Name: Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Scopri le vie compensatorie nei parassiti della malaria con allele ipomorfico di chinasi essenziali usando CRISPR-Cas9. Questo studio evidenzia come l'inibizione duale delle chinasi possa prevenire la resistenza ai farmaci.

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<meta charset="utf8"></head><body>Identificazione del ricablaggio delle chinasi nel parassita della malaria: un approccio di genetica chimica

<table><tbody><tr><td>1x cocktail di inibitori del fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GST</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Coniglio HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ThermoFisher Centrifuga Scientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>(per pellettazione di celle batteriche)</td><td>Centrifuga ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>(per pellettatura/lavorazione di parassiti)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (rotore TX-400)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS cellule competenti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a Cellule competenti</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione, spazio di 0,2 cm</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP reagente chemiluminescente</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione Sefarosio 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Acido libero</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Ipoxantina</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione HD in fusione</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, defosforilato</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR clean-up Mini kit</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrobenzil mesilato (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA polimerasi</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Kit Miniprep Qiaprep Spin</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL kit di mutagenesi sito-specifica</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr>Kit di sintesi del primo filamento <td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo estere tiofosfato</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

La WT CDPK1 ricombinante è espressa come proteina di fusione con un tag N-terminale di glutatione S-transferasi (GST) e purificata mediante cromatografia di affinità GST. La proteina CDPK1 purificata è stata rilevata attraverso Western blot utilizzando anticorpi anti-CDPK1 e anti-GST (Figura 1). Il residuo gatekeeper della treonina (T145) in WT CDPK1 è stato sostituito con Met e Ser utilizzando la mutagenesi sito-specifica per generare rispettivamente proteine ricombinanti mutanti CDPK1T145M e CDPK1T145S (Figura 2). Il saggio chinasico in vitro è stato effettuato per valutare l'attività chinasica di tutte le proteine CDPK1 ricombinanti. L'attività della chinasi è stata testata utilizzando un approccio semisintetico di marcatura degli epitopi34 rilevando il gruppo estere tio-fosfato utilizzando un anticorpo specifico in formato Western blot (Figura 3). L'impatto della sostituzione gatekeeper sull'attività di autofosforilazione di CDPK1 e sulla transfosforilazione di MBP utilizzato come substrato esogeno di CDPK1 è stato valutato quantificando l'intensità delle rispettive bande di autofosforilazione e transfosforilazione. Il mutante CDPK1 con gatekeeper della metionina ha mantenuto ~ 53% di attività di transfosforilazione, mentre la presenza di una serina nella posizione del gatekeeper ha portato alla completa abrogazione della transfosforilazione del substrato (Figura 3). Gli SNP che portano alla sostituzione del gatekeeper da Thr a Met (T145M) sono stati ingegnerizzati nel locus endogeno cdpk1 attraverso CRISPR-Cas9 utilizzando un sistema a due plasmidi (Figura 4 e Figura 5). Non è stato possibile generare parassiti mutanti con sostituzione T145S, probabilmente a causa dell'effetto letale del guardiano Ser sull'attività di CDPK1. I parassiti mutanti CDPK1T145M sono stati subclonati utilizzando il metodo della diluizione limitante e la sostituzione del gatekeeper è stata confermata attraverso il sequenziamento Sanger per verificare la generazione del parassita mutante CDPK1T145M. I livelli di trascrizione di 11 diverse chinasi, tra cui 7 membri della famiglia CDPK e altre 4 chinasi coinvolte nello sviluppo schizogonico tardivo del parassita, sono stati testati utilizzando la PCR in tempo reale (Figura 6). I livelli di espressione di 11 diverse chinasi sono stati confrontati tra i parassiti mutanti CDPK1T145M e wild-type (WT), normalizzati ai geni housekeeping. L'espressione del trascritto dei membri della famiglia CDPK era alterata nel mutante CDPK1T145M rispetto al parassita WT (Figura 6). I trascritti che mostrano una maggiore espressione nel mutante CDPK1T145M possono compensare la funzione di CDPK1 nel parassita mutante CDPK1T145M.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> Figura 1: Caratterizzazione del wild type (WT) ricombinante a lunghezza intera PfCDPK1. La proteina WT CDPK1 a lunghezza intera fusa con il tag N-terminale della glutatione S transferasi (GST) è stata purificata mediante cromatografia di affinità e separata su SDS-PAGE al 10%. CDPK1 è migrato alla massa molecolare prevista di ~ 87 kDa, come mostrato nel gel di poliacrilammide colorato con Coomassie Brilliant Blue R-250. La proteina ricombinante separata sulla SDS-PAGE è stata trasferita su una membrana PVDF e processata per l'analisi Western blot con anticorpi anti-CDPK1 e anti-GST. La banda corrispondente al CDPK1 ricombinante a lunghezza intera su SDS-PAGE è stata rilevata con entrambi gli anticorpi, confermando l'identità della proteina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> Figura 2: Caratterizzazione di proteine mutanti ricombinanti purificate CDPK1 gatekeeper. (A) Allineamento della sequenza di amminoacidi primari di TgCDPK1 e PfCDPK1 (Plasmodb accession no. PF3D7_0217500). La treonina alla posizione 145 di PfCDPK1 corrisponde alla glicina 128, la posizione del gatekeeper in TgCDPK1 (evidenziata in rosso). (B) Rappresentazione fumettistica del residuo gatekeeper Thr (evidenziato in rosso) codificato dal codone tripletto ACC (cerchio nero) in WT CDPK1. Sostituzione del residuo gatekeeper mediante mutagenesi sito-specifica per generare proteine CDPK1 mutanti ricombinanti con Met (evidenziato in giallo) in CDPKT145M e Ser (evidenziato in blu) in CDPKT145S. (C) Profilo SDS-PAGE di WT ricombinante e proteine mutanti di CDPK1. Le proteine mutanti ricombinanti WT e gatekeeper sono state purificate mediante cromatografia di affinità GST e separate su SDS-PAGE. Tutte le proteine ricombinanti sono conformi al peso molecolare previsto di ~87 kDa. M- scala dei pesi molecolari. (D) Caratterizzazione di CDPK1 WT ricombinante e di proteine mutanti mediante Western blotting. Le proteine mutanti ricombinanti WT e gatekeeper di CDPK1 sono state separate su SDS-PAGE e trasferite sulla membrana PVDF per il Western blotting. Le bande corrispondenti alle proteine WT ricombinanti a lunghezza intera e CDPK1 mutante su SDS-PAGE sono state rilevate con anticorpi anti-CDPK1 e anti-GST, confermando l'identità di tutte le proteine ricombinanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> Figura 3: La sostituzione gatekeeper in CDPK1 porta ad una diminuzione dell'attività chinasica degli enzimi mutanti. (A) Rappresentazione fumettistica dell'approccio di marcatura semi-sintetica degli epitopi per rilevare l'attività chinasica della proteina CDPK1. Qui è illustrata solo l'attività di transfosforilazione. La proteina CDPK1 tiofosforila un substrato esogeno (S, quadrato verde solido) in presenza di ATPγS (triangolo giallo solido), una fonte di gruppo tiofosfato terminale trasferibile). Il residuo tiofosforilato viene alchilato mediante trattamento con p-nitrobenzil mesilato (PNBM), formando un estere tiofosfato che viene poi rilevato con un anticorpo che riconosce specificamente l'addotto tiofosfato alchilato. (B) Il saggio di attività chinasica in vitro utilizzando un approccio di marcatura semisintetica degli epitopi è stato utilizzato per testare l'effetto della sostituzione del gatekeeper sul potenziale di autofosforilazione e transfosforilazione delle proteine ricombinanti CDPK1 mutanti. Tutte le proteine ricombinanti mostrano attività chinasica calcio-dipendente. L'auto-fosforilazione di CDPK1 e la trans-fosforilazione della proteina basica della mielina (MBP), un substrato esogeno, erano evidenti solo in presenza di cloruro di calcio (Ca2+), mentre nessuna fosforilazione è stata rilevata in presenza di EGTA, un chelante specifico degli ioni Ca2+ . I mutanti gatekeeper mostrano una ridotta attività di autofosforilazione, mentre la transfosforilazione di MBP è stata completamente abrogata nel CDPK1T145S. CDPK1T145M mantiene il potenziale di transfosforilazione (~ 53 %) come riportato in precedenza32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> Figura 4: Costruzione di plasmidi per l'introduzione di SNP nella posizione di gatekeeper nel locus cdpk1 utilizzando CRISPR-Cas9. Una sequenza guida di 20 nucleotidi corrispondenti a 432-451 bp è stata clonata nel sito di restrizione BtgZI nel plasmide pL6eGFP per generare pL6CK1G. Un braccio di omologia (421 bp) che incorpora gli SNP desiderati (T145M o T145S, codone corrispondente mostrato in verde) insieme a mutazioni dello scudo (mostrate in rosso) è stato clonato in pL6CK1G all'interno dei siti enzimatici di restrizione AflII e SpeI per generare pL6CK1GT145M e pL6CK1GT145M, rispettivamente. Le mutazioni dello scudo impediscono il ritaglio del locus modificato dopo l'editing desiderato. L'endonucleasi Cas9 codificata in un secondo plasmide, pUF1, è diretta al sito bersaglio all'interno del locus cdpk1 con l'aiuto dell'RNA guida espresso dal plasmide pL6CK1GT145M/S . Cas9 introduce la rottura del doppio filamento nel sito target verso il lato 5' della sequenza PAM. Il DSB viene riparato utilizzando il braccio di omologia nel plasmide pL6CK1GT145M/S . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> Figura 5: Rappresentazione schematica di P. Trasfezione di falciparum con plasmidi CRISPR per l'introduzione della mutazione gatekeeper (T145M) nel locus cdpk1 . i) P. asincrono. La coltura di falciparum viene trattata con sorbitolo per ottenere parassiti sincronizzati allo stadio anulare. ii) I parassiti sincronizzati allo stadio anulare vengono prelevati in una cuvetta per elettroporazione insieme a plasmidi pL6CK1G, T145M/S e pUF1 risospesi in soluzione tampone. iii) I parassiti vengono elettroporati a 310 volt, 950 μF e resistenza infinita. iv) Dopo la trasfezione, i parassiti vengono trasferiti in un pallone T25 contenente terreno RPMI completo fresco (cRPMI) e coltivati per 48 ore. Dopo 48 ore, i parassiti trasfettati vengono passati a cRPMI integrato con i farmaci WR99210 e DSM267 ed espanso nel pallone T75. v) Il giorno 14, i vetrini vengono preparati e colorati utilizzando il colorante Giemsa. vi) Successivamente, lo striscio di sangue viene visualizzato al microscopio ottico per valutare la presenza di globuli rossi parassitati. vii) Dopo la visualizzazione, i parassiti vengono lasciati crescere in presenza di farmaci. Successivamente, i parassiti vengono processati per ottenere il modello per la PCR e il sequenziamento del DNA per la verifica della modifica desiderata del locus cdpk1 target. viii) Successivamente alla verifica, i parassiti clonali transgenici sono ottenuti impostando la diluizione limitante in una piastra a 96 pozzetti. ix) I parassiti transgenici clonali provenienti da pozzetti positivi vengono trasferiti in fiasche T25 e lasciati crescere. x) I parassiti clonali transgenici sono ulteriormente validati attraverso la PCR e la presenza degli SNP desiderati nella posizione del gatekeeper attraverso il sequenziamento del DNA e l'analisi del cromatogramma. La cifra è stata modificata da32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> Figura 6: Rappresentazione schematica dei passaggi utilizzati per l'analisi del trascritto dei geni bersaglio attraverso la PCR in tempo reale (RT-PCR). La coltura di falciparum con parassiti prevalentemente maturi allo stadio schizonte si ottiene attraverso il trattamento con sorbitolo nello stesso ciclo. ii) I parassiti vengono delicatamente stratificati su un gradiente di 70/40 Percoll/sorbitolo in una provetta conica da 15 mL per l'arricchimento dei parassiti maturi allo stadio schizonte. iii) L'anello di colore nero all'interfase tra il 40% e il 70% di personale/sorbitolo viene trasferito in una provetta fresca da 50 mL, processato e risospeso in cRPMI. I parassiti arricchiti allo stadio schizonte vengono incubati con globuli rossi freschi preincubati a 37 °C per l'invasione. iv) I parassiti vengono coltivati per 4 ore e poi trattati con sorbitolo al 5% per ottenere parassiti altamente sincronizzati allo stadio di anello 0-4 ore. v) I parassiti vengono ulteriormente coltivati per un ulteriore trattamento post-sorbitolo di 44 ore per ottenere parassiti allo stadio schizonico altamente sincronizzati di 44-48 ore. vi) I parassiti sincronizzati vengono trattati con saponina per rilasciarli dai globuli rossi e conservati nel reagente di estrazione dell'RNA. L'RNA totale viene isolato dall'estrazione dell'RNA dei parassiti risospesi. vii) il cDNA viene preparato dall'RNA isolato. viii) Viene impostato un esperimento di PCR in tempo reale con il modello di cDNA per amplificare i geni bersaglio utilizzando primer specifici per i geni. La piastra viene eseguita con un sistema di PCR in tempo reale. ix) I dati dell'espressione del trascritto vengono analizzati utilizzando un software di analisi. Il grafico rappresenta i livelli di espressione differenziale del trascritto di 11 chinasi nei parassiti CDPK1 T145M rispetto al tipo selvatico (WT). Questa cifra è stata modificata da32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome del gene</td>
			<td colspan="4">Sequenza di primer</td>
		</tr><tr><td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCTTCATAAAATTCGGATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>ck1f1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>CK1R3WT</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Elenco dei primer utilizzati nello studio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome del gene</td>
			<td colspan="2">Primer in avanti</td>
			<td colspan="2">Innesco inverso</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>PKG (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Elenco dei geni bersaglio (numero di identificazione PlasmoDB) insieme alla sequenza dei primer utilizzati per l'analisi PCR in tempo reale.

Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more ...

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