Name: Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri il saggio di ligando di prossimità per localizzare le interazioni proteiche nei siti di danno al DNA utilizzando la linea cellulare U2OS. Questo metodo combina PLA con la marcatura Gamma-H2AX per studiare la risposta al danno genetico.

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<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione dell'interazione e della localizzazione delle proteine nel danno al DNA

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
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<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Piastre nere a 384 pozzetti</td><td>Perkin Elmer Piastre</td><td></td><td></td>portanti per celle</tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link Donkey anti Mouse Minus</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Diluente anticorpale Duolink</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante Duolink 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di rilevamento Duolink Far red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti goat plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti rabbit plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti Nek4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-5517</td><td>goat anti Nek4 è stato utilizzato a diluizione 1:50</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0.6 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Microscopio Leica DMI</td> Mouse <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>mouse anti Ku70 è stato utilizzato a diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti TOPII&beta;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Coniglio anti Nek5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Coniglio anti Y H2AX</td><td>Cell Signalling</td><td>9718S</td><td>1:100 diluizione</td></tr><tr><td>U2OS linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al dna

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

Abbiamo osservato l'interazione Nek4-Ku70 in assenza di trattamento con etoposide. Tuttavia, questa interazione può avvenire al di fuori del nucleo (Figura 1A). L'interazione Nek4-Ku70 aumenta dopo il danno al DNA e si concentra nel nucleo (Figura 1A). Nel caso dell'interazione Nek5-Topoisomerasi II β (TOPIIβ), utilizzata in questo test come controllo positivo sulla base dei risultati della letteratura18, l'interazione è notevolmente aumentata dal trattamento con etoposide (Figura 1B).
Il trattamento con etoposide promuove un incremento di quasi il 40% (una media di 9 punti/nucleo nelle cellule trattate con veicolo rispetto a 12-14 punti/nucleo nelle cellule trattate con etoposide). L'interazione di Nek4 e Ku70 non esclude le condizioni di danno al DNA. Infatti, Nguyen et al.12 hanno dimostrato che queste proteine possono interagire in assenza dell'insulto cellulare e non dipendono dal DNA, il che significa che l'interazione non è sempre nei siti di danno al DNA.
La colorazione γ-H2AX è assente in condizioni di controllo, ma aumenta dopo 20 minuti di trattamento con etoposide e si mantiene fino a 3 ore di trattamento (Figura 1C). Alcuni dei punti di interazione sono vicini alla colorazione γ-H2AX (Figura 1C). Dopo 1 ora di trattamento, la maggior parte dei punti di interazione Nek4-Ku70 sono concentrati nei focolai di danno al DNA (Figura 1C).
Il knockdown per Nek4 è di circa il 70% (dati non presentati), il che significa che il segnale non verrà completamente eliminato. Riteniamo che la differenza nel numero di punti/nuclei non sia equivalente alla deplezione della proteina perché la proteina reminiscente sarà dedicata alla risposta al danno del DNA e quindi interagirà con Ku70. La media dei punti/nucleo trovati nelle cellule knockdown Nek4 trattate per 3 ore con etoposide è 10, il che significa una riduzione di circa il 30% rispetto alle cellule PLKO di controllo nella stessa condizione. Se consideriamo che l'etoposide aumenta l'interazione Nek4-Ku del 40% in relazione alle cellule trattate con veicolo, e abbiamo il 70% di knockdown di Nek4, le cellule knockdown presenteranno circa 10 punti/nucleo. L'interazione di Nek4 e Ku70 non è esclusiva della risposta al danno al DNA e, sebbene sia aumentata dopo il danno al DNA, il cambiamento principale è nella localizzazione dell'interazione.
I risultati qui mostrati presentano uno strumento importante per localizzare l'interazione delle proteine nel contesto della risposta al danno al DNA. Nek4 e Ku70 sono già stati implicati nella DDR, e Nek4 sembra essere importante per il reclutamento di Ku70/Ku80 nei focolai di danno al DNA12. Tuttavia, le caratteristiche spaziali e temporali di questa interazione possono essere esplorate utilizzando il PLA in concomitanza con la colorazione γ-H2AX.
Altre tecniche, come la co-immunoprecipitazione e l'immunofluorescenza, possono fornire informazioni simili, ma separatamente. L'utilizzo del marcatore γ-H2AX come riferimento consente il monitoraggio temporale e spaziale dell'interazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> Figura 1: Interazione Nek4 - Ku70 in condizioni di danno al DNA. (A) Le cellule U2OS sono state incubate con etoposide (25 μM) per 20 minuti, 1 ora e 3 ore. Il DMSO (0,05% per 3 ore) è stato utilizzato come veicolo. Dopo il trattamento, le cellule sono state fissate con metanolo ghiacciato e il PLA è stato eseguito utilizzando anticorpi primari anti-Nek4 di capra e anti-Ku70 di topo. Il nucleo è stato colorato con Hoechst 33342 ed è presentato in blu; I punti in PLA sono presentati in rosso. Le cellule di controllo sono state trattate con etoposide per 1 ora e incubate con un solo anticorpo primario (capra anti-Nek4) ed entrambi gli anticorpi secondari. Il controllo biologico è stato costituito da cellule knockdown Nek4 (shRNA Nek4) trattate per 3 ore con etoposide. (B) Controllo positivo del test sulla base dei risultati della letteratura: le cellule U2OS sono state incubate con 25 μM di etoposide per 1 ora e il PLA è stato eseguito con anti-Nek5 di topo e anti-TOPIIβ di coniglio. Il grafico è rappresentativo di un esperimento e rappresenta la media più la media dell'errore standard (SEM) di tutte le celle comprese in almeno 4 campi diversi (almeno 35 celle per il controllo e 50 celle per tutte le altre condizioni). La significatività è stata ottenuta utilizzando il t-test e *: p&lt;0.05, **p&lt;0,01 e *** p&lt;0.001 rispetto al veicolo DMSO. (C) Dopo il PLA, le cellule presentate in (A) sono state lavate con PBS e incubate con anticorpo anti-γ-H2AX di coniglio. Dopo 1 ora di incubazione, l'anticorpo secondario contro il coniglio è stato utilizzato per il rilevamento dei focolai di danno al DNA ed è presentato in verde. Le regioni contenenti la co-colorazione di PLA e γ-H2AX vengono ingrandite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: Struttura delle cartelle. Le immagini di Nucleus e PLA devono essere collocate in cartelle diverse, come mostrato qui. I nomi dei file devono iniziare con un prefisso specifico (ad esempio, DAPI, PLA) e devono avere un'immagine corrispondente in ogni cartella (ad esempio, DAPI_control1.tif e PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Finestra dei parametri macro. Dopo aver aperto/eseguito la macro in ImageJ/FIJI, all'utente verrà richiesto di scegliere le cartelle di dati e di inserire i parametri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 1: file macro creato per ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

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Questo video descrive il saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ nelle cellule di nematodi. La stretta vicinanza delle proteine di interesse genera il modello circolare di DNA con l'aiuto di una sonda PLA attaccata a un anticorpo secondario. La sonda viene ulteriormente amplificata utilizzando la soluzione di amplificazione, che produce un lungo DNA a filamento singolo seguito dall'ibridazione della sonda del rivelatore, consentendo la...

Saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ

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Un'analisi semplice, rapida e quantitativa per riparazione di misura di legami incrociati della DNA-proteina su plasmidi Transfected nelle cellule di mammifero

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

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Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

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Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

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