Name: Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara la neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati con fotometria in fibra in topi a movimento libero. Questo metodo consente di registrare la dinamica del calcio per studiare l'attività neuronale in vivo.

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Questo lavoro è sostenuto in parte dalla National Natural Science Foundation of China (32371151), dal Guangdong High Level Innovation Research Institute (2021B0909050004), dall'Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (C5053-22GF), dal General Research Fund (15224323 e 15104520), dall'Hong Kong Innovation Technology Fund (MHP/014/19), dai finanziamenti interni dell'Hong Kong Polytechnic University (G-SACD e 1-CDJM), e la Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Liaoning - Fondo Aperto Congiunto del Laboratorio Chiave Statale di Robotica (2022-KF-22-03). Gli autori desiderano ringraziare la struttura e il supporto tecnico della University Research Facility in Life Sciences (ULS) e della University Research Facility in Behavioral and Systems Neuroscience (UBSN) dell'Università Politecnica di Hong Kong.

Tutte le procedure e la gestione degli animali sono state conformi alle linee guida etiche NSFC e ai requisiti del protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology.
1. Preparazione del trasduttore
<ol><li>Preparare una piastra piezoelettrica con un diametro interno di 3 mm, un diametro esterno di 7 mm e una frequenza centrale di 500 kHz. NOTA: Il diametro esterno può essere regolato in base alla specifica regione cerebrale presa di mira e deve essere massimizzato mantenendo la precisione della stimolazione e senza superare il limite del cranio del topo.</li>
	<li>Fissare il filo ai due lati della piastra piezoelettrica utilizzando pasta epossidica d'argento (Figura 1). Dopo che la pasta epossidica d'argento si è solidificata, utilizzare un multimetro per misurare la resistenza su entrambe le estremità del filo per assicurarsi che sia approssimativamente 0.</li>
	<li>Applicare uno strato di nastro biadesivo su una superficie di lastra di vetro pulita. Aderire saldamente alla lastra di vetro alla piastra piezoelettrica e all'anello di rame, con un'altezza di 8 mm, un diametro esterno di 8 mm e un diametro interno di 7,6 mm. NOTA: Il diametro interno dell'anello di rame è determinato dalle dimensioni della piastra piezoelettrica per garantire che la piastra sia coperta dall'anello di rame.</li>
	<li>Inserire saldamente il tubo in polipropilene con un diametro esterno di 3 mm al centro della piastra piezoelettrica e farlo aderire saldamente alla lastra di vetro (Figura 1).</li>
	<li>Preparare una quantità adeguata di colla a base di resina epossidica e aspirarla. Estrarre la resina epossidica utilizzando una siringa monouso e iniettarla lentamente nell'anello di rame. Attendere circa 10 ore fino a quando la resina epossidica si è solidificata (Figura 1).</li>
	<li>Saldare le estremità libere di due fili sul connettore del dado a baionetta utilizzando un saldatore elettronico. Rimuovere la lastra di vetro. Pulire la superficie del trasduttore con alcool (Figura 1).</li>
</ol>2. Parametri di segnalazione per FUN
<ol><li>Posizionare l'idrofono e il trasduttore in un serbatoio dell'acqua riempito con acqua deionizzata (Figura 2A). Assicurarsi che il raggio centrale (asse Z) del sistema di posizionamento sia allineato con l'asse del trasduttore. Questo allineamento può essere ottenuto in primo luogo, scoprendo un massimo di campo nel piano focale attraverso la scansione 2D; in secondo luogo, identificare un massimo di campo in un altro piano con un massimo chiaro; in terzo luogo, confrontando le coordinate X e Y dei due massimi e quindi regolando iterativamente la posizione e/o l'orientamento del trasduttore, se necessario28.</li>
	<li>Regolare la punta dell'idrofono con la superficie del trasduttore a una distanza di 1 mm, mantenendo costante questa distanza mentre si posiziona l'idrofono al centro del bordo destro del trasduttore. Avviare il programma di scansione per acquisire il campo acustico libero nel piano XZ (Figura 2B). NOTA: Il metodo di costruzione dell'idrofono può essere trovato in https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control.</li>
	<li>Spostare l'idrofono lungo l'asse Z per determinare le profondità associate alla pressione di picco spaziale. In questo esperimento, la pressione di picco spaziale appare a una distanza di 3,4 mm dalla superficie del trasduttore; mantenere questa distanza quando si sposta l'idrofono nell'angolo in basso a destra del trasduttore sul piano XY. Accendere e avviare il programma di scansione per catturare il campo acustico libero nel piano XY (Figura 2B).</li>
	<li>Posizionare il trasduttore sul cranio di un topo che ha subito un intervento chirurgico come descritto al punto 4. Acquisire il campo acustico transcranico sul piano XZ e sul piano XY (Figura 2D) attraverso la scansione dell'idrofono come descritto in 2.1-2.3.</li>
	<li>Leggere le ampiezze di pressione nel punto focale, che è la regione spaziale del picco nel campo acustico libero e nel campo acustico transcranico. L'ampiezza della pressione nel punto focale nel campo acustico libero è di 730k Pa e nel campo acustico transcranico è di 580k Pa. Leggere le dimensioni focali a -3 dB (Figura 2C, E) e la posizione sui piani XY e XZ all'interno del campo acustico transcranico per valutare se il campo acustico di questo trasduttore può coprire le aree cerebrali target.</li>
	<li>Calcola l'indice meccanico (MI), che è vincolato dal documento guida della FDA a essere inferiore a 1,9 al fine di mitigare la cavitazione. Il calcolo dell'MI è dato dall'equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) dove pr,.3 rappresenta la pressione di picco rarefazionale in MPa regolata da un coefficiente di attenuazione di 0,3 dB cm-1 MHz-1, e f0 è la frequenza operativa in MHz. La pressione rarefazionale di picco del campo transcranico misurata è di 580 kPa, a 3,4 mm dal trasduttore , f0 è a 500 kHz, quindi il pr,.3 declassato è 576,6 kPa. L'MI è 0,82.</li>
	<li>Calcolare l'intensità media dell'impulso di picco spaziale (Isppa), che deve essere inferiore a 190 W/cm2 nella direzione del piano secondo il documento guida della FDA. Il calcolo dell'intensità è dato dall'equazione: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq02.jpg" style="margin: auto;">(2) dove psp (t) è la pressione acustica variabile nel tempo nel punto del picco spaziale, Z è l'impedenza acustica caratteristica del mezzo (circa 1.5 x 106 Rayls per i tessuti molli) e PD è la durata dell'impulso. Nel caso dell'inviluppo quadrato, questo si riduce all'equazione: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) dove A è l'ampiezza della pressione di picco spaziale. L'A misurato nella posizione focalizzata dell'ecografia è 580 kPa e lo Z del cervello è di circa 1,58 x 106 Rayls, quindi l'Isppa dell'involucro quadrato è 10,65 W/cm2 e l'Isppa dell'involucro sinusoidale è 10,65 W/cm2.</li>
	<li>Calcolare l'intensità media del tempo di picco spaziale (Ispta), che è vincolata dal documento guida FDA a essere inferiore a 430 mW/cm2 nella direzione del piano. Il calcolo dell'intensità è dato dall'equazione: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq04.jpg" style="margin: auto;">(4) dove T è il periodo di tempo in cui viene calcolata la media. Nel caso dell'inviluppo quadrato, questo si riduce all'equazione: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq05.jpg" style="margin: auto;">(5) dove iltreno di impulsi CC è il ciclo di lavoro dell'impulso. Qui, il treno di impulsi CC è dell'1% perché sono state utilizzate onde continue, quindi l'Ispta è uguale all'intensità media dell'impulso di picco spaziale, 106,5 mW/cm2 per un inviluppo quadrato. Il MI, L'SPPA e L'SPTA possono essere calcolati utilizzando il software (Figura 3A). Un codice basato su MATLAB per un facile utilizzo è disponibile all'indirizzo https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation.</li>
	<li>Riportare i parametri di temporizzazione degli impulsi, tra cui Amax, durata dell'impulso, intervallo di ripetizione degli impulsi, durata del treno di impulsi e inviluppo (Figura 3B).</li>
</ol>3. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico
<ol><li>Pesare topi transgenici maschi GCaMP6s di 8 settimane, con un peso approssimativo di circa 20 g. Preparare una soluzione contenente ketamina a 10 mg/mL e xilazina a 2 mg/mL in soluzione fisiologica sterile. Somministrare la soluzione di ketamina/xilazina mediante iniezione intraperitoneale alla dose di 100 mg/kg di ketamina e 20 mg/kg di xilazina utilizzando un ago da 26 G e una siringa monouso da 1 ml. Iniziare la preparazione chirurgica una volta che l'animale non risponde a stimoli dolorosi, come il pizzicamento delle dita dei piedi.</li>
	<li>Usa un fader per tagliare i peli sulla testa dell'animale e disinfetta l'area con etanolo al 70% e iodio povidone prima della procedura chirurgica.</li>
	<li>Posiziona il mouse in posizione prona sul telaio stereotassico e assicurati che il cranio sia a livello. Metti un unguento oftalmico protettivo sugli occhi dell'animale per mantenere l'umidità.</li>
</ol>4. Procedura chirurgica
<ol><li>Praticare un'incisione lungo la sutura sagittale, partendo dall'osso occipitale fino all'inizio dell'osso nasale. Usa le forbici chirurgiche per rimuovere la pelle che copre entrambi gli emisferi.</li>
	<li>Utilizzare soluzione fisiologica sterile per pulire il cranio ed eliminare eventuali residui di periostio.</li>
	<li>Applicare il 3% di perossido di idrogeno sul cranio esposto utilizzando un batuffolo di cotone per circa 2 s-3 s per creare micropori. Risciacquare accuratamente con soluzione fisiologica sterile e assicurarsi che l'area sia completamente asciutta.</li>
	<li>Creare una craniotomia con foro di fresatura di 0,6 mm di diametro utilizzando una punta da trapano sterile autoclavata sopra la posizione dell'area del cervello, come determinato dall'atlante stereotassico allineato a bregma e lambda. Lavare via eventuali detriti con soluzione fisiologica sterile e garantire un'asciugatura accurata. Fare attenzione a non danneggiare alcun tessuto.</li>
	<li>Inserire la ghiera in fibra ottica (impianto) nel supporto della sonda e collegarla al braccio stereotassico.</li>
	<li>Allineare l'impianto direttamente sopra la regione di interesse utilizzando il braccio stereotassico. Quando si inserisce la fibra ottica nel tessuto cerebrale, far avanzare la fibra lentamente a una velocità di circa 2 mm/min.</li>
	<li>Mescolare il cemento dentale per ottenere una viscosità che consenta una facile applicazione su tutto il cranio. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile per stendere un sottile strato di cemento dentale sul cranio e sulla parte inferiore dell'impianto. Lasciarlo asciugare completamente.</li>
	<li>Staccare con cautela il supporto della sonda. Preparare un tubo in polipropilene con un'altezza di 3 mm, un diametro esterno di 3 mm e un diametro interno di 2,6 mm, quindi tagliare il tubo per tutta la sua lunghezza.</li>
	<li>Fissare il tubo alla parte inferiore dell'impianto utilizzando una pinzetta. Versare la polvere di cemento dentale nel tubo assicurandosi che la lunghezza sia sufficiente sopra l'impianto per registrare il segnale della fibra ottica. Aggiungere il liquido necessario e lasciare che il cemento dentale si solidifichi per qualche minuto.</li>
	<li>Individua l'apertura del tubo e bloccala con cura per rimuovere il tubo usando una pinzetta. Preparare la miscela di cemento dentale per l'applicazione, assicurandosi che uno strato uniforme e sottile sia distribuito sul cranio. Coprire quanta più superficie possibile sul cranio con cemento dentale. Attendere qualche minuto affinché il cemento dentale si solidifichi. NOTA: Non lasciare che il cemento dentale entri in contatto con la pelle del topo.</li>
	<li>Praticare tre fori (1 mm di diametro) nell'anello stampato in 3D, divisi uniformemente all'orizzonte, con un'altezza di 7 mm, un diametro esterno di 10 mm e un diametro interno di 8,4 mm. Fissare le viti (lunghezza 1 mm) nei rispettivi fori.</li>
	<li>Inserire la parte superiore dell'impianto nel foro del trasduttore prefabbricato. Assicurati che la parete interna dell'anello stampato in 3D sia liscia, quindi posizionala attorno al trasduttore posizionato sul cranio del topo. Assicurarsi che il trasduttore sia centrato all'interno dell'anello.</li>
	<li>Applicare il cemento dentale alla giunzione tra l'anello e il cranio, quindi attendere qualche minuto affinché il cemento dentale si solidifichi. Evitare di posizionare il cemento dentale sulla connessione tra il trasduttore e il cranio.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il trasduttore e serrare saldamente le viti. Trasferisci il mouse in una gabbia calda e assicurati che sia monitorato fino a quando non si riprende completamente prima di rimetterlo nella sua gabbia originale.</li>
	<li>Dopo l'intervento chirurgico, somministrare Carprofene per via sottocutanea (2 mg/kg) per analgesia e continuare ogni 24 ore per 3 giorni per gestire l'infiammazione e il dolore. Monitora quotidianamente gli animali per eventuali segni di angoscia, perdita di peso anormale, dolore o infezione. Normalmente, entro il 3° giorno dopo l'intervento chirurgico, tutti i topi dovrebbero mostrare un comportamento normale. Se si osservano segni di sofferenza o malattia in un topo dopo il 3° giorno, seguire le linee guida istituzionali per l'eutanasia.</li>
</ol>5. Stimolazione e registrazione del segnale
<ol><li>A 7 giorni dall'intervento, attivare l'alimentazione di ossigeno alla macchina per anestesia gassosa e regolare il regolatore del flusso di ossigeno per impostare il flusso di gas a 300-500 ml/min.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella camera di induzione e chiudere l'erogazione del gas anestetico alla maschera. Ruotare la manopola del vaporizzatore per regolare la concentrazione di anestetico appropriata (2%- 2,5%).</li>
	<li>Dopo che il topo è stato anestetizzato, posizionarlo sul telaio stereotassico con una maschera anestetica. Chiudere la linea di induzione per far fluire il gas anestetico nella maschera anestetica. Regolare la concentrazione di anestetico di mantenimento appropriata (1%-1,5%).</li>
	<li>Pulire la superficie superiore dell'impianto con alcool, quindi inserire il cavo patch in fibra ottica al centro del trasduttore preparato.</li>
	<li>Iniettare acqua nello spazio tra l'impianto e l'anello stampato in 3D utilizzando un ago da 26 G e una siringa monouso da 1 ml per inumidire il cranio. Usa salviette di carta per assorbire l'acqua in eccesso.</li>
	<li>Iniettare un agente di accoppiamento nello spazio tra l'impianto e l'anello stampato in 3D utilizzando un ago da 26 G e una siringa monouso da 1 ml per facilitare la facile propagazione degli ultrasuoni dal trasduttore al cervello.</li>
	<li>Collegare l'impianto al cavo patch in fibra ottica. Inserire con cautela il trasduttore nell'area riempita con un agente di accoppiamento e serrare saldamente le viti.</li>
	<li>Posiziona il mouse in un campo aperto e lascialo svegliare. Collegare il trasduttore al sistema di eccitazione ultrasonica e collegare il cavo patch in fibra ottica al sistema di registrazione in fibra ottica, consentendo libertà di movimento per il mouse. NOTA: Il cavo patch in fibra ottica ha una lunghezza di 2 m e un diametro di 1,25 mm. L'intensità luminosa per il canale 405 è di 20 μW e per il canale 470 è di 40 μW.</li>
	<li>Attivare sia il dispositivo di eccitazione ultrasonica che il sistema di registrazione in fibra ottica per sincronizzare la modulazione neurale ultrasonica con la registrazione del segnale in fibra ottica.</li>
</ol>

Protocollo integrato per FUN e fotometria in fibra nei topi in movimento libero

<ol><li>Wang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+for+noninvasive%2C+focal+pharmacologic+neurointervention%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention.</a> Front Neurosci. 14, 514541(2020).</li>
<li>Bystritsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+low-intensity+focused+ultrasound+pulsation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">A review of low-intensity focused ultrasound pulsation.</a> Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).</li>
<li>Di Ianni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultrasound+neuromodulation+in+awake+and+freely+behaving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats.</a> Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Badran, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication+of+the+anterior+thalamus+with+mri-guided+transcranial+focused+ultrasound+%28tfus%29+alters+pain+thresholds+in+healthy+adults%3A+A+double-blind%2C+sham-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study.</a> Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).</li>
<li>Yaakub, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound-mediated+neurochemical+and+functional+connectivity+changes+in+deep+cortical+regions+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans.</a> Nat Comm. 14 (1), 5318(2023).</li>
<li>Murphy, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+for+monitoring+cell+type-specific+focused+ultrasound+neuromodulation+and+control+of+chronic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy.</a> Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119(2022).</li>
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<li>Legaria, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+photometry+in+striatum+reflects+primarily+nonsomatic+changes+in+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fiber photometry in striatum reflects primarily nonsomatic changes in calcium.</a> Nat Neurosci. 25 (9), 1124-1128 (2022).</li>
<li>Kamimura, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+neuromodulation+of+cortical+and+subcortical+brain+structures+using+1.9+mhz%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound neuromodulation of cortical and subcortical brain structures using 1.9 mhz.</a> Med Phys. 43 (10), 5730-5735 (2016).</li>
<li>Xian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+deep+neural+circuits+with+sonogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of deep neural circuits with sonogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120(2023).</li>
<li>Mohammadjavadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+peripheral+auditory+pathway+activation+does+not+affect+motor+responses+from+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation.</a> Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).</li>
<li>Harris, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophone+measurements+for+biomedical+ultrasound+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrasonics+Ferroelect+Freq+Cont%22%5BJournal%5D)">Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review.</a> IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo approccio combina FUN con la registrazione fotometrica ottica, consentendo lo studio della funzione cerebrale del topo e del meccanismo FUN in vivo . Viene delineato il processo operativo completo, dalla fabbricazione del trasduttore alle procedure chirurgiche, consentendo ai ricercatori di eseguire in modo indipendente il FUN dall'esterno del campo.
Un aspetto cruciale del protocollo è garantire che l'impianto ottico sia inserito senza problemi nel trasduttore, che il cemento dentale attraverso il cranio sia abbastanza sottile da consentire la penetrazione degli ultrasuoni nel cervello, che l'impianto ottico sia collegato saldamente al cranio per evitare lo spostamento durante l'esperimento e che l'energia prodotta dal trasduttore sia sufficiente per un'efficace neuromodulazione. Lo spessore del cemento dentale che circonda l'impianto deve essere uguale o inferiore al diametro del foro del trasduttore. Pertanto, si consiglia di utilizzare lo stesso tubo in polipropilene sia per il processo di fabbricazione del trasduttore che per la chirurgia. Poiché il tubo in polipropilene non aderisce al cemento dentale, si è scelto di modellare il cemento dentale attorno all'impianto, con un taglio laterale, per facilitare la rimozione del tubo in polipropilene.
La registrazione elettrofisiologica e la registrazione fotometrica ottica sono tecnologie comunemente utilizzate per il monitoraggio dell'attività cerebrale in vivo, offrendo un'elevata risoluzione spazio-temporale. Tuttavia, la registrazione elettrofisiologica cattura il segnale dell'attività di attivazione dai neuroni attaccati direttamente agli elettrodi. Le onde ultrasoniche potrebbero far vibrare direttamente gli elettrodi, inducendo inutili effetti di confusione. Fortunatamente, la tecnologia della fotometria in fibra, che è meno invasiva, cattura l'attività dei neuroni sottostanti, il che potrebbe ridurre l'effetto confondente delle vibrazioni ultrasoniche sull'impianto 7,19,26. Di conseguenza, la tecnologia della neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e la registrazione della fotometria a fibre nei topi in movimento libero consente lo studio dei meccanismi in vivo della neuromodulazione ultrasonica e consente l'osservazione delle risposte comportamentali dei topi senza l'interferenza dell'anestesia.
Tuttavia, la risoluzione spaziale della fotometria in fibra è limitata in quanto non è in grado di monitorare l'attività dei sottocircuiti e dei microcircuiti24. Inoltre, fornisce una rappresentazione indiretta dell'attività neuronale poiché non registra direttamente i segnali elettrici prodotti dall'attività neuronale.

La neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati (FUN) è emersa come uno strumento di neuromodulazione promettente e versatile, che consente l'esplorazione della funzione e dell'organizzazione cerebrale con un grande potenziale1. FUN è in grado di fornire energia acustica in modo non invasivo in qualsiasi posizione all'interno del tessuto cerebrale con precisione millimetrica2. La sua capacità di modulare transitoriamente e reversibilmente la neuroattività nella struttura cerebrale profonda, con elevata specificità spazio-temporale, in modo sicuro e non invasivo, presenta un attributo interessante che integra l'attuale tecnica di neuromodulazione clinica3. La dimostrazione di un efficace FUN è stata confermata sia in soggetti umani 4,5,6 che in vari modelli animali, comprendendo piccolespecie 7,8,9,10 e grandi specie 11,12,13,14,15,16,17.
Osservando l'effetto di FUN su specifici tipi neurali attraverso il monitoraggio della neuroattività durante FUN, possiamo approfondire il meccanismo alla base di questo processo 18,19. La fotometria in fibra basata su indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) è diventata ampiamente utilizzata nell'ultimo decennio come metodo versatile per monitorare l'attività della popolazione specifica del tipo di cellula in vivo 20,21,22,23,24. Pertanto, l'applicazione simultanea del FUN e della fotometria in fibra può arricchire in modo significativo la nostra comprensione completa del FUN. Tuttavia, l'uso di trasduttori singoli ingombranti richiede il fissaggio a un telaio, mentre gli animali devono essere sottoposti ad anestesia ed essere immobilizzati in un telaio stereotassico 7,19,25,26. Questo approccio potrebbe non essere adatto per alcuni tipi di esperimenti relativi alla percezione, alla cognizione e alla valutazione del comportamento. È fondamentale stabilire un protocollo che faciliti l'amalgama di FUN e fotometria delle fibre senza ostacolare la mobilizzazione dei topi7.
In questo studio, presentiamo un protocollo raffinato utilizzato nei nostri studi precedenti per completare senza soluzione di continuità e grazia il metodo per la creazione di un singolo trasduttore e la sua fissazione temporanea sui topi, nonché la fissazione sicura di un impianto in fibra ottica per facilitare il passaggio regolare del trasduttore 7,19,26. Consente ai ricercatori di registrare la neuroattività modulata dagli ultrasuoni nei topi non trattenuti. Abbiamo optato per un inviluppo più liscio, come un involucro sinusoidale, per ridurre la confusione uditiva27. La fattibilità di questo protocollo è confermata dalla registrazione simultanea della neuroattività nel nucleo talamico anteriore di topi in movimento libero durante FUN. Dimostra che l'energia del trasduttore è sufficiente per ottenere la neuromodulazione e che i metodi di fissazione per l'impianto in fibra ottica e il trasduttore possono garantirne la stabilità.

<table><tbody><tr><td>Siringa monouso da 1 ml</td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>Aghi per iniezione</td>da <td>1 ml</td></tr><tr><td>Ago calibro 26</td><td>Jin mao</td><td>JM-J02</td><td>Aghi di preparazione</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Dong de alcohol&nbsp;</td><td>0.7</td><td>Disinfettare</td></tr><tr><td>l'alcol</td><td>Dong de alcohol&nbsp;</td><td>0,75</td><td>Pulire la superficie del trasduttore</td></tr><tr><td>Dado a baionetta Connettore</td><td>Risym</td><td>75-5</td><td>L'altra estremità del cavo di collegamento è collegata al dispositivo di eccitazione ad ultrasuoni</td></tr><tr><td>anello di rame</td><td>Guowei Materiali metallici</td><td>Diametro esterno, spessore della parete, altezza (8 mm, 0,2 mm, 8 mm)</td><td>La custodia protettiva esterna della</td></tr><tr><td>siringa monouso</td> del trasduttore <td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>L'inalazione di resina epossidica consente di iniettare piccole quantità precise nel nastro biadesivo per tubi di rame</td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>3M55236</td><td>Viene utilizzato per fissare il trasduttore e il filo per garantire che la colla epossidica d'argento non si muova prima dell'asciugatura</td></tr><tr><td>del saldatore elettronico</td><td>Victor</td><td>868A+</td><td>I fili saldati sono collegati alla colla a base di</td></tr><tr><td>resina epossidica</td> BNC <td>Kraft</td><td>K 9741</td><td>Sigillare la parte posteriore del trasduttore in</td></tr><tr><td>pasta epossidica d'argento</td><td>Vonroll</td><td>CB-052</td><td>Il filo è attaccato ai poli positivo e negativo del foglio ceramico piezoelettrico e la resistenza è mantenuta bassa</td></tr><tr><td></td><td>JOQO</td><td>YP-7021</td><td>Rimuovere i peli della testa della</td></tr><tr><td>macchina per anestesia a gas</td> del topo <td>RWD</td><td>R500</td><td>Viene utilizzato per l'anestesia nella</td></tr><tr><td>lastra di vetro</td> dei topi <td>Vetro quadrato</td><td>80 mm * 80 mm</td><td>Una superficie operativa temporanea per il posizionamento di ceramiche e fili piezoelettrici può essere utilizzata per rivestire la superficie della lastra di vetro con nastro biadesivo</td></tr><tr><td>ketamina / xilazina...</td><td>Shutai/shengxin</td><td>Zoletil 50/2ml*10</td><td>Anestetizzare l'agente</td></tr><tr><td>di accoppiamento medico</td> del topo <td>Bestman</td><td>120g</td><td>L'accoppiante funge da mezzo per condurre il segnale ultrasonico</td></tr><tr><td>del topo</td><td>Bai shi tong</td><td>GCaMp6</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td> per soggetti del test <td>Yun Zhi</td><td>0,5% x 2,5 g x1</td><td>Inumidisce la zona degli occhi per prevenire la cecità</td></tr><tr><td>&nbsp; piastra piezoelettrica</td><td>Jiaming Electronics Factory</td><td>Diametro, poro, spessore (7 mm, 3 mm, 3,56 mm)</td> <td>L'energia elettrica viene emessa sotto forma di tubo in polipropilene ad ultrasuoni</td></tr><tr><td></td><td>Baihao Pipe Factory</td><td>Diametro esterno, diametro interno, lunghezza (3 mm, 2 mm, 500 mm)</td> <td>Evitare che la resina epossidica ostruisca i fori e lasci i fori</td></tr><tr><td>povidone-iodio</td><td>lefeke</td><td>500ml</td><td>Disinfettare</td></tr><tr><td>registrazione del segnale della fibra</td><td>Thinker Tech Nanjing Biotech</td><td>Sistema di registrazione in fibra ottica a canale singolo a tre colori</td><td>Registra i segnali di fotometria in fibra</td></tr><tr><td>telaio stereotassico</td><td>RWD</td><td>68805</td><td>Fissare la testa del topo e localizzare la soluzione</td></tr><tr><td>salina sterile</td> della regione del cervello <td>Shijiazhuang si yao</td><td>500ML, 4.5g</td><td>Come solvente, dissolve la</td></tr><tr><td>stimolazione farmacologica degli ultrasuoni&nbsp;</td><td>Deep Brain Technology</td><td>DB-USNM</td><td>Fornisce un input stabile alla</td></tr><tr><td>pesatrice</td> del trasduttore <td>Qin bo shi</td><td>1718</td><td>Pesare il filo del mouse</td></tr><tr><td></td><td>Jinpeng Cable Factory</td><td>0.3mm2</td><td>La tensione viene fornita al trasduttore</td></tr></tbody></table>

neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

La neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati (FUN) rappresenta un approccio promettente per la perturbazione non invasiva dei circuiti neuronali nelle regioni cerebrali profonde. È compatibile con la maggior parte delle modalità esistenti per il monitoraggio delle funzioni cerebrali in vivo. L'integrazione con le modalità di registrazione delle funzioni cerebrali non solo ci consente di affrontare gli ordini e i disturbi di specifiche funzioni cerebrali con un feedback a circuito chiuso, ma ci fornisce anche intuizioni meccanicistiche sul FUN stesso. Qui, forniamo un protocollo modificato, semplice, affidabile e robusto per l'applicazione simultanea della registrazione della fluorescenza GCaMP6s FUN e fotometria in fibra nei topi in movimento libero. Ciò comporta la fabbricazione di un singolo trasduttore di buone dimensioni e il suo posizionamento temporaneo sui topi, insieme al fissaggio sicuro di un impianto in fibra ottica per facilitare il passaggio regolare del trasduttore. La combinazione di FUN e fotometria a fibre fornisce la registrazione ottica delle risposte dei circuiti neurali su FUN in tempo reale nelle regioni cerebrali profonde. Per dimostrare l'efficienza di questo protocollo, i topi Thy1-GCaMP6s sono stati utilizzati come esempio per registrare la neuroattività nel nucleo talamico anteriore durante il FUN mentre i topi si muovono liberamente. Riteniamo che questo protocollo possa favorire l'uso diffuso di FUN sia nel campo delle neuroscienze che in quello degli ultrasuoni biomedici.

La distribuzione della pressione acustica nel campo acustico libero sul piano XY e sul piano XZ situati a 3,4 mm di distanza dalla superficie del trasduttore, corrispondente alla posizione del nucleo talamico anteriore del topo, è mostrata nella Figura 2B, C. Queste misure sono state acquisite attraverso la scansione dell'idrofono nel dominio XY e nel dominio XZ. La distribuzione della pressione acustica nel campo acustico transcranico sul piano XY e sul piano XZ situati a 3,4 mm di distanza dalla superficie del trasduttore è mostrata nella Figura 2D, E. La pressione acustica libera misurata è di 730 kPa e la pressione acustica transcranica misurata è di 580 kPa per la frequenza centrale di 500 kHz. Lo spessore del cranio misurato è di circa 0,2 mm, in media. Supponiamo che la relazione di dispersione sia approssimativamente lineare, quindi il cranio ha un coefficiente di attenuazione di 19,98 dB/cmMHz. Il trasduttore leggero, del peso di circa 1,66 g, consente al mouse di muoversi facilmente, facilitando l'osservazione del comportamento di risposta del mouse in condizioni di FUN e della scia di movimento.
I segnali in fibra ottica sono stati registrati sotto FUN (Figura 4B, D), con l'inviluppo quadrato e sinusoidale, rispettivamente. Nell'esperimento sono stati utilizzati cinque topi maschi. Il quadrato è durato 300 ms, mentre la sinusoidale continua è durata 471 ms, il che può garantire che l'energia totale sia la stessa in due diversi FUNs (Figura 4A,C). Un miglioramento del segnale in fibra ottica indica un aumento dell'attività neurale. La risposta neurale è rapida sotto il FUN, suggerendo che il trasduttore ha energia sufficiente ed eccellenti capacità di messa a fuoco.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig01.jpg"> Figura 1: Processo di produzione del trasduttore. Ciò comporta, a sua volta, il collegamento di un foglio piezoelettrico a un filo e quindi l'imballaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig02v2.jpg"> Figura 2: Configurazione e caratterizzazione della misurazione del campo ultrasonico per il trasduttore a ultrasuoni. (A) La configurazione per la misurazione del campo ultrasonico include un idrofono, un sistema motore, un software di controllo, un generatore di segnali e un oscilloscopio. (B, D) Diagramma schematico delle misure dei trasduttori ultrasonici in campi acustici liberi e transcranici e i risultati delle misure di campo sonoro trasversale e longitudinale. (C, E) Diagramma del campo sonoro trasversale in corrispondenza della posizione focale del trasduttore, con la linea rossa che indica il campo sonoro in posizione -3 dB. (F, G) Diagramma della forma d'onda dell'uscita misurata dall'idrofono per il trasduttore. L'area all'interno del riquadro tratteggiato rosso e l'area all'interno del riquadro tratteggiato blu rappresentano rispettivamente i periodi prima che la forma d'onda raggiunga un'ampiezza stabile e il periodo di squillo del trasduttore alla fine. L'area all'interno del riquadro tratteggiato arancione rappresenta la parte stabile della forma d'onda, che viene utilizzata per calcolare l'ampiezza della pressione, indicata come p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig02largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig03.jpg"> Figura 3: Software di calcolo e parametro ecografico. (A) Un'interfaccia di calcolo dei parametri ecografici fatta in casa. Sono stati calcolati MI,I sppa e Ispta . L'interfaccia può essere ottenuta da https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. (B) Schemi delle forme d'onda della pressione ultrasonica. Vengono utilizzati un inviluppo a impulsi sinusoidale e un inviluppo a impulsi rettangolare. Il periodo (T) rappresenta la durata di un singolo ciclo della frequenza operativa. Un impulso, noto come singola sonicazione continua, dura per una durata specificata chiamata durata dell'impulso (PD). In genere, gli impulsi vengono ripetuti in una sequenza nota come treno di impulsi. L'intervallo di tempo tra due impulsi consecutivi in un treno di impulsi è indicato come intervallo di ripetizione dell'impulso (PRI), calcolato come il reciproco della frequenza di ripetizione dell'impulso (PRF). L'intera sequenza di impulsi, nota come treno di impulsi, ha una durata specifica nota come durata del treno di impulsi. L'intervallo di tempo indica la durata di una singola prova. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig04v2.jpg"> Figura 4: Segnale della fotometria in fibra durante FUN. (A, C) Parametri ecografici avvolti da quadrato (B) e sinusoidale (D). (B, D) Il segnale di fotometria in fibra durante il FUN rispettivamente di (A) e (C). L'ombra verde è la durata del DIVERTIMENTO. La linea continua è la media e le sfumature di blu e rosso sono la media e la deviazione standard dei segnali registrati. Nell'esperimento sono stati utilizzati cinque topi maschi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig04largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il protocollo include la produzione di trasduttori, la segnalazione dei parametri, la procedura chirurgica e la registrazione del segnale per l'intero flusso di lavoro operativo della neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati concomitanti e della registrazione della fotometria a fibre nei topi in movimento libero.

Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

simultaneous-focused-ultrasound-neuromodulation-fiber-photometry

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Questo video mostra un metodo per registrare l'attività neurale in un topo che si muove liberamente utilizzando la fotometria in fibra. In questo metodo, i neuroni in una specifica regione del cervello esprimono un indicatore di calcio geneticamente codificato. Uno stimolo viene applicato a questa regione del cervello e il cambiamento dipendente dallo stimolo nella fluorescenza viene misurato per identificare l'attività neurale.

Registrazione dell'attività neurale in topi che si muovono liberamente utilizzando la fotometria a fibre

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Questo protocollo descrive in dettaglio come implementare ed eseguire registrazioni di fotometria multifibra, come correggere gli artefatti indipendenti dal calcio e considerazioni importanti per l'imaging di fotometria a doppio colore.

Fotometria multifibra per registrare l'attività neurale in animali liberamente

Questo protocollo descrive la quantificazione delle variazioni emodinamiche cerebrali volumetriche nel cervello del topo utilizzando l'ecografia funzionale (fUS). Le procedure per la mappa di attivazione funzionale 3D dopo la stimolazione sensoriale e la connettività funzionale dello stato di riposo sono fornite come esempi illustrativi, in topi anestetizzati e svegli.

Attivazione 3D dell'intero cervello e mappatura della connettività funzionale nei topi utilizzando l'imaging ecografico funzionale transcraniale

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

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Utilizzando un approccio completamente ottico, l'ictus ischemico viene indotto registrando contemporaneamente l'attività neuronale del Ca2+ utilizzando un biosensore fluorescente nel nucleo emergente dell'ictus di un topo sveglio e in comportamento.

Fototrombosi simultanea e fotometria delle fibre per indurre e monitorare l'ictus ischemico nei topi comportanti

Questo protocollo fornisce una descrizione completa di un metodo per la registrazione simultanea dei segnali di calcio provenienti da neuroni e astrociti attraverso molteplici regioni cerebrali legate alla memoria e ne dimostra l'applicazione durante un paradigma di apprendimento e comportamento della memoria.

Un metodo di fotometria a fibre a doppio colore per registrare l'attività degli astrociti-neuroni in più regioni cerebrali durante l'apprendimento e i comportamenti di memoria

Questo protocollo fornisce un metodo integrato che include la somministrazione virale, l'impianto di optrodi, l'induzione fototrombotica, la registrazione simultanea dell'attività degli astrociti e dei neuroni, e la stimolazione optogenetica degli astrociti. Questo metodo integrato mira a fornire un'indagine parallela della relazione astrocito-neurone nelle fasi acute a croniche dell'ictus ischemico.

Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

Questo nuovo metodo permette la registrazione simultanea intracellulare di una motoneuron singolo topo adulto e la misura della forza prodotta dalle sue fibre muscolari. L'indagine combinato delle proprietà elettriche e meccaniche delle unità motorie negli animali normali e geneticamente modificato è una svolta per lo studio del sistema neuromuscolare.

Registrazione simultanea intracellulare di un motoneuroni lombare e la forza prodotta dal suo gruppo motore nel topo adulto<em&gt; In vivo</em

Vengono descritte le procedure per eseguire registrazioni simultanee del potenziale o della corrente di membrana e delle variazioni della concentrazione intracellulare di calcio. I neuroni del nucleo soprachiasmatico vengono riempiti con l'indicatore di calcio bis-fura-2 utilizzando un elettrodo patch clamp nella configurazione patch clamp dell'intera cellula.

Registrazione elettrofisiologica simultanea e imaging del calcio dei neuroni del nucleo soprachiasmatico

Impara la neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati con fotometria in fibra in topi a movimento libero. Questo metodo consente di registrare la dinamica del calcio per studiare l'attività neuronale in vivo.

Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero

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