Name: Modello in vitro che integra la rigidità e il flusso del substrato per studiare le risposte delle cellule endoteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Scopri un modello in vitro che integra rigidità del substrato e flusso laminare per studiare le risposte delle cellule endoteliali. Questo sistema avanzato simula l'ambiente vascolare fisiologico e patologico, offrendo una piattaforma innovativa per indagare la meccanotrasduzione cellulare nelle malattie cardiovascolari.

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Gli autori estendono la loro gratitudine a Robert Egan per la sua assistenza nella fabbricazione della camera di flusso. Gli autori ringraziano Lucas McCauley per il suo aiuto durante gli esperimenti. Inoltre, vorrebbero riconoscere le strutture principali dell'Institute for Chemical Imaging of Living Systems (CILS) della Northeastern University per aver concesso l'accesso ai microscopi confocali. Gli autori riconoscono il sostegno finanziario fornito dal National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 assegnato a SB) e dalla National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 to SB e CMMI 1846962 to EE).

Studio della rigidità dei tessuti e degli effetti dello stress di taglio sulle cellule endoteliali

<ol><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction.</a> Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).</li>
<li>Suowen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+in+atherosclerotic+cardiovascular+diseases+and+beyond%3A+From+mechanism+to+oharmacotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies.</a> Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).</li>
<li>Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+the+cell-matrix+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cel+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at the cell-matrix interface.</a> Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).</li>
<li>Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the glycocalyx.</a> J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).</li>
<li>Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+vascular+endothelial+genes+differentially+responsive+to+fluid+mechanical+stimuli%3A+cyclooxygenase-2%2C+manganese+superoxide+dismutase%2C+and+endothelial+cell+nitric+oxide+synthase+are+selectively+up-regulated+by+steady+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+and+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness and cardiovascular events.</a> Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).</li>
<li>Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+sensitivity+to+chemical+and+mechanical+sub-endothelial+substrate+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).</li>
<li>Mensah, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+glycocalyx+determines+metastatic+cancer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity.</a> FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).</li>
<li>Russell-Puleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+upregulation+of+COX-2+and+PGI2+release+in+endothelial+cells+via+a+pathway+involving+PECAM-1%2C+PI3K%2C+FAK%2C+and+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+Cir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38.</a> Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+endothelial+mechanotransduction%3A+current+knowledge+and+models+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacryloyl+and+its+hydrogels+with+an+exceptional+degree+of+controllability+and+batch-to-batch+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency.</a> Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).</li>
<li>Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-friendly+inverse+opal-like+hydrogels+for+a+spatially+separated+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system.</a> Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).</li>
<li>Orr, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subendothelial+extracellular+matrix+modulates+NF-kappaB+activation+by+flow%3A+a+potential+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis.</a> J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mechanisms+of+subcutaneous+preconditioning+incubation+for+neural+stem+cell+embedded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).</li>
<li>Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid-co-gelatin+cryogels+for+tissue-engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications.</a> Materials. 11 (8), 1374(2018).</li>
<li>Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics in endothelial permeability.</a> Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).</li>
<li>Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+encapsulated+cells+on+the+physical-mechanical+properties+and+microstructure+of+gelatin+methacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels.</a> Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+small-diameter+vascular+vessel+with+endothelium+and+smooth+muscle+by+the+approach+of+two-step+crosslinking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).</li>
<li>Villard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoclavable+and+injectable+cryogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications.</a> Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cross-linker+chemistry+on+release+kinetics+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).</li>
<li>Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+hydrogels+for+tissue+engineering%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives.</a> Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).</li>
<li>James, B. D., Allen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+behavior+in+complex+mechanical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments.</a> ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).</li>
<li>Yeh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+regulates+endothelial+cell+proliferation+through+septin+9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9.</a> PLoS One. 7 (10), e4688(2012).</li>
<li>Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+substrate+stiffness+on+circulating+progenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate.</a> J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).</li>
<li>Geemen, D. v, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin-anchored+focal+adhesions+distinguish+endothelial+phenotypes+of+human+arteries+and+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).</li>
<li>Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+substrate-+and+flow-derived+stresses+in+endothelial+cell+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology.</a> Comm Biol. 4 (1), 764(2021).</li>
<li>Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+endothelial+cell+culture+model+to+replicate+disturbed+flow+conditions+seen+in+atherosclerosis+susceptible+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).</li>
<li>Inglebert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+stress+reduction+on+endothelial+cells%3A+A+microfluidic+study+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).</li>
<li>Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+reorientation+of+stress+fibers+drives+morphological+changes+to+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress.</a> Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).</li>
<li>Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Yin+and+Yang%27+of+cancer+cell+growth+and+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing.</a> Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che è stata depositata una domanda di brevetto provvisorio (n. 63/634.853) con il titolo Camera di flusso con substrato sintonizzabile meccanicamente e che non esistono altri interessi concorrenti.

Il sistema vascolare è un ambiente dinamico in cui varie forze influenzano in modo significativo il comportamento cellulare. Studiare gli eventi biologici nelle malattie cardiovascolari senza considerare queste forze sarebbe impreciso. Pertanto, i modelli cellulari in grado di emulare l'ambiente meccanico vascolare sono cruciali. I ricercatori hanno già compiuto progressi significativi nell'evidenziare l'effetto di queste forze sul comportamento cellulare11. Tuttavia, per comprendere il comportame...

L'endotelio, che riveste la superficie interna dei vasi sanguigni, svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della salute vascolare. Le cellule endoteliali (EC) sono fondamentali per la regolazione di varie funzioni cardiovascolari, tra cui il controllo del tono dei vasi, la permeabilità selettiva, l'emostasi e la meccanotrasduzione 1,2. La ricerca ha strettamente collegato la disfunzione EC a un ruolo primario nello sviluppo dell'aterosclerosi. In particolare, le EC incontrano diverse forze meccaniche alle interfacce in cui interagiscono con il flusso sanguigno e i tessuti dei vasi sottostanti 3,4. Diversi studi hanno associato la disfunzione EC a cambiamenti anomali nei fattori meccanici all'interno dell'ambiente vascolare, come lo stress da taglio dei fluidi dovuto al flusso sanguigno e la rigidità dei tessuti 5,6,7.
Tuttavia, la ricerca precedente ha ricevuto un'attenzione limitata nella comprensione degli effetti combinati della rigidità dei tessuti e dello stress di taglio sulla funzione EC. Per migliorare la capacità di tradurre i risultati della ricerca in trattamenti efficaci per l'aterosclerosi e altre malattie cardiovascolari, è essenziale migliorare i modelli cellulari utilizzati sul campo. Sono stati compiuti progressi significativi nell'umanizzazione dei modelli cellulari impiegando EC umane e sottoponendole a stress di taglio o substrati con livelli di rigidità variabili 8,9,10. Tuttavia, l'adozione e il perfezionamento di modelli cellulari che integrano ambienti di flusso dinamico con substrati EC che possiedono proprietà di rigidità regolabili è progredito lentamente. La sfida consiste nell'ideare substrati EC non rigonfi per prevenire alterazioni dei parametri di flusso all'interno del canale di flusso, facilitando al contempo la coltivazione di monostrati EC intatti e ben aderenti. Un modello in vitro in grado di superare questi ostacoli potrebbe facilitare indagini più efficaci su come l'ipertensione, l'invecchiamento e le condizioni di flusso influenzino in modo collaborativo la meccanotrasduzione EC, la salute vascolare e, in ultima analisi, lo sviluppo dell'aterosclerosi. Sono stati sviluppati vari metodi per applicare lo sforzo di taglio sulle celle controllando la rigidità del substrato, tra cui piastre rotanti e dispositivi microfluidici. Nel metodo delle piastre rotanti, le celle vengono posizionate tra due piastre e la sollecitazione di taglio viene applicata attraverso il movimento rotatorio delle piastre. Questo metodo è meno complicato e fornisce un modello rapido; Tuttavia, soffre di una variazione spaziale dello sforzo di taglio, con zero sforzo di taglio al centro e massimo sforzo di taglio alla periferia11.
D'altra parte, i dispositivi microfluidici rappresentano la nuova generazione di strumenti con la capacità di controllare la rigidità del substrato e le condizioni di flusso. Questi sistemi sono adatti per imitare le microvascolarature in condizioni di flusso laminare. Tuttavia, lo studio dell'aterosclerosi con tali dispositivi non è pratico, poiché l'aterosclerosi si verifica in grandi vasi con flusso disturbato11. Questo articolo si propone di contribuire al dominio critico della ricerca sugli studi EC presentando un sistema economico in grado di esaminare gli effetti dei diversi livelli di rigidità nei substrati EC in diverse condizioni di flusso. Il sistema integra substrati con diverse rigidità per emulare vasi sanguigni patologici e fisiologici. Questo protocollo delinea il metodo per la creazione di idrogel a base di gelatina senza rigonfiamento e livelli di rigidità di 5 kPa e 10 kPa, che rappresentano rispettivamente rigidità fisiologica e patologica. Inoltre, viene descritta in dettaglio la costruzione di una camera di flusso a piastre parallele in grado di integrare questi substrati. La fluidodinamica computazionale (CFD) è stata impiegata per valutare le condizioni di sforzo di taglio e di flusso. Vengono descritti la preparazione di idrogel per la coltura EC e l'esecuzione di un esperimento a flusso di 6 ore, seguito da una discussione sull'immunocolorazione post-esperimento.

<table><tbody><tr><td>(trimetossisilil)metacrilato di propile, tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Fabbricazione di idrogel</td></tr><tr><td>3-(trimetossisilil)Metacrilato di propile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Salinizzazione del vetro</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) - contenente mezzi di</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>montaggio Vector Laboratories H-1200 ImmunocolorazioneAcetone</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>A18-4</td><td>GelMA Sintesi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Falloidina&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>8953S</td><td>Immunocolorazione</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Fabbricazione di idrogel</td></tr><tr><td>Lastra acrilica colata trasparente resistente ai graffi e ai raggi UV (45/64'')</td><td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>confocale</td> per la fabbricazione di camere di flusso <td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 800</td><td>Immunocolorazione</td></tr><tr><td>Covidien Monoject Confezione Rigida 60 mL Siringhe senza Aghi</td><td>Fisher&nbsp; &nbsp;</td><td>22-031-375</td> Kit di crescita EC <td>per esperimento di flusso</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Collezione di colture di tipo americano (ATCC)</td><td>PCS-100-041</td><td>Etanolo per colture cellulari</td></tr><tr><td>200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>Salinizzazione del vetro</td></tr><tr><td>Gelatina di tipo A (300 fiori) da pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>9526-33</td><td>Salinizzazione del vetro</td></tr><tr><td>Silicone ad alta temperatura di elevata purezza Foglio di gomma</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K74</td><td>Fabbricazione della camera di flusso</td></tr><tr><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)</td><td>Raccolta di colture di tipo americano (ATCC)</td><td>PSC-100-010</td><td></td></tr><tr><td>Viti a macchina per colture cellulari M3x30mm Vite a testa tonda a esagono incassato Bulloni di fissaggio in acciaio inossidabile 304 Fabbricazione di camere</td> di flusso <td>B07Q5RM2TP</td><td>Uxcell</td><td></td></tr> <tr><td>20 pezziAzionamento digitale Masterflex L/S con Easy-Load® 3 teste pompa per tubi di precisione; Esperimento di flusso VWR#MFLX77921-65 115/230 V CA&</td><td></td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo per pompa di precisione Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; 25 piedi</td><td>VWR</td><td>#MFLX96419-25</td><td>Flow Experiment&nbsp;</td></tr><tr><td>Anidride metacrilico (MAH)</td><td>Sigma-Aldrich 276685</td><td></td><td>GelMA Sintesi</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td> generale <td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>Sintesi GelMA</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>Sintesi GelMA Versione</td></tr><tr><td>educativa</td><td></td><td></td><td></td>SOLIDWORKS</tr><tr><td>SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>Flow Chamber Design</td></tr><tr><td>Vascolare Basale Medium American</td><td>Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-030</td><td>Coltura cellulare</td></tr></tbody></table>

modello in vitro che integra la rigidità e il flusso del substrato per studiare le risposte delle cellule endoteliali

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

Presentiamo un innovativo modello in vitro volto a studiare gli effetti combinati della rigidità tissutale e dello stress di taglio sulla funzione delle cellule endoteliali (EC), che sono cruciali per comprendere la salute vascolare e l'insorgenza di malattie come l'aterosclerosi. Tradizionalmente, gli studi hanno esplorato gli impatti dello sforzo di taglio e della rigidezza del substrato sulle EC, in modo indipendente. Tuttavia, questo sistema integrato combina questi fattori per fornire una simulazione più precisa dell'ambiente meccanico del sistema vascolare. L'obiettivo è quello di esaminare la meccanotrasduzione delle EC in vari livelli di rigidità tissutale e condizioni di flusso utilizzando EC umane. Descriviamo in dettaglio il protocollo per sintetizzare idrogel di gelatina metacrilato (GelMA) con rigidità regolabile e seminarli con EC per ottenere la confluenza. Inoltre, descriviamo la progettazione e l'assemblaggio di una camera di flusso economica, integrata da simulazioni di fluidodinamica computazionale, per generare condizioni di flusso fisiologiche caratterizzate da flusso laminare e livelli di sforzo di taglio appropriati. Il protocollo incorpora anche la marcatura a fluorescenza per la microscopia confocale, consentendo la valutazione delle risposte EC sia alla compliance tissutale che alle condizioni di flusso. Sottoponendo le EC in coltura a più stimoli meccanici integrati, questo modello consente indagini complete su come fattori come l'ipertensione e l'invecchiamento possano influenzare la funzione EC e le malattie vascolari mediate dalla EC. Le conoscenze acquisite da queste indagini saranno fondamentali per chiarire i meccanismi alla base delle malattie vascolari e per sviluppare strategie di trattamento efficaci.

La Figura 1 illustra la configurazione sperimentale, delineando il processo di sintesi di GelMA attraverso una reazione di metacrilazione. Il prodotto risultante è stato quindi utilizzato per fabbricare il substrato di idrogel, su cui sono state seminate le EC. Successivamente, le celle sono state introdotte nella camera di flusso per un esperimento di flusso di 6 ore a 12 dyne/cm2.
1La spettroscopia H NMR è stata utilizzata per valutare il s...

Abbiamo sintetizzato e caratterizzato un substrato sintonizzabile a base di gelatina per la coltura di cellule endoteliali vascolari (EC) in condizioni di flusso vascolare rilevanti. Questa superficie biomimetica replica sia le condizioni fisiologiche che quelle patologiche, consentendo lo studio delle forze meccaniche sul comportamento EC e facendo progredire la nostra comprensione della salute vascolare e dei meccanismi delle malattie.

Modello in vitro che integra la rigidità e il flusso del substrato per studiare le risposte delle cellule endoteliali

We present an innovative in vitro model aimed at investigating the combined effects of tissue rigidity and shear stress on endothelial cell (EC) function, ...

Questo studio si concentra sulla meccanobiologia in relazione all'aterosclerosi e all'ipertensione. Le domande principali che intendiamo affrontare sono: primo, come possiamo replicare in modo più accurato l'ambiente vascolare sia in condizioni fisiologiche che patologiche? Secondo, quali sono le risposte cellulari delle cellule endoteliali quando sono esposte simultaneamente a questi stimoli meccanici?Lo studio mira a fornire una simulazione più accurata dell'ambiente vascolare integrando rigidità del substrato e condizioni di flusso in un unico sistema. I modelli in vitro precedenti o analizzano la rigidità del substrato in condizioni statiche o studiano l'effetto del flusso su cellule endoteliali coltivate su un substrato rigido, entrambe condizioni fisiologicamente irrilevanti. Per iniziare, aggiungere 10 grammi di gelatina di tipo A, 300 bloom, proveniente da pelle di suino, a 100 millilitri di tampone bicarbonato di carbonato.Sciogliere la gelatina in un bagno a 55 gradi Celsius, agitando la soluzione a 700 giri al minuto utilizzando un agitatore magnetico. Una volta completamente sciolta, regolare il pH della soluzione di gelatina a 9,5 utilizzando idrossido di sodio 0,1 mol

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Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L'adesione delle cellule ', morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l'analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l'esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Drosophila larve sono un sistema modello attraente per l'imaging dal vivo a causa della loro cuticola trasparente e potenti genetica. Questo protocollo descrive come utilizzare un dispositivo PDMS singolo strato, chiamato il 'chip di larva' per l'imaging dal vivo di processi cellulari all'interno dei neuroni di 3 ° instar larve di Drosophila.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Questo protocollo commenti elettrico Cell-substrato Impedance Sensing, un metodo per registrare ed analizzare lo spettro di impedenza di cellule aderenti per la quantificazione di adesione cellulare, la proliferazione, motilità, e le risposte cellulari agli stimoli farmacologici e tossici. Rilevamento di permeabilità endoteliale e la valutazione di cellula-cellula e cellula-substrato contatti sono enfatizzati.

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Qui viene descritto un metodo che consente una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. Il metodo non richiede alcuna attrezzatura specializzata e potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca. Sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

Abbiamo sviluppato un test di irritazione oculare, che utilizza un modello di tessuto tridimensionale ricostruito epiteliali della cornea, come l'essere umano (RHCE). Il test è in grado di discriminare tra irritanti oculari e materiali corrosivi (GHS categoria 1 e 2 combinati) e quelli che non richiede etichettatura (GHS nessuna categoria).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

Questo protocollo replica fisiologica o patologica flusso di sangue in vitro per aiutare a determinare la risposta cellulare in patologie malattia. Introducendo una pressione camera di smorzamento a valle di una pompa per il sangue, il flusso di sangue attraverso il sistema vascolare può essere riassunta e imposto un monostrato di endotelio vascolare o un co-coltura mimetica.

Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

La trasfusione piastrinica e l'emostasi sono state modellate utilizzando la ricostituzione del sangue e camere a flusso microfluidico per studiare la funzione delle piastrine della banca del sangue. I dati dimostrano le conseguenze della lesione da accumulo piastrinico sull'emostasi, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Qui, un flusso di lavoro per l'analisi di espressione di cultura e gene delle cellule endoteliali sotto sollecitazione di taglio fluido è presentato. È inclusa una disposizione fisica per alloggiamento e monitoraggio più alloggiamenti di flusso in un ambiente controllato e l'uso di un RNA di riferimento esogeno per PCR quantitativa contemporaneamente.

Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

Scopri un modello in vitro che integra rigidità del substrato e flusso laminare per studiare le risposte delle cellule endoteliali. Questo sistema avanzato simula l'ambiente vascolare fisiologico e patologico, offrendo una piattaforma innovativa per indagare la meccanotrasduzione cellulare nelle malattie cardiovascolari.

Modello in vitro che integra la rigidità e il flusso del substrato per studiare le risposte delle cellule endoteliali

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