Name: Metodi per tatuare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tatuaggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Impara a tatuare Xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tracciare linee genetiche e monitorare la salute animale. Questo metodo economico e poco invasivo garantisce una marcatura permanente e affidabile.

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Ringraziamo il Centro per la Medicina Comparata e la Ricerca del Dartmouth College per aver fornito l'allevamento quotidiano degli animali utilizzati in questo protocollo. Ringraziamo anche Leah Jacob e Adwaita Bose per il loro aiuto nel testare il protocollo e fotografare gli animali. Infine, ringraziamo il laboratorio di Ann Miller per la formazione nella pratica del tatuaggio. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R00 GM147826 a J.L.

Tutte le procedure per gli animali descritte sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Dartmouth College.
1. Configurazione dell'attrezzatura
NOTA: Sono inclusi un flusso di lavoro per la procedura e un esempio di configurazione del banco (Figura 1).
<ol><li>Collegare la pistola per tatuaggi e il pedale all'alimentazione. Posizionare il pedale sotto la superficie di lavoro.</li>
	<li>Assemblaggio della pistola per tatuaggi<ol><li>Utilizzando una chiave a brugola o un cacciavite esagonale, allentare le viti nell'impugnatura (Figura 2A, cerchiate in rosso).</li>
		<li>Inserire la punta di plastica fino in fondo nell'impugnatura. Serrare la vite per tenerla in posizione.</li>
		<li>Inserire il tubo metallico nella parte posteriore dell'impugnatura (Figura 2A). Questo verrà regolato, quindi inseriscilo a metà della sua lunghezza. Serrare la vite per tenerla in posizione.</li>
		<li>Inserisci un ago per tatuaggio attraverso la parte posteriore dell'impugnatura in modo che si trovi comodamente nella punta di plastica nella parte anteriore dell'impugnatura (Figura 2B).</li>
		<li>Far scorrere la parte posteriore dell'ago e il tubo metallico attraverso il morsetto del tubo. Regolare il tubo di metallo in modo che l'ago si adatti comodamente alla punta di plastica (Figura 2B). Stringere a mano il morsetto del tubo fino a quando il tubo non è in grado di muoversi (Figura 2C).</li>
		<li>Rimuovere l'O-ring nero e agganciare l'ago al braccio del rotore; sostituire l'O-ring per fissare l'ago in posizione (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare la tensione sull'alimentatore in modo che ci sia abbastanza potenza per perforare la pelle, ma non così potente da essere difficile da controllare. Una volta che l'alimentatore è collegato e collegato, premere il pedale per assicurarsi che la macchina funzioni. Fare attenzione a non puntare l'ago verso se stessi o altri membri del personale. NOTA: La macchinetta per tatuaggi utilizzata in questo protocollo funziona meglio tra 6,0 e 9,0 V, ma questo può variare tra le macchinette per tatuaggi e gli alimentatori di tensione e dovrebbe essere determinato empiricamente.</li>
	<li>Riempire il tappo di una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml o di un calamaio di plastica in dotazione con inchiostro nero per tatuaggi fino a circa tre quarti.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Preparare l'anestesia in una vasca abbastanza grande da immergere una femmina adulta di rana X. laevis .<ol><li>Utilizzando acqua sicura per le rane (senza cloro), aggiungere la tricaina alla concentrazione finale di 1,5 g/L e il bicarbonato di sodio alla concentrazione finale di 3,5 g/L. Mescolare per sciogliere. Il pH di questa soluzione è 7,15. ATTENZIONE: La tricaina è irritante.</li>
	</ol></li>
	<li>Immergere una rana nella vasca di anestesia. Assicurarsi che la rana rimanga immersa nella soluzione di tricaina fino a quando non viene anestetizzata (7-8 min).<ol><li>Per verificare se la rana è completamente anestetizzata, raccoglila, tienila a testa in giù e stringila con decisione su un piede. Se la rana non sussulta o non risponde, può essere tatuata.</li>
		<li>Se le rane impiegano costantemente più di 10 minuti per essere anestetizzate, preparare una soluzione fresca di tricaina tamponata con bicarbonato di sodio. NOTA: Le rane non dovrebbero trascorrere più di 30 minuti nella soluzione di tricaina15.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tatuaggio
NOTA: Prima di tatuare un animale vivo, può essere utile esercitarsi su un frutto con una buccia soda (come un limone o una banana).
<ol><li>Prepara una vasca di recupero per le rane prima di tatuare. Riempi un serbatoio con 10-15 L di acqua fresca sicura per le rane e aggiungi un'isola di polistirolo. Questo fornirà una superficie in cui la rana si sveglierà senza annegare. NOTA: Un'isola di polistirolo può essere realizzata utilizzando il coperchio di un contenitore di spedizione freddo in polistirolo posizionato all'interno di una borsa con cerniera.</li>
	<li>Posizionare la rana anestetizzata sul dorso su un tovagliolo di carta asciutto o carta da banco (Figura 3A). Usa tovaglioli di carta non sbiancati (marroni) per tutti i lavori che coinvolgono le rane.</li>
	<li>Usando un panno asciutto e privo di lanugine, rimuovere l'acqua e il muco dal petto della rana.</li>
	<li>Trova lo sterno al centro del torace della rana con le dita e, usando la mano non dominante, tieni tesa la pelle.</li>
	<li>Marcatura della rana<ol><li>Tenere la pistola per tatuaggi assemblata verticalmente rispetto alla superficie di lavoro e immergere l'ago nell'inchiostro (Figura 3B).</li>
		<li>Mantenendo la pistola per tatuaggi assemblata in verticale, premere la punta dell'ago sulla pelle della rana prima di premere il pedale. Disegna delle linee sulla pelle della rana applicando una pressione uniforme. NOTA: Qualche lieve sanguinamento o arrossamento è normale, così come una piccola desquamazione della pelle.</li>
		<li>Se l'ago si impiglia nella pelle della rana, rimuovere l'inchiostro in eccesso o la pelle dall'ago con una salvietta. L'eccesso di inchiostro è normale durante il tatuaggio.</li>
		<li>Se il petto della rana è coperto da troppo inchiostro per vedere chiaramente l'area da contrassegnare (Figura 3C), rimuovere l'inchiostro in eccesso con acqua sicura per le rane e una salvietta (Figura 3C'). Quindi, rimuovere l'umidità con un panno asciutto e continuare a inchiostrare. NOTA: Prima del tatuaggio si può preparare una bottiglia di acqua sicura per le rane.</li>
		<li>Continuare a inchiostrare la stessa area fino a quando rimangono numeri scuri e leggibili dopo aver rimosso l'inchiostro in eccesso (Figura 3D). Invece di disegnare l'intero segno o numero in un solo tratto, fai ripetutamente tratti più piccoli, soprattutto per le curve.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recupero
<ol><li>Inumidisci un tovagliolo di carta con acqua sicura per le rane e posizionalo in piano sopra l'isola di polistirolo (Figura 4A).</li>
	<li>Riportare le rane nei serbatoi in piedi<ol><li>Appoggiare la rana a pancia in giù sull'asciugamano rivolto verso l'acqua (Figura 4B). Piega metà del tovagliolo di carta sulla metà posteriore del nasetto e, usando le mani a coppa, bagna la parte superiore del nasetto. Una volta che una rana emerge dall'anestesia (circa 1 ora dopo il tatuaggio), entrerà in acqua in modo indipendente e nuoterà normalmente.</li>
		<li>Riporta le rane in un alloggio a lungo termine dopo 24 ore, una volta che il tatuaggio è completamente guarito.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Pulizia e manutenzione delle attrezzature
<ol><li>Riutilizzo e sterilizzazione in autoclave degli aghi per tatuaggi<ol><li>Sciacquare gli aghi con isopropanolo al 100% e acqua deionizzata per sciogliere l'inchiostro e rimuovere l'inchiostro rimanente che non si è sciolto.</li>
		<li>Dopo lo strofinamento, posizionare gli aghi in una custodia metallica per autoclave o avvolgerli con un foglio di alluminio e sterilizzarli in autoclave per 30 minuti con ciclo a secco.</li>
	</ol></li>
	<li>Se c'è dell'inchiostro su pezzi della macchinetta per tatuaggi o di altre attrezzature, puliscilo con etanolo al 100% e un tovagliolo di carta.</li>
	<li>La soluzione anestetica ha una concentrazione finale di tricaina di circa lo 0,5%. Smaltire questo secondo le linee guida istituzionali per la gestione dei rifiuti pericolosi.</li>
	<li>Stoccaggio e manutenzione delle attrezzature<ol><li>Se possibile, conservare la macchinetta per tatuaggi in un luogo asciutto. L'umidità in eccesso danneggerà i componenti elettrici e ridurrà la longevità della macchina.</li>
		<li>Per mantenere la macchinetta per tatuaggi in buone condizioni, controllare il cuscinetto sul rotore (Figura 2C) per assicurarsi che non si sia allentato a causa delle vibrazioni22. Questo può essere serrato con una chiave a brugola o un cacciavite esagonale.</li>
		<li>Circa una volta al mese, lubrificare il cuscinetto sul braccio del rotore con un grasso lubrificante denso22.</li>
		<li>Su alcune macchinette per tatuaggi, il braccio del rotore può bloccarsi e non vibrare. Per correggere questo problema, ruotare il braccio del rotore o comprimere la molla in modo che l'ago sia in posizione abbassata (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Ottimizzare la marcatura degli anfibi: una guida al tatuaggio di Xenopus

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Tatuare gli esseri umani è una forma d'arte che risale a migliaia di anni fa e, da quando gli esseri umani si tatuano, hanno anche tatuato o marchiato animali23. Le attrezzature e le tecniche per marcare gli animali, in particolare i mammiferi, sono ben consolidate, ben documentate e ampiamente accessibili. Mentre la marcatura degli animali era originariamente per distinguere il bestiame e i deterrenti contro i furti23, il suo ruolo nella ricerca biomedica è diventato altrettanto importante.
Un vantaggio del tatuaggio degli anfibi è che i tatuaggi guariscono entro 24 ore e i buoni tatuaggi dureranno per diversi mesi (Figura 5D'). Il tatuaggio offre molteplici vantaggi per l'alloggio e l'allevamento degli anfibi. I tatuaggi consentono ai ricercatori e al personale veterinario di distinguere facilmente i singoli animali utilizzando numeri facili da vedere e interpretare, anche in vasche con tinte più scure19. Questa procedura può essere eseguita anche su qualsiasi rana adulta, rispetto agli autotrapianti cutanei, che non sono raccomandati per le rane di età superiore ai 2 annie 15. Soprattutto, il tatuaggio consente di identificare un gran numero di animali, con almeno tre dita che si adattano comodamente al petto di X. laevis (Figura 5A).
Rispetto all'applicazione di perline o etichette, il tatuaggio non lascia nulla che possa cadere e provoca un'irritazione limitata17. Inoltre, il tatuaggio consente una maggiore versatilità rispetto ad altre tecniche di branding, che richiedono la sagomatura di un filo nel marchio. La procedura stessa è molto meno dirompente degli autotrapianti cutanei perché non viene rimosso alcun tessuto. Tuttavia, come gli autoinnesti, anche il tatuaggio è parzialmente invasivo e introduce un piccolo rischio di lesioni o infezioni. Questa è una parte necessaria della marcatura di qualsiasi animale, ma è importante che i ricercatori facciano attenzione al sanguinamento eccessivo durante il tatuaggio e monitorino gli animali per l'infezione da A. hydrophilia. Questo può essere evitato mantenendo uno spazio di lavoro pulito prima, durante e dopo il tatuaggio e assicurandosi che i tatuaggi siano completamente guariti prima che gli animali vengano restituiti alla loro colonia. Nella stesura e nello sviluppo di questo articolo, nessuna delle rane è stata ferita in modo permanente o è morta a causa del tatuaggio. Una limitazione di questa procedura è che è stata testata solo su rane adulte di età superiore a 1 anno. Finora, nessuna rana è stata tatuata con questo protocollo. Inoltre, questa procedura non è ottimizzata per X. tropicalis, che ha una colorazione scura sul petto e renderà i tatuaggi meno distinguibili21. In futuro, questo protocollo di tatuaggio potrebbe essere aggiornato per includere considerazioni per X. tropicalis.
Poiché l'habitat di Xenopus è acquatico4, è normale che questi tatuaggi sbiadiscano nel tempo. La necessità di sostituire frequentemente i tatuaggi è documentata nei tatuaggi sulle labbra umane all'interno della bocca, che sbiadiscono più rapidamente dei tatuaggi epidermici a causa del contatto continuo con saliva e bevande24. Tuttavia, la longevità di un tatuaggio dipende in gran parte dalla tecnica del tatuaggio. Una tecnica scadente può derivare da una macchinetta per tatuaggi assemblata in modo errato (Figura 4C) o da impostazioni di alimentazione di tensione non ottimali. Una tensione impostata su un valore troppo basso impedirà all'ago di penetrare nella pelle, provocando segni o linee deboli. L'impostazione di una tensione troppo alta causerà danni inutili all'animale. Un'altra fonte comune di tatuaggi scadenti deriva dal posizionamento errato dell'ago o dalla pressione mentre il personale tiene la pistola per tatuaggi. Il tatuaggio con una pressione insufficiente ha lo stesso effetto di impostare la tensione troppo bassa e si tradurrà in un tatuaggio debole che sbiadisce rapidamente (Figura 5B'). Durante il tatuaggio, può sembrare che l'ago stia sfiorando la pelle della rana invece di perforarla. Tatuare con troppa pressione provocherà un sanguinamento evidente o incontrollabile. Il miglior tatuaggio viene eseguito con pazienza e metodicità, inchiostrando brevi sezioni e ritracciando le linee con una pressione forte e costante.
Nel complesso, i benefici della marcatura degli animali mediante tatuaggio negli anfibi superano gli svantaggi. Il monitoraggio individuale di Xenopus nella ricerca biomedica consente il rigore scientifico nel monitoraggio delle repliche biologiche, consente ai ricercatori e al personale veterinario di valutare il benessere dei singoli animali e garantisce un'adeguata frequenza di ovulazione per mantenere la salute a lungo termine dell'animale. Per quanto riguarda le 3R della ricerca sugli animali - raffinamento, riduzione e rimozione - questo protocollo è molto rilevante per il raffinamento e la riduzione1. La marcatura delle rane rende più facile per i ricercatori e i veterinari tenere traccia dei problemi di salute, oltre ad assicurarsi che le rane abbiano un tempo di riposo sufficiente tra gli esperimenti. Ciò affina il processo di ricerca garantendo una maggiore qualità dei dati e dei campioni raccolti dagli animali, nonché perfezionando le pratiche di allevamento e cura degli animali. Aiuta anche a migliorare la riproducibilità negli esperimenti. Inoltre, la marcatura degli animali ne consente il riutilizzo, riducendo il numero totale di animali necessari. Le rane che depongono uova di qualità particolarmente elevata o che sono più utili in altri esperimenti possono essere contrassegnate e identificate come più adatte alla ricerca. Se le rane non sono costantemente utili per gli esperimenti, possono essere identificate e rimosse dalla colonia, risparmiando risorse e spazio. Lo scopo di questo articolo è quello di documentare le migliori pratiche nel tatuaggio degli anfibi e fornire ai laboratori Xenopus un protocollo di tatuaggio dettagliato e facilmente accessibile. Questa pratica non è ancora comune nel campo di Xenopus , in parte perché le risorse pubblicate esistenti sono limitate. Questa risorsa consentirà ai ricercatori di marcare in modo sicuro ed efficace gli animali, migliorare la tenuta dei registri per le grandi colonie e perfezionare l'uso degli anfibi nella ricerca biomedica.

I modelli animali sono strumenti utili per indagare su questioni relative alla salute umana. In pratica, la ricerca biomedica che utilizza modelli animali richiede un'attenta organizzazione e il mantenimento di una colonia animale sana. Le migliori pratiche per la gestione e l'allevamento etico degli animali mirano a ridurre il numero di animali necessari per la sperimentazione e a perfezionare le pratiche per garantire il benessere degli animali1. Il genere della rana artigliata, tra cui Xenopus laevis (X. laevis; Rana artigliata africana) e Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Rana artigliata occidentale), sono stati utilizzati nella ricerca biomedica dal 1930, quando X. laevis è stato utilizzato dai medici sudafricani per condurre i primi test di gravidanza2. Sebbene i moderni test di gravidanza non richiedano più rane, il ruolo della ricerca su Xenopus persiste. I vantaggi dell'utilizzo di Xenopus per la ricerca biomedica includono i genomi ben annotati3, l'ovulazione inducibile tutto l'anno di grandi covate di uova4 e gli ovuli deposti esternamente suscettibili di fecondazione in vitro. Queste caratteristiche li rendono una risorsa utile per l'embriologia e lo sviluppo dei vertebrati 5,6,7, la biologia molecolare e cellulare di base 7,8,9,10 e per la modellazione delle malattie umane 7,11,12,13.
Metodi affidabili per tracciare i singoli animali di Xenopus sono essenziali per registrare le repliche biologiche e migliorare il rigore e la riproducibilità della ricerca. Poiché gli Xenopus sono spesso alloggiati in gruppi, la marcatura degli animali consente ai ricercatori di rintracciare facilmente i singoli animali4. Mantenere un registro accurato degli animali può far risparmiare tempo e risorse e migliorare la capacità di monitorare la salute degli animali. Ad esempio, l'identificazione individuale degli animali può migliorare i flussi di lavoro organizzativi per la generazione di linee transgeniche di Xenopus , poiché ciò richiede più generazioni di rane con genotipi specifici verificati dal sequenziamento14, che richiede l'organizzazione e l'identificazione individuale degli animali. Ciò è particolarmente vero quando queste mutazioni mancano di fenotipi adulti facilmente distinguibili. Allo stesso modo, l'uso di ovociti ed embrioni di Xenopus per studiare la biologia cellulare e dello sviluppo di base trae vantaggio dal monitoraggio dei singoli animali. Dopo aver indotto l'ovulazione, gli animali devono riposare per un minimo di 3 mesi per prevenire complicazioni di salute come la sindrome da iper-ovulazione15. I metodi di identificazione individuali garantiscono che gli animali non siano indotti a ovulare troppo frequentemente.
La marcatura e il monitoraggio degli animali consentono inoltre al personale di laboratorio di tenere traccia dei problemi di salute degli animali. Gli animali dello stesso genotipo che si ammalano possono indicare un'eccessiva consanguineità o problemi di salute imprevisti associati al transgene. Allo stesso modo, gli animali che si ammalano dopo una recente ovulazione possono indicare problemi con reagenti, materiali o tecniche. Il monitoraggio degli animali e della loro salute consente al personale di laboratorio e ai veterinari di seguire quando le preoccupazioni riemergono e di adottare misure preventive per prevenire malattie future. Nei mammiferi esistono numerosi metodi di identificazione. I metodi permanenti per i topi includono punzonatura dell'orecchio, marchi auricolari, tatuaggi e microchip sottocutanei16. Questi possono differenziare in modo chiaro e affidabile gli animali all'interno di una colonia o di una gabbia e possono essere facilmente somministrati dal personale di laboratorio. Metodi come la punzonatura dell'orecchio sono minimamente invasivi, richiedono solo un'attrezzatura specializzata e funzionano per animali della maggior parte delle età. Sebbene questi sistemi siano semplici e utili per i topi, il loro utilizzo nelle rane presenta una serie unica di sfide. Le rane e gli altri anfibi mancano di un padiglione auricolare (struttura dell'orecchio esterno). Alcuni ricercatori hanno attaccato etichette alla mascella, al dito del piede o all'arto posteriore dell'animale17,18. Questo approccio ha comportato vari problemi: le etichette della mascella causavano irritazione e le rane agitate tentavano di staccare le etichette con gli arti anteriori17. Le targhette perforavano la fettuccia tra le dita dei piedi, compromettendo i movimenti e correndo il rischio di perdersi. Pertanto, gli anfibi richiedono i propri metodi per l'identificazione. Storicamente, il toe-clipping è stato utilizzato anche per marcare gli anfibi17,19. Il dito del piede viene tagliato con un paio di forbici affilate e l'animale può essere identificato dalla lunghezza delle dita dei piedi anteriori e posteriori o dall'angolo con cui il dito è ricresciuto (nelle salamandre). Tuttavia, questo metodo pone la preoccupazione etica che il taglio delle dita dei piedi possa compromettere il movimento dell'animale17. Inoltre, questo può causare sanguinamento e introdurre un rischio di infezione. Un altro sistema di marcatura consolidato è l'autotrapianto cutaneo, in cui la pelle viene prelevata da una parte della rana e attaccata chirurgicamente a un'altra parte. Ad esempio, viene descritto un metodo per marcare la schiena o la spalla di una rana utilizzando un innesto di pelle di colore chiaro dal suo torace20. Gli innesti cutanei comportano anche limitazioni e rischi: la procedura è invasiva e introduce il rischio di infezione da Aeromonas hydrophila, o gamba rossa, un'afflizione potenzialmente fatale; la guarigione completa dell'autotrapianto richiede fino a 6 settimane; E con i metodi descritti, solo 6 rane possono essere alloggiate insieme a causa dei posti limitati per mettere un autotrapianto20.
Gli approcci di marcatura meno invasivi includono perle di vetro e chip transponder17,19. Nel metodo delle perle di vetro, le perle di vetro vengono infilate su una piccola sutura e cucite nella pelle della rana. Ciò fornisce una maggiore variabilità rispetto agli autotrapianti cutanei, con almeno 60 combinazioni di colori distintive. C'è, tuttavia, il rischio che la sutura possa fuoriuscire e provocare la perdita delle perline. In alternativa, un transponder a microchip può essere impiantato sotto la pelle nel sacco linfatico dorsale della rana. Questo è considerato il metodo di marcatura più permanente e consente di identificare e catalogare individualmente un numero potenzialmente infinito di animali. Tuttavia, questo è anche il metodo più costoso, poiché i singoli microchip sono costosi e una grande colonia sarebbe costosa da marcare. I microchip richiedono anche uno scanner speciale per leggere19. Un approccio comune per l'identificazione di Xenopus è fare riferimento alla colorazione e al disegno naturale degli animali. Questo funziona particolarmente bene per le rane come X. laevis, che hanno modelli distinti che rimangono per tutta l'età adulta. Tuttavia, questi modelli possono cambiare nel tempo con lo stress e la colorazione può apparire diversa quando le rane vengono spostate tra contenitori trasparenti e colorati15. Inoltre, questo metodo di identificazione è meno utile per X. tropicalis, che ha modelli di marcatura meno distinti rispetto a X. laevis, o per gli animali albini, che non hanno marcature colorate21. Anche per le specie con marcature distinte, il personale di laboratorio può interpretare il posizionamento e le dimensioni delle marcature in modo diverso, il che può causare errori nell'identificazione. Per questo motivo, fotografare gli animali è più affidabile in combinazione con un metodo di identificazione aggiuntivo. Pertanto, cerchiamo di marcare e identificare gli animali Xenopus utilizzando una tecnica facilmente distinguibile, permanente e minimamente invasiva.
Ci sono poche risorse pubblicate che descrivono i metodi per tatuare gli anfibi. Il tatuaggio è stato descritto insieme ad altre tecniche di branding, tra cui marchi di calore, marchi di nitrato d'argento e marchi di congelamento17. Nella stessa risorsa, il tatuaggio è stato fatto disegnando numeri con un ago ipodermico da 27G, e il processo è stato notato per non causare infezioni, in contrasto con le altre tecniche di marchiatura, che utilizzavano un filo a forma di numero o altro segno. In un'altra fonte, una macchinetta elettrica per tatuaggi (descritta come un ago vibrante) è stata utilizzata per marcare le rane, ma sono stati forniti pochi dettagli sulla tecnica17,19. Gli autori avvertono che disturbando lo strato protettivo di melma della rana, questa procedura aumenta il rischio di zampe rosse. Sebbene non esista un metodo di marcatura o identificazione che sia completamente non invasivo (come le fotografie) e permanente (come i microchip), il tatuaggio fornisce un compromesso efficace. Il tatuaggio è relativamente semplice rispetto ad altre tecniche, come gli autotrapianti cutanei. Ulteriori vantaggi includono una curva di apprendimento più piccola e attrezzature relativamente economiche. Tatuare gli anfibi acquatici comporta alcune sfide, che possono intimidire i ricercatori e compromettere la marcatura degli animali. Questo articolo mira a fornire ai ricercatori metodi ben documentati per tatuare Xenopus adulti con una macchinetta rotativa.

<table><tbody><tr><td>3 fodere rotonde ad ago</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>1203RLB</td><td>Confezionato sterile</td></tr> 5 <tr><td>aghi rotondo monouso ULTRA</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>HTIPRS5-U</td><td>Confezionato sterile</td></tr><tr><td>5 aghi tondo fodere</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>1205RLB</td><td>Confezionato sterile</td></tr><tr><td>7 aghi tondo</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>1207RLB</td><td>Confezionato sterile</td></tr><tr><td>Clip Cord</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pedale</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Inkpots</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, salviette delicate Fisher</td><td>Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>RCA Connection</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>SI101</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Manopole in acciaio inox</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td><td>Tattoo Supply in tutto il mondo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>STEALTH2-SET</td><td></td></tr><tr><td>Isola di polistirolo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Questo è il coperchio di un container di spedizione freddo in polistirolo</td></tr><tr><td>Tricaina (etile 3-amminobenzonato metanolfato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>ATTENZIONE: IRRITANTE</td></tr><tr><td>Tovaglioli di carta non sbiancati Grainger</td><td></td><td>2U229</td><td>Gli asciugamani di carta DEVONO essere non sbiancati, la candeggina è tossica per gli anfibi</td></tr><tr><td>Voltage Supply</td><td>Worldwide Tattoo Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Flacone da lavare (con acqua sicura per le rane)</td><td>Fisher Scientific FB0340923T</td><td></td><td>L'acqua sicura per le rane è declorata, pH 7,0-8,5, conducibilità 1200-1800 uS</td></tr><tr><td>X. laevis femmina adulta</td><td>Xenopus1</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sacchetto di plastica con cerniera</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Questa borsa deve essere abbastanza grande da contenere l'isola di polistirolo</td></tr></tbody></table>

metodi per tatuare lo xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tatuaggi

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

I modelli animali ampliano l'ambito della ricerca biomedica, migliorando la nostra comprensione della biologia dello sviluppo, molecolare e cellulare e consentendo ai ricercatori di modellare le malattie umane. La registrazione e il monitoraggio dei singoli animali consente ai ricercatori di ridurre il numero di animali necessari per lo studio e di perfezionare le pratiche per migliorare il benessere degli animali. Esistono diversi metodi ben documentati per marcare e rintracciare i mammiferi, tra cui la punzonatura delle orecchie e i marchi auricolari. Tuttavia, i metodi per marcare le specie di anfibi acquatici sono limitati, con le risorse esistenti obsolete, inefficaci o proibitive. In questo manoscritto, descriviamo i metodi e le migliori pratiche per marcare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa. Un tatuaggio corretto si traduce in tatuaggi di alta qualità, rendendo gli individui facilmente distinguibili per i ricercatori e ponendo un rischio minimo per la salute degli animali. Evidenziamo anche le cause dei tatuaggi di scarsa qualità, che possono portare a tatuaggi che sbiadiscono rapidamente e causano danni inutili agli animali. Questo approccio consente a ricercatori e veterinari di marcare gli anfibi, consentendo loro di tracciare le repliche biologiche e le linee transgeniche e di tenere registri accurati della salute degli animali.

I tatuaggi di alta qualità avranno tratti scuri e leggibili sul petto della rana e possono essere chiaramente differenziati da diversi metri di distanza (Figura 5A). In generale, i numeri e i segni più grandi sono migliori per la leggibilità, ma i nomi e i numeri più lunghi possono essere rimpiccioliti per adattarsi comodamente al petto della rana. La longevità del tatuaggio è più difficile da giudicare, ma i tatuaggi di rana di alta qualità dovrebbero rimanere scuri e leggibili per almeno 3-6 mesi (Figura 5D-D'). Una volta che un tatuaggio è sbiadito, può essere ritoccato utilizzando la stessa tecnica.
Una tecnica scadente non causerà danni agli animali, ma può provocare tatuaggi che sbiadiscono rapidamente (Figura 5B), portando a ritocchi più frequenti. Un tatuaggio troppo zelante può causare sanguinamento e arrossamento e posizionare una rana in una posizione di recupero errata può causare l'annegamento involontario.
La qualità dei tatuaggi e l'efficacia della tecnica possono essere valutate nei mesi successivi al tatuaggio (Figura 5E). Finché c'è inchiostro sulla rana dopo il periodo di recupero, un tatuaggio è considerato riuscito.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig01v2.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro del protocollo e configurazione del banco. (A) Flusso di lavoro e tempistiche. (1) Le rane trascorrono 7-8 minuti ad essere anestetizzate in una soluzione di 1,5 g/L di tricaina e 3,5 g/L di bicarbonato di sodio, pH 7,15, disciolta in acqua sicura per le rane. Mentre una rana viene tatuata, una seconda rana può essere posizionata sul ponte nella vasca di anestesia. Solo una rana alla volta può essere in soluzione di tricaina. (2) Le rane trascorrono circa 10 minuti fuori dall'acqua a farsi tatuare. Il tempo varierà a seconda delle dimensioni del tatuaggio e dell'esperienza del personale di laboratorio. (3) Le rane incoscienti vengono poste su polistirolo per 30-45 minuti per evitare l'annegamento e coperte con un tovagliolo di carta bagnato per evitare che si secchino. (4) Dopo il tatuaggio, le rane trascorrono 24 ore a riprendersi in acqua stagnante fresca e sicura per le rane. Una volta che si sono riprese, le rane possono essere restituite alla loro colonia. (B) Configurazione del banco per un'area di lavoro di esempio. L'area di lavoro per i tatuaggi, un tovagliolo di carta non sbiancato, è centrata sulla panchina. La macchinetta per tatuaggi e l'alimentazione di tensione si trovano a sinistra del tovagliolo di carta. Questi sono posizionati sul lato dominante del personale (il personale è mancino). Un calamaio e l'inchiostro per tatuaggi sono posizionati vicino all'alimentazione di tensione e fuori dall'area di lavoro del tatuaggio. Il pedale si trova sullo stesso lato dell'alimentazione di tensione. Premendo questo pedale si controlla il movimento rotatorio. Le salviette prive di lanugine e una bottiglia da spremere con acqua sicura per le rane si trovano a destra del tovagliolo di carta. Questi sono usati per pulire l'inchiostro in eccesso dalla pelle della rana durante il tatuaggio. Una chiave a brugola viene utilizzata per stringere e allentare le viti nella macchinetta per tatuaggi. Questo viene utilizzato per montare e smontare la macchinetta per tatuaggi. Anche la vasca dell'anestesia e i tovaglioli di carta extra vengono tenuti sulla panca durante il tatuaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig02.jpg"> Figura 2: Assemblaggio della macchinetta per tatuaggi . (A) Immagine dell'ago per tatuaggio, dell'impugnatura e dei relativi componenti smontati. Le viti sull'impugnatura metallica sono cerchiate in rosso. (B) Immagine dell'ago da tatuaggio opportunamente assemblato nell'impugnatura. (C) Immagine dell'ago per tatuaggio e dell'impugnatura assemblati nella pistola per tatuaggi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig03.jpg"> Figura 3: Posizionamento e immagini di riferimento per il tatuaggio di una rana. (A) Immagine di una rana sdraiata a faccia in su su su un tovagliolo di carta. La freccia punta allo sterno della rana. (B) Immagine del personale di laboratorio che inchiostra la rana. (C) Immagini di numeri durante l'inchiostrazione, prima (C) e dopo (C') che l'inchiostro in eccesso è stato lavato via. (D) Immagine del tatuaggio della rana subito dopo l'inchiostrazione, prima del recupero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig04.jpg"> Figura 4: Recupero post-tatuaggio. (A) Isola di polistirolo. Il coperchio della ghiacciaia in polistirolo è posizionato all'interno di una busta con cerniera. (B) Rane in posizione di recupero dopo il tatuaggio. Le isole di polistirolo possono in genere ospitare 1 o 2 rane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig05.jpg"> Figura 5: Esempi di risultati rappresentativi. (A) Un tatuaggio fresco 24 ore dopo essere stato tatuato. (B) Tecniche di scarsa qualità. In (B), la macchinetta per tatuaggi non era assemblata correttamente ma era ancora in grado di eseguire il movimento rotatorio. Questa foto è stata scattata 4 mesi dopo il tatuaggio. In (B'), la macchinetta per tatuaggi non era assemblata correttamente e non era in grado di eseguire il movimento rotatorio. Questa foto è stata scattata 6 mesi dopo il tatuaggio. (C) Macchinetta per tatuaggi assemblata in modo improprio. Il tubo di metallo e la punta di plastica non sono presenti e l'impugnatura in metallo non è fissata correttamente al resto della macchinetta per tatuaggi. L'elastico compromette il movimento rotatorio (D) Prima (D) e dopo (D') di una rana tatuata con una buona tecnica e una corretta configurazione dell'attrezzatura. (D) è stata scattata immediatamente dopo il tatuaggio e (D') è stata scattata 4 mesi dopo il tatuaggio. (E) Dati quantitativi dei risultati del tatuaggio di rana. Delle rane tatuate, il 100% aveva tatuaggi visibili subito dopo il tatuaggio, il 100% li aveva 24 ore dopo il tatuaggio e il 91% li aveva 4 mesi dopo il tatuaggio. n = 58 rane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, descriviamo i metodi per tatuare Xenopus laevis adulto (rana artigliata africana) con una macchinetta per tatuaggi rotante. Un tatuaggio corretto si traduce in numeri scuri e facilmente leggibili che durano per diversi mesi e rendono gli animali facilmente distinguibili per scopi di ricerca e registrazione.

Metodi per tatuare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tatuaggi

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

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Biology

Biologia

Animale tappi iperespressione del gene prodotto (s) sono trapiantati al fianco di...

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Tatuaggio della pelle è un modo potente e sicuro per la consegna del DNA vaccino intradermica. Qui, un plasmide EGFP codifica DNA viene consegnato da tatuaggio alla pelle di un topo di laboratorio, e l'espressione di EGFP in cellule della pelle viene poi controllata mediante microscopia confocale.

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Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare mappe del destino e traccianti di lignaggio per indirizzare le iniezioni nei singoli blastomeri che danno origine al rene degli embrioni di Xenopus laevis.

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Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'impianto automatizzato di xenotrapianto tumorale in larve di zebrafish utilizzando un sistema di iniezione robotica all'avanguardia. Inoltre, presentiamo video di iniezione e dati di convalida che dimostrano le prestazioni di successo del sistema.

Automazione dell'impianto tumorale nelle larve di pesce zebra per la ricerca e la medicina sul cancro

Impara a tatuare Xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tracciare linee genetiche e monitorare la salute animale. Questo metodo economico e poco invasivo garantisce una marcatura permanente e affidabile.

Metodi per tatuare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tatuaggi

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