Name: Esperimenti di rilassamento NMR 15N per lo studio della dinamica strutturale delle proteine da picosecondi a nanosecondi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri la spettroscopia NMR per analizzare la dinamica strutturale delle proteine intrinsecamente disordinate. Questo metodo caratterizza i movimenti della catena proteica da picosecondi a nanosecondi con analisi residue-specifica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo per il rilassamento NMR 15N e gli esperimenti hetNOE nello studio della dinamica delle proteine

Questo protocollo descriveva l'impostazione degli esperimenti di rilassamento NMR 15N di Lakomek et al.69 e Stief et al.70. Ci siamo concentrati sulle sequenze di impulsi NMR utilizzando uno schema di rilevamento HSQC con sensibilità migliorata. Gli esperimenti 15N R1 e R1ρ sono implementati come descritto in dettaglio da Stief et al.70, e l'esperimento hetNOE è descritto da Lakomek et al.69.
Quando si impostano gli esperimenti di rilassamento NMR, il 15N R1ρ è il più critico, poiché la scelta di un periodo di rilassamento massimo troppo lungo o di un'ampiezza RF troppo alta dello spin-lock può danneggiare la sonda. Per il periodo di rilassamento, è auspicabile campionare la curva di decadimento completa in modo uniforme dal 100% al 25% di intensità (rispetto all'esperimento di riferimento). Per le proteine a lento rilassamento, come le IDP, con una lunghezza di 15N T2 volte, spesso non sarà conveniente campionare la curva di decadimento nella massima estensione perché la deposizione di potenza nella sonda deve essere limitata.
Per l'ampiezza della radiofrequenza (RF) di 15N, in teoria, maggiore è l'ampiezza RF, νspin-lock, meglio è, poiché è possibile rifocalizzare più processi di scambio. Come regola generale, i processi di scambio più lenti di 1 / (2π νspin-lock ) possono essere rifocalizzati. Tuttavia, si applicano limitazioni di potenza RF. Ad esempio, nella nostra mano, non supereremmo un periodo massimo di spin-lock di 65 ms quando viene applicata un'ampiezza RF di 2 kHz per rimanere al sicuro. Allo stesso tempo, l'ampiezza RF di spin-lock su uno spettrometro a 600 MHz dovrebbe essere superiore a 1 kHz, ad esempio 1,4 kHz a 600 MHz, che si è dimostrata sufficiente per la piccola proteina globulare gb369. Per coprire le larghezze spettrali ed evitare effetti di off-risonanza a intensità di campo più elevate, l'ampiezza RF corrispondente dovrebbe scalare con il campo magnetico, ad esempio 1,5 volte superiore a 900 MHz (νspin-lock <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). Tuttavia, deve rimanere entro i limiti della sonda. (Fare riferimento all'elenco locale delle limitazioni di potenza dello spettrometro e contattare il responsabile della struttura NMR per un consiglio.)
Per la scelta della spaziatura dei ritardi di rilassamento tra l'esperimento di riferimento (ritardo corto) e il periodo di ritardo più lungo (determinato dai fattori discussi sopra), preferiamo una spaziatura uguale dei punti dati del ritardo di rilassamento e scegliamo un numero di 8 (se il tempo di misurazione assegnato e il rapporto segnale-rumore lo consentono). Il primo incremento (e quelli successivi) sarà dominato dai residui più intensi (e spesso più lenti a rilassamento). Pertanto, a seconda dell'intervallo dinamico della proteina, i segnali NMR di diversi residui nella sequenza proteica potrebbero essere già decaduti dopo il periodo di massimo rilassamento scelto. Spaziando equamente i punti di ritardo, ci assicuriamo che le curve di rilassamento dei residui di rilassamento rapido siano coperte anche da un numero sufficiente di punti dati che campionano la curva di rilassamento.
Inoltre, una buona scelta del ritardo di recupero è essenziale per ottenere dati accurati sul rilassamento ed evitare danni a lungo termine alla sonda. Scegliamo un ritardo di recupero di almeno D1 = 2 s per evitare danni alla sonda. Per ottenere risultati accurati, la polarizzazione longitudinale della proteina 1H e 15N deve anche avere il tempo sufficiente per tornare all'equilibrio o almeno a uno stato stabile e stazionario. L'1H T1 varia solitamente tra 1 s e 4 s a 600 MHz per una proteina di piccole o medie dimensioni (fino a 20 kDa); per proteine più grandi e campi più alti, l'1H T1 aumenterà ulteriormente. Per la piccola proteina globulare gb3, abbiamo trovato D1 = 3,5 s sufficiente per gli esperimenti 15N R1 e R1ρ . Per il piccolo IDP Syb-2 presentato in questo protocollo, abbiamo recentemente dimostrato che D1 = 2 s era adeguatoa 70.
L'hetNOE da 15N ha la sensibilità più bassa, poiché l'eccitazione inizia su 15N e non viene applicato alcunINEPT H-15N all'inizio della sequenza di impulsi. Inoltre, il periodo di saturazione di 1ora e il ritardo di recupero di 15N dovrebbero essere 5 volte 15N T1 per ottenere dati accurati. Mentre per l'IDP Syb-2 qui presentato, un ritardo di saturazione/recupero di 5 s più un ulteriore ritardo di recupero D1 di 2 s (totale 7 s) era sufficiente, per proteine più grandi e/o proteine deuterate, questo tempo può essere sostanzialmente più lungo, ad esempio 10 s o più. Tuttavia, se i dati qualitativi sono sufficientemente buoni, può essere accettato un leggero offset sistematico. In tal caso, si possono ottenere risultati ragionevoli già a 3 volte 15N T1, poiché si raggiungerà il 95% della saturazione. In tal caso, i valori hetNOE risultanti mostreranno un offset sistematico a valori più alti.
In questo protocollo, abbiamo lavorato con 15N Syb-2 completamente protonato, che è il più efficiente in termini di costi. La deuterazione a catena laterale è consigliata per ridurre il numero di vie di rilassamento e lavorare con le coppie di spin dell'ammide della spina dorsale 1 H-15N più isolate. Tuttavia, confrontando 15N2H Syb-2 e 15N syb-2, notiamo solo pochissime differenze tra campioni deuterati e completamente protonati70. A fini pratici, i dati di rilassamento NMR sono spesso registrati sui campioni con doppia o tripla marcatura (15N13C o 2H15N13C). Le sequenze di impulsi NMR discusse sono in grado di rifocalizzare l'evoluzione dell'accoppiamento J tra 13C con nuclei 1H o 15N. Ovviamente, anche le vie di rilassamento aumenteranno quando verrà introdotta la marcatura con 13C. Tuttavia, nelle nostre mani, ai fini pratici, l'errore introdotto, se esiste, è inferiore al 5% e potrebbe essere accettabile quando sono necessari solo dati qualitativi.
Quando si lavora con proteine di diverse dimensioni per la rilevazione, ci si chiede spesso se scegliere gli esperimenti rilevati da HSQC con sensibilità aumentata70 o gli esperimenti con rilevamento TROSY69. Per le proteine di piccole dimensioni, gli esperimenti NMR rilevati con HSQC potenziato dalla sensibilità offrono un guadagno doppio nel rapporto segnale/rumore (a condizione che si possa ottenere una buona soppressione dell'acqua). Per le proteine più grandi, gli esperimenti rilevati da TROSY vinceranno. Il pareggio è di circa 20 kDa per le proteine ripiegate. Per gli IDP, per i quali si possono ottenere basse costanti di velocità R2 che aumentano approssimativamente linearmente con l'aumentare della lunghezza della catena, il break-even può essere spostato a pesi molecolari più elevati. Per scopi pratici, si consiglia di implementare sia gli esperimenti rilevati da HSQC che quelli rilevati da TROSY in caso di dubbio. Quindi, scegli quello che fornisce il miglior rapporto segnale/rumore nel primo incremento.
La discussione sull'opportunità di scegliere gli esperimenti rilevati da HSQC o TROSY si applica solo quando il rapporto segnale/rumore è il criterio principale. Quando sono richieste le larghezze di linea più piccole e la massima risoluzione, TROSY vincerà sempre. TROSY offre inoltre sempre la migliore soppressione dell'acqua, poiché sono necessari meno impulsi di protoni e nessun disaccoppiamento dei protoni. Rimandiamo all'articolo69 precedentemente pubblicato per una discussione più estesa.
Un'ultima osservazione sulla questione della soppressione dell'acqua. Mentre impostare il guadagno del ricevitore (rg) su 16 può essere sufficiente sulle console Bruker Avance NEO, un guadagno del ricevitore nell'intervallo 128-256 è solitamente desiderabile per le console Bruker Avance (più vecchie). L'rg raggiungibile (determinato dal comando di Bruker rga) è spesso ottenuto dall'intensità del segnale dell'acqua residua al livello di rumore. Una cattiva soppressione dell'acqua introdurrà sempre ulteriore rumore negli spettri. Pertanto, anche se è possibile raggiungere un rg = 16 su una console Bruker Avance NEO, il segnale dell'acqua rimanente può contribuire in modo sostanziale al livello di rumore. Pertanto, il rapporto segnale/rumore sarebbe ridotto. Di conseguenza, si consiglia di puntare a un livello di rg compreso tra 128 e 256. Le sequenze di impulsi presentate70 sono state testate a 600 MHz e 1200 MHz. Entrambe le intensità di campo funzionano con la stessa configurazione del gradiente, come scritto nella sequenza di impulsi. Li consigliamo almeno come buon punto di partenza per un'ulteriore ottimizzazione.
Come accennato nell'introduzione, gli esperimenti di rilassamento NMR discussi coprono solo l'intervallo di tempo da picosecondi a nanosecondi. Per approfondimenti sulla dinamica da microsecondo a millisecondo, ci riferiamo agli esperimenti di dispersione di rilassamento, agli esperimenti CPMG e un'estensione degli esperimenti R1ρ con ampiezze di spin-lock variabili (o frequenze portanti) sono utilizzati 44,46,58,59,60,61,85,86 . È possibile acquisire dinamiche più lente di microsecondi 15N CEST (trasferimento di saturazione a scambio chimico) NMR62, spettroscopia di scambio (EXSY, da millisecondi a secondi) o RT (tempo reale) NMR (da secondi a ore)63,64. L'effetto PRE (paramagnetic relaxation enhancement) delle sonde paramagnetiche, così come gli accoppiamenti dipolari residui (RDC), possono essere utilizzati per valutare l'intero intervallo di dinamica da ps a ms 65,66,67,68.
Tutti questi esperimenti coprono solo la dinamica della spina dorsale. Per studiare la dinamica della catena laterale, Kay e collaboratori hanno introdotto un'altra pletora di esperimenti NMR, fornendo informazioni sulla dinamica della catena laterale per proteine fino a 1 MDa 2,87.
Per ottenere informazioni più quantitative sulla dinamica della spina dorsale delle proteine, è necessaria un'analisi combinata di tutti e tre i parametri NMR, 15N R1, R2 e hetNOE, che a volte coinvolge anche ulteriori parametri, come le costanti di velocità di rilassamento correlate in modo incrociato. Sono stati sviluppati diversi metodi di analisi sofisticati. Il cosiddetto approccio model-free è stato ampiamente applicato nella NMR biomolecolare 43,88,89,90,91. Inoltre, la mappatura della densità spettrale può fornire preziose informazioni 55,92,93. Sebbene si tratti di potenti metodi di analisi per proteine globulari con un tempo di correlazione rotazionale ben definito, la loro applicabilità è limitata per le IDP. Un dominio piegato è necessario per definire un tempo di correlazione rotazionale39. Questo può essere parzialmente aggirato quando la funzione di correlazione C(t) può essere modellata dalla somma di funzioni a decadimento esponenziale nel caso in cui le diverse scale temporali coinvolte possano essere ben separate 23,31,84. In assenza di un tempo di correlazione rotazionale ben definito, approcci alternativi che prevedono una distribuzione dei tempi di correlazione, ad esempio l'analisi IMPACT94 o l'analisi DETECTOR95,96, sono un'alternativa. Inoltre, un'analisi combinata dei dati di rilassamento NMR e delle simulazioni MD è promettente anche per gli IDP97; attualmente, stiamo ancora affrontando limitazioni di campionamento e campo di forza per le simulazioni di atomi completi di IDP più grandi31,98.

<table><tbody><tr><td>Spettrometro Bruker 600 MHz AVANCE III HD&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>esperimenti NMR condotti&nbsp;</td></tr></tbody></table>

esperimenti di rilassamento nmr 15n per lo studio della dinamica strutturale delle proteine da picosecondi a nanosecondi

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Esperimenti di rilassamento NMR 15N per lo studio della dinamica strutturale delle proteine da picosecondi a nanosecondi

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

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