo dimostra la sua efficacia introducendo mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel locus ROSA26 sul cromosoma 6.

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

Scopri il protocollo CIRCLE-seq per identificare siti di taglio off-target in CRISPR-Cas9. Questo metodo bioinformatico analizza il DNA genomico con next-generation sequencing e Python per garantire la sicurezza delle terapie geniche con iPSC.

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

Esplora altri video