Name: Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri un metodo robusto per isolare mitocondri di alta qualità dal tessuto cardiaco di roditori. Questa tecnica consente di valutare la funzione mitocondriale e le sue implicazioni nelle patologie cardiache.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento mitocondriale dai roditori per studi bioenergetici di alta qualità

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation%3A+Ii.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Ernster, L., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: A historical review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+tca+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation%2C+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+metabolism%3A+Glycolysis%2C+the+TCA+cycle+and+mitochondrial+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).</li>
<li>Kalpage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+C+phosphorylation%3A+Control+of+mitochondrial+electron+transport+chain+flux+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).</li>
<li>Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).</li>
<li>Mitchell, P., Moyle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiosmotic+hypothesis+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+heart+disease%3A+Critical+appraisal+of+an+overlooked+association%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association.</a> Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).</li>
<li>Zhou, B., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+pathophysiology+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).</li>
<li>Holzem, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+not+different+between+nonfailing+donor+and+end-stage+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts.</a> FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).</li>
<li>Cordero-Reyes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+isolated+mitochondria+from+failing+human+hearts+exhibit+preserved+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function.</a> J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+subsarcolemmal+and+interfibrillar+mitochondria+display+distinct+responsiveness+to+protection+by+diazoxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide.</a> PLoS One. 7 (9), e44667(2012).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+Functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Micakovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pure+mitochondria+from+rat+kidneys+and+western+blot+of+mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Hubbard, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+mitochondrial+magnetic+separation+for+isolation+of+synaptic+mitochondria+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue.</a> Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+mitochondrial+isolation+and+sub-cellular+localization+assay+for+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).</li>
<li>Hernandez-Camacho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+mouse+skeletal+muscle+for+respirometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays.</a> J Vis Exp. (180), e63336(2022).</li>
<li>Farrugia, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+and+parallel+isolation+of+myocytes+and+non-myocytes+from+multiple+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).</li>
<li>Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+respiration+buffer+composition+on+mitochondrial+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function.</a> PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).</li>
<li>Vinnakota, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-loop+control+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+and+cardiac+muscle+mitochondria+by+ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2).</a> Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).</li>
<li>Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+and+time+hierarchy+of+oxidative+phosphorylation+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria.</a> Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).</li>
<li>Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarnock%2C+LB+%22Statpearls%22">Statpearls</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).</li>
<li>Sercel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+stable+isolated+mitochondrial+recipient+clones+in+mammalian+cells+using+mitopunch+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> J Vis Exp. (97), e52076(2015).</li>
<li>Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+bubble+contact+with+endothelial+cells+causes+a+calcium-independent+loss+in+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential.</a> PLoS One. 7 (10), e47254(2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+of+citrate+synthase+activity+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (155), e59454(2020).</li>
<li>Tomar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-dependent+differential+regulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+the+heart+and+kidney+cortex+and+outer+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).</li>
<li>Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affinity+for+ADP+is+twofold+lower+in+creatine+kinase+knock-out+muscles.+Possible+role+in+rescuing+cellular+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis.</a> FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).</li>
<li>Gouspillou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+the+oxidative+phosphorylation+affinity+for+ADP+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20709(2011).</li>
<li>Strubbe-Rivera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+phenomenon+elucidated+by+cryo-em+reveals+the+genuine+impact+of+calcium+overload+on+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function.</a> Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+of+cytochrome+C+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease.</a> Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+bcl-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members.</a> Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).</li>
<li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+control+of+oxidative+phosphorylation%3A+Multiple+roles+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate.</a> J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).</li>
<li>Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glycolysis+and+mitochondrial+function+in+endothelial+cells+using+the+seahorse+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer.</a> Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).</li>
<li>Huerta, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+lamprey+cardiac+mitochondrial+bioenergetics+after+exposure+to+TFM+and+its+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites.</a> Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).</li>
<li>Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+precipitation+inhibits+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism.</a> PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr>Provette <td></td><td></td><td></td><td>per microcentrifuga da 1,7 mL</td></tr><tr>Becher <td></td><td></td> in<td>vetro da 10 mL</td><td>Per la disezione e la macinazione di organi</td></tr><tr><td>Provette</td><td></td><td></td> da centrifuga da 50 mL <td>Centrifugazione</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-difosfato sale monopotassico diidrato</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5285</td><td>Saggi di respirometria</td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BSA</td><td>Thermo Scentific</td><td>PI23225</td><td>Quantificazione delle proteine mitocondriali</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma</td><td>DX0145</td><td>Per tampone (CB)</td></tr> <tr><td>Glicole etilenico bis(2-ammino-etiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E4378</td><td>Per tamponi (CB e IB) e saggi di respirometria</td></tr><tr><td>Cannula in vetro</td><td>Radnoti</td><td></td><td>Perfusione cardiaca di porcellino d'India e ratto</td></tr><tr><td>Eparina sodica mucosa suina</td><td>Sigma</td><td>SRE0027-250KU</td><td>Iniezione di IP animale</td></tr><tr><td>Respirometro</td><td></td><td></td> ad alta risoluzione <td>Elettrodo di tipo Clark; ossigrafo con camere da 2 mL</td></tr><tr><td>Camera di induzione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td>Anestetico&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido L-malico</td><td>Sigma</td><td>02288-50G</td><td>Saggi di respirometria</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M9272</td><td>Per tampone (RB)</td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>MX0214</td><td>Per siringhe tampone</td></tr><tr><td></td><td></td> (IB)<td>Microlitri</td><td>Dimensioni che vanno da 5&ndash; 50 &micro; L</td></tr><tr><td>Lettore</td><td></td><td></td> di micropiastre <td>Deve essere in grado di incubare a 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>475898</td><td>Per tutti i tamponi</td></tr><tr><td>O2 serbatoio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMNI THQ Omogeneizzatore</td><td>OMNI International&nbsp;</td><td>12-500</td><td>Omogeneizzatori statore a rotore simili funzioneranno</td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td>Volumi di&nbsp; 2&ndash; 20 &micro; L; 20&ndash; 200 &micro; L; 200&ndash; 1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>Per tamponi (RB e CB)</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496</td><td>Per tamponi (IB e RB)</td></tr><tr><td>Proteasi da Bacillus licheniformis</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5459</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Per tampone (CB)</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Fisher bioreagenti</td><td>BP356-100</td><td>Saggi di respirometria</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8510-OP</td><td>Per tampone (IB)</td></tr> <tr>Kit <td></td><td></td> di <td>dissezione chirurgica</td><td>Dipende dalla fonte animale e tissutale</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td> da tavolo <td>Deve raffreddarsi a 4 &deg; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori 

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Al termine dell'isolamento mitocondriale, la qualità e la funzionalità degli isolati devono essere testate quantificando i tassi di consumo di ossigeno (JO2) utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. A tal fine, le scorte mitocondriali sono state diluite a 40 mg/mL per consentire concentrazioni di lavoro di 0,1 mg/mL in 2 mL di RB per tutti i test respirometrici utilizzando mitocondri cardiaci isolati. La respirazione è stata alimentata da 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato in presenza di 1 mM di EGTA, un chelante del calcio, ed è stata lasciata equilibrare per 5 minuti per stabilire la respirazione di Stato 2. Durante questo stato, i tassi di consumo di ossigeno dovrebbero essere in media di 45-55 pmol/mL/s o 27-33 nmol/mg/min. Prestare attenzione al tasso di consumo di ossigeno dipendente dall'elettrodo ed eseguire le correzioni di sfondo appropriate quando necessario. La fosforilazione ossidativa (Stato 3) viene avviata al minuto 5 da un bolo di 500 μM di ADP. Le aggiunte al substrato e il tracciamento rappresentativo sono dettagliati nella Figura 1. I mitocondri funzionali avranno un aumento immediato di JO2 dopo l'aggiunta di ADP, che varia a seconda della fonte tissutale, come mostrato nella Figura 2. Senza l'uso di EGTA, il calcio residuo ha effetti variabili sui tassi massimi di JO2 durante l'OXPHOS, a seconda della concentrazione mitocondriale, della disponibilità di substrato e di altri fattori ambientali. La composizione del tampone è importante per la conservazione dell'integrità e della funzionalità della membrana mitocondriale. Tutte le ricette tampone menzionate nel protocollo sono ulteriormente dettagliate nella Tabella 1 e possono essere utilizzate per tutte le preparazioni mitocondriali qui descritte.
Il successo dell'isolamento dei mitocondri è indicato dall'ottenimento di valori di RCR che rientrano nell'intervallo dato per ciascuna specie e fonte tissutale, come mostrato nella Tabella 2. Sulla base dei dati raccolti utilizzando questo protocollo, se si isolano i mitocondri cardiaci da cavie, ratti o topi, gli RCR dovrebbero essere rispettivamente ≥16, ≥8 e ≥5. Se si isola dal fegato o dal rene di ratto, gli RCR dovrebbero essere ≥6, mentre gli RCR dalle cellule sono considerati accettabili se superiori a 3,8. Se i valori RCR scendono al di sotto di questi intervalli o se ci sono differenze qualitative nei tracciati respirometrici, si raccomanda di eseguire un test aggiuntivo con nuovi RB e substrati per escludere problemi di contaminazione. Sebbene la trasformata 1-1/RCR limiti i valori tra 0 e 1, questa metrica non è consigliata quando si confronta la qualità mitocondriale tra sessi o specie quando il valore RCR è maggiore di 10. Per questo motivo, durante tutti gli esperimenti sono stati quantificati i valori standard di RCR (Stato 3/Stato 2 o OXPHOS/LEAK). Le informazioni relative alle modulazioni che possono essere apportate a questo protocollo per isolare meglio i mitocondri da cuori, fegato, reni e cellule di topo sono dettagliate nella Tabella 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig01.jpg"> Figura 1: Regioni di interesse per i controlli di qualità mediante respirometria ad alta risoluzione. Le camere respiratorie sono state caricate con 2 mL di RB e lasciate equilibrare a 37 °C fino a quando il tasso di consumo di ossigeno è stato vicino allo 0. Una volta equilibrato, è stato aggiunto 1 mM di EGTA, un chelante del calcio, insieme a 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato. Dopo l'aggiunta di questi substrati, i mitocondri sono stati aggiunti alla concentrazione di lavoro desiderata (0,1 mg/mL) e lasciati respirare per 5 minuti per raggiungere la respirazione di Stato 2 (giallo). Al minuto 5, sono stati aggiunti 500 μM di ADP per avviare la respirazione dello Stato 3 (rosso). Gli RCR sono stati determinati in base alla media temporale dei tassi di consumo di ossigeno indicati dalle caselle rosse e gialle per confrontare lo Stato 3 con lo Stato 2. Lo stato 4 è indicato dalla casella verde e rappresenta il periodo di idrolisi extramitocondriale dell'ATPasi dell'ATP e può essere utilizzato per valutare l'integrità della membrana esterna nei saggi del citocromo C. I dati visualizzati sono stati raccolti utilizzando mitocondri cardiaci di ratto SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig02.jpg"> Figura 2: Tracciati rappresentativi di JO2 e rapporti di controllo respiratorio tra fonti animali e tissutali. La qualità dei mitocondri isolati è stata testata quantificando i tassi di consumo di ossigeno utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. La respirazione è stata alimentata da 5 mM di piruvato di sodio e 1 mM di L-malato in presenza di 1 mM di EGTA. I mitocondri e i substrati sono stati lasciati respirare per 5 minuti affinché la respirazione di Stato 2 si stabilizzasse. I tassi massimi di consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di ADP sono stati confrontati con i tassi di consumo di ossigeno dello Stato 2 prima dell'ADP per calcolare i rapporti di controllo respiratorio (RCR) per ciascun tessuto. La qualità mitocondriale è stata ulteriormente valutata calcolando i valori 1-1/RCR come caratterizzati dagli standard di efficienza del controllo P-L. I grafici a barre a destra di ciascun tracciato indicano l'RCR medio maschile (blu) e femminile (verde) e i valori 1-1/RCR ± SD per un determinato tessuto. (A), (B) e (C) si riferiscono ai dati raccolti utilizzando rispettivamente i cuori di cavia, ratti Sprague Dawley (SD) e virus della leucemia amica B (FVB). (D) ed (E) dettagliano i risultati del fegato e del rene di ratto SD, mentre (F) si riferisce alle cellule HEK293. I tre lobi epatici più grandi sono stati raccolti, mentre entrambi i reni sono stati utilizzati per l'isolamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Ricette tampone. Il tampone per cardioplegia (CB), il tampone di isolamento (IB) e il tampone per la respirazione (RB) utilizzati durante il processo di isolamento devono essere preparati in anticipo secondo le istruzioni elencate. Il CB può essere conservato fino a un mese a 4 °C, mentre l'IB e il RB possono essere conservati per 4 mesi a -80 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Analisi del rapporto di controllo respiratorio. L'isolamento mitocondriale per le analisi funzionali è stato condotto su un'ampia gamma di specie e fonti di tessuto in roditori maschi e femmine, nonché in cellule HEK293. La dimensione del campione di ciascun sesso, fonte tissutale e specie è dettagliata insieme ai valori medi di RCR e 1-1/RCR ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%202.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Modulazioni raccomandate al protocollo di isolamento mitocondriale per tessuti diversi per aumentare la resa proteica. Le variazioni delle quantità di proteasi e delle centrifugazioni vengono visualizzate in base alla fonte tissutale. Le quantità medie di proteine totali (mg) sono state calcolate dai risultati del saggio delle proteine BSA e dal volume di risospensione del pellet mitocondriale finale. I valori sono riportati come media ± SD. Le istruzioni in grassetto incluse nella colonna di centrifugazione consigliano se scartare, conservare o raggruppare il surnatante. Lo scarto si riferisce allo smaltimento del surnatante in un contenitore di rifiuti biologici, mentre la ritenzione e il pooling si riferiscono rispettivamente al trasferimento del surnatante nella provetta di centrifugazione successiva o alla raccolta per la centrifuga finale. Ulteriori dettagli sulle modifiche al protocollo sono disponibili nella sezione di discussione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%203.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori 

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